细胞因子IL－24真核表达载体的构建及应用.pdf

本发明公开了一种细胞因子IL－24真核表达载体的构建及应用，其步骤是：首先是目的基因的扩增与纯化，设计上引物和下引物，以质粒TRAPIL－24为模板，采用人IL－24 N端编码的第2个氨基酸开始进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化；其次是重组质粒pEGFP－C1－IL－24构建与鉴定，将纯化的PCR产物和载体pEGFP－C1用Bgl II和Sal I双酶切后，分别用试剂盒回收纯化酶切产物，连接片段，筛选培养，克隆，鉴定，测序。本发明包括证实重组细胞因子IL－24在治疗肝癌、小肠癌、黑色素瘤中的应用。本发明方法简便，操作方便，能抑制、预防和治疗肿瘤的生长。

权利要求书
1、  一种细胞因子IL-24真核表达载体的构建方法，它包括下列步骤：
A、目的基因的扩增与纯化，根据人IL-24 GeneBank序列设计引物，上游引物：5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位点；下游引物：5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有Sal I酶切位点，以插入人IL-24完整编码区基因的质粒TRAPIL-24为模板，采用上述引物从人IL-24 N端编码的第2个氨基酸开始进行PCR扩增，扩增的反应条件为：95℃预变性2分钟，以95℃变性36钞，56℃退火36钞，72℃延伸1分钟24钞，扩增25个循环，再以72℃延伸5分钟，PCR扩增产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化；
B、重组质粒pEGFP-C1-IL-24构建与鉴定，将纯化的PCR产物和载体pEGFP-C1用Bgl II和Sal I双酶切后，分别用试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24片段至pEGFP-C1，将连接产物转化入DH5α感受态细菌中，在LB培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BglII和Sal I双位点单、双酶切鉴定，测序。

2、  包括权利要求1所述的一种细胞因子IL-24真核表达载体pEGFP-C1-IL-24。

3、  一种细胞因子IL-24真核表达载体pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗肝癌中的应用。

4、  一种细胞因子IL-24真核表达载体pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗小肠癌中的应用。

5、  一种细胞因子IL-24真核表达载体pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗黑色素瘤中的应用。

说明书细胞因子IL-24真核表达载体的构建及应用
                          技术领域
本发明属于分子免疫学和肿瘤免疫学领域，更具体涉及细胞因子IL-24真核表达载体的构建方法，同时还涉及其表达的重组细胞因子IL-24在治疗肝癌、小肠癌、黑色素瘤中的用途。
                          背景技术
白细胞介素24(Interleukin-24，IL-24)是2002年刚发现和确定的一种新的细胞因子(Caudell EG，Mumm JB，Poindexter N，Ekmekcioglu S，MhashilarAM，Yang XH，Retter MW，Hill P，Chada S，Grimm EA.The protein productof the tumor suppressor gene，melanoma differentiation-associated gene7，exhibits immunostimulatory activity and is designated IL-24.J Immunol.2002，168(12)：6041-6；章晓联，汪付兵，新型细胞因子IL-24及其前景，细胞及分子免疫学杂志2003，19(5)，S20-S22.)。IL-24属于IL-10细胞因子家族(Wolk K，Kunz S，Asadullah K，Sabat R.Cutting edge：immune cells as souces andtargets of the IL-10 family members J Immunol.2002，168(11)：5397-402.)。人的IL-24原先被命名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanomadifferentiation-associated gene-7，mda-7)(Caudell EG，Mumm JB，Poindexter N，Ekmekcioglu S，Mhashilar AM，Yang XH，Retter MW，Hill P，Chada S，Grimm EA.The protein product of the tumor suppressor gene，melanoma differentiation-associated gene 7，exhibits immunostimulatoryactivity and is designated IL-24.J Immunol.2002，168(12)：6041-6.)。构建的Mda-7腺病毒缺陷病毒表达载体转染至多种肿瘤细胞，可抑制肿瘤的生长，促进凋亡(Mhashilkar AM，Schrock RD，Hindi M，Liao J，Sieger K，Kourouma F，Zou-Yang XH，Onishi E，Takh O，et al.Melanoma differentiationassociated gene-7(mda-7)：a novel anti-tumor gene for cancer gene therapy.2001，7(4)：271-82；Sarkar D，Su ZZ，Lebedeva IV，Sauane M，Gopalkrishnan RV，Valerie K，Dent P，and Fisher PB.mda-7(IL-24)mediatesselective apoptosis in human melanoma cells by inducing the coordinatedoverexpression of the GADD family of genes by means of p38 MAPK.Proc NatlAcad Sci U S A.2002，99(15)：10054-9)，如可导致和诱导黑色素瘤(Huang EY，Madireddi MT，Gopalkrishnan RV，et al.Genomic structure，chromosomallocalization and expression profile of a novel melanoma differentiationassociated(mda-7)gene with cancer specific growth suppressing andapoptosis inducing properties.Oncogene 2001，20：7051-63)，乳腺癌(SuZZ，Madireddi MT，Lin JJ，Young CS，Kitada S，Reed JC，Goldstein NI，FisherPB.The cancer growth suppressor gene mda-7 selectively induces apoptosisin human breast cancer cells and inhibits tumor growth in nude mice.ProcNatl Acad Sci U S A.1998，95(24)：14400-5)，肺癌(Saeki T，MhashilkarA，Swanson X，Zou-Yang XH，Sieger K，Kawabe S，Branch CD，Zumstein L，MeynRE，Roth JA，Chada S and Ramesh R.Inhibition of human lung cancer growthfollowing adenovirus-mediated mda-7 gene expression in vivo.Oncogene.2002，21(29)：4558-66)和非小细胞肺癌细胞(Saeki T，Mhashilkar A，ChadaS，Branch C，Roth JA，Ramesh R.Tumor-supressive effects byadenovirus-mediated mda-7 gene transfer in non-small cell lung cancercell in vitro.Gene Ther.2000，7(23)：2051-7.)，宫颈癌细胞，神经多形胶质细胞瘤，骨肉瘤，肠癌，鼻咽癌，前列腺癌和胰腺癌(Su ZZ，Madireddi MT，LinJJ，Young CS，Kitada S，Reed JC，Goldstein NI，Fisher PB.The cancer growthsuppressor gene mda-7 selectively induces apoptosis in human breastcancer cells and inhibits tumor growth in nude mice.Proc Natl Acad SciUSA.1998，95(24)：14400-5)等多达50种肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的生长。但是IL-24对肝癌、小肠癌治疗作用的研究还未见报道。由于mda是一种小分子量糖蛋白，其结构的相似性，序列的同源性以及具有细胞因子样特征，可以以自分泌和旁分泌方式发挥作用，因而最近Mda-7被HUGOG Gene NomenclatureCommittee同意命名为一种新的细胞因子，为IL-24，重组的IL-24可作为一种新的有希望的特异性的抗癌症新药，已成为国际上抗肿瘤领域中基因治疗研究的热点。
1.IL-24的发现，基因和分子结构
人的IL-24，即mda-7，最先于1995年从人的黑色素瘤H0-1细胞中分离得到克隆。mda-7在正常的黑色素细胞中以及黑色瘤早期阶段均有表达，但在黑色素瘤晚期阶段以及转移灶中的黑色素瘤细胞中却难以检测到其表达。给予黑色素瘤细胞IFNβ+MEZ(一种PKC诱导剂)(Jiang H，Su Z-Z，Boyd J，Fisher PB.Gene expression changes associated with reversible growth suppression andthe induction of ter分钟al differentiation in human melanoma cells.MolCell Differ 1993，1：41-66)联合治疗，其结果：抑制了癌细胞的生长并诱导和增强了mda-7表达。mda-7在组织和细胞中的表达有一定的局限性，Northernblotting分析表明：mda-7在人的免疫系统正常组织和细胞(包括脾脏、胸腺、外周血细胞)及正常的黑色素细胞可以表达。通过对大量的正常细胞和癌细胞分析可知，mda-7不是组成性表达，而是诱导性表达(正常的黑色素细胞和结肠癌细胞例外，为组成性表达)，激活的NK细胞和T细胞、在LPS、PHA和IL-4刺激作用下的外周血细胞都有表达。大鼠的巨噬细胞、单核细胞在LPS/IL-4和流感病毒A/DR/8作用下亦可表达mda-7。
编码IL-24/mda-7的基因座位于1q32+2，200kb大小，IL-10、IL-19、IL-20三个基因座亦位于这个区域(Dumoutier L，Leemans C，Lejeune D，Kotentko SV，Renauld JC，Cutting edge：STAT activation by IL-19，IL-20 and mda-7through IL-20 receptor complexes of two types.J Immunol 2001，167：3545-9)。IL-19、IL-20、IL-24基因序列是一致的头尾方向，而IL-10却反向，朝向端粒。编码IL-24/mda-7的基因结构组成如下：七个外显子，六个内含子。转录调控区位于5`端的启动子区域内，3`端富含AU，带有polyA信号肽。这些外显子和内含子在进化上有一定程度的保守性。IL-24/mda-7启动子区域从人胎盘基因文库中已被分离并鉴定，有报道称，AP-1、C/EBP转录因子有助于mda-7启动子激活并可显著增强mda-7在黑色素瘤分化中的表达。IL-24/mda-7的mRNA约2kb，其表达的蛋白23.8KD，由206个氨基酸组成。通过Prosite数据库对其多肽分析结果如下：N-糖基化位点位于85、99、126，6个磷酸化位点分别在101、111、161、88、133和161，IL-10信号启动区在101，49个氨基酸的信号肽及其粘着位点在49、50。该信号肽在蛋白分泌及与相应受体结合激活信号信道中起作用。
2.IL-24的受体和信号转导
IL-24等IL-10细胞因子家族，它们的受体属于II型细胞因子受体家族。该家族受体结构可分为胞外域、跨膜域和胞内域。它们的胞外域同源性低，胞内域、跨膜域无明显同源性，但胞外域有保守氨基酸残基存在。IL-24/mda-7的受体为异源二聚体，由R1/R2两个亚单位组成，它们分别为IL-20R2/IL-20R1及IL-20R2/IL-22R1(Schaefer G，Venkataraman C，Schindler U.Cutting edge：FISP(IL-4-induced secreted protein)，a novel cytokine-like moleculesecreted by Th2 cells.J Immunol 2001，166：5859-63)。IL-24/mda-7与IL-20、IL-19共用这两个受体复合物。Northern blotting分析表明：IL-22R2在正常的肝脏、肾脏、肠、胰腺组织中有较高表达，在肾上腺、肺、子宫组织中表达低下。几个实体瘤组成性表达IL-22R1mRNA，包括结肠直肠腺癌SW480、肺癌A549、黑色素瘤G361、肝细胞癌HEPG2、肾癌Cuki-1和TK-10细胞系、HaCaT胶质细胞系。RT-PCR分析可知：IL-20R1在皮肤、睾丸、心脏、胎盘、唾液腺、前列腺中有较高表达，而在脑、肺、胃、胰腺、卵巢、子宫、甲状腺、肾上腺中等量表达，在肾脏、肝脏、结肠、肌肉、小肠几乎检测不到。IL-20R2在皮肤、睾丸高表达，在卵巢中等量表达，在心脏、肺、肌肉、胎盘、肾上腺低表达，在小肠、唾液腺、外周血白细胞几乎检测不到。编码IL-20R1的基因座位于6号染色体，IL-20R2位于3号染色体，IL-22R1位于1号染色体。它们的基因结构组成如下：7个外显子，6个内含子，exon 1编码5’-UTR和信号肽，胞外域由exon2、3、4、5和部分exon6编码，另外部分exon 6编码跨膜域和胞内域起始部分，exon7编码胞内域其余部分和3’-UTR。这些外显子和内含子具有一定的保守性。IL-24/mda-7与R1/R2两亚单位都结合后，激活Jack-stats信号转导通路。R1与Jakl作用，负责磷酸化胞内域有关位点，招募各种信号分子；R2亚单位胞内域较短，它与Tyk2作用。Stat3在Stat信号分子激活中占主导地位，stat1也可被IL-24/mda-7激活。
3.IL-24作用特点及生物活性
IL-24/mda-7与IL-10结构相似、氨基酸同源，生物效应却有显著区别。IL-10作为炎症因子，在抗感染中有重要作用。根据目前的研究，IL-24由于其选择性诱导细胞凋亡，在抗肿瘤方面有很好的应用前景(Mhashilkar AM，Schrock RD，Hindi M，Liao J，Sieger K，Kourouma F，Zou-Yang XH，Onishi E，Takh O，etal.Melanoma differentiation associated gene-7(mda-7)：a novelanti-tumor gene for cancer gene therapy.2001，7(4)：271-82)。IL-24作为细胞因子，它在免疫系统中的功能(Caudell EG，Mumm JB，Poindexter N，Ekmekcioglu S，Mhashilar AM，Yang XH，Retter MW，Hill P，Chada S，GrimmEA.The protein product of the tumor suppressor gene，melanomadifferentiation-associated gene 7，exhibits immunostimulatory activityand is designated IL-24.J Immunol.2002，168(12)：6041-6.)主要体现如下：外周血白细胞在LPS等刺激作用下，分泌产生mda-7；mda-7亦可以诱导外周血细胞分泌产生高水平的IL-6、TNF-2、IFN-γ以及低水平的IL-1β、IL-1、GM-CSF。IL-10可以抑制mda-7诱导外周血白细胞产生上述细胞因子，mda-7与IL-10具有一定对抗作用。
4.IL-24与抗肿瘤
肿瘤细胞的特点是分化不正常，“诱导分化”治疗可以使肿瘤细胞失去或降低增殖能力和潜在致癌性。给予晚期黑色素瘤细胞联合治疗。(IFN-β+MEZ)，其结果：抑制了癌细胞生长，诱导其终末分化，促进瘤细胞凋亡。通过消减交法，从黑色素瘤细胞中分离克隆出mda-7基因。以腺病毒为载体转导其它肿瘤细胞，过量表达的mda-7的“不可逆的抑制生长，诱导终末分化，促进凋亡”的生物功能同样得到体现。mda-7作为一个生长抑制基因，选择性抑制细胞生长的特点，使其成为抗肿瘤基因治疗领域的热点，为数不少的研究报道认为，mda-7将为基因抗癌带来新希望。
4.1 IL-24抗肿瘤特点
(1)剂量依赖性：IL-24抑制瘤细胞生长与其剂量呈正比例相关性。
(2)抗瘤谱广：过量表达的mda-7在较大范围内抑制肿瘤细胞生长，诱导其分化，包括如下肿瘤细胞：黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤。
(3)毒副作用小：mda-7抗肿瘤的显著特点是对亲本的正常细胞不产生影响，这个机制目前还不大清楚，研究者观察显示：mda-7仅有轻微的毒性，未给癌症患者带来很大不适。目前，Ad-mda-7已进入临床II期试验阶段。
(4)不依赖于P53或Rb：Ad-mda-7转染野生型P53、突变型P53、无P53的乳腺癌细胞均抑制瘤细胞生长，诱导其凋亡。Ad-mda-7转染突变型Rb及无Rb的前列腺癌Du-145细胞，得到上述同样结果。
4.2可能存在抗瘤机制
(1)PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)：Ad-mda-7可以诱导和激活dsRNA依赖的PKR(Pataer A，Vorburger SA，Barber GN，et al.Adenoviral transfer of the melanoma differentiation-associatedgene-7(mda-7)induces apoptosis of lung cancer cells via up-regulationof the double-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR).Cancer Res2002，62：2239-4)，PKR激活后导致下游靶分子包括eIF-2α，Tyk2、stat1、stat3和p38MAPK磷酸化，PKR上调Ad-mda-7诱导凋亡。若用2氨基嘌呤(丝氨酸/酪氨酸激酶抑制剂)抑制PKR激活或eIF-2α磷酸化，则Ad-mda-7的诱导凋亡也被抑制。若缺失PKR，则抵制Ad-mda-7诱导凋亡。这些结果说明激活的PKR和它下游地靶分子是Ad-mda-7诱导凋亡不可缺少的组成部分。
(2)GADD(growth arrest and DNA damage，生长阻断和DNA损伤)家族：GADDs是一组具有协同调控，结构不相关的基因，包括GADD34、GADD45α、GADD45β、GADD45γ、GADD153。这一组应激反应分子，可以被如下因素激活：紫外线照射、化学致癌剂、TNF-α、抗Fas-Ab等。GADDs可以诱导凋亡或抑制生长，单独效应同样存在，联合表达协同抗增殖。目前研究证实：Ad-mda-7转染黑色素瘤不同细胞系(非正常永生的FM516细胞)，GADDs的mRNA和蛋白均被上调表达。同样的现象在成胶质细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌亦存在。当用SB203580抑制了p38MAPK，GADDs基本水平表达不受影响，但明显的抑制了mda-7诱导凋亡。这表明mda-7是由p38MAPK通路诱导和激活GADDs，从而介导凋亡。
(3)凋亡通道：多种信号转导通路包括p38MAPK、PKR、Stat3等介导凋亡，但可能只有p38MAPK/PKR在mda-7介导凋亡中是必要的[4，13]，因为若封闭了它们，则抑制凋亡发生。mda-7诱导凋亡是由p38MAPK通路介导，同时上调dsRNA依赖的PKR并磷酸化其下游靶分子，p38MAPK/PKR是Ad-mda-7最常用的诱导凋亡方式。
将IL-24/MDA-7基因克隆到复制缺陷型腺病毒中构建表达载体Ad-mda7，能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，但腺病毒作为载体存在生物安全性的问题。并且IL-24对肝癌、小肠癌治疗作用的研究也未见报导。
                           发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞因子IL-24真核表达载体的构建方法，方法简便，操作方便。本发明构建了IL-24基因的真核表达载体pEGFP-C1-IL-24，GFP蛋白在各种真核细胞中都可被用作定位研究各种蛋白质的标记物。pEGFP-C1-IL-24的构建，为研究IL-24在细胞内的表达、定位、功能提供了直观便捷的工具。
本发明还涉及pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗肝癌中的应用。
本发明还涉及pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗小肠癌中的应用。
本发明还涉及pEGFP-C1-IL-24表达的重组细胞因子IL-24在治疗黑色素瘤中的应用。
  IL-24对肿瘤细胞具有特异性的生长和凋亡诱导作用，同时可刺激免疫系统发挥免疫调节作用。I1-24是目前发现的唯一一个细胞因子类的抑癌基因。  本发明的重组新型细胞因子IL-24对肿瘤细胞生长具有明显的抑制和调亡作用，可作为有潜力的治疗肝癌、小肠癌、黑色素瘤等肿瘤的新型抗癌生物药物。本发明为临床恶性肿瘤基因治疗的开展提供了较为可靠的实验依据与简便的治疗方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：
1目的基因的扩增与纯化
引物设计与合成：根据人IL-24 GeneBank序列(NM006850)设计引物，上游引物：5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有Bgl II酶切位点；下游引物：5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有Sal I酶切位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。以插入人IL-24完整编码区基因的质粒TRAPIL-24为模板，采用上述引物从人IL-24 N端编码的第2个氨基酸开始进行PCR扩增。扩增的反应条件为；95℃预变性2分钟，以95℃变性36钞，56℃退火36钞，72℃延伸1分钟24钞，扩增25个循环，再以72℃延伸5分钟。PCR扩增产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用Omega公司Gel Extraction Kit DNA试剂盒回收纯化，操作步骤如下：
(1)从琼脂糖凝胶中将DNA条带切下，捣碎装入Ep管中。加入1～2倍体积的Binding Buffer，55℃下温育7分钟使胶溶解。
(2)将Ep管中已溶解的胶溶液加入DNA Minicolumn中，每次加入750μl，10,000g离心1分钟。
(3)向DNAMinicolumn中加入700μl SPW Buffer，10,000g离心1分钟，离心完后将DNA Minicolumn再次10,000g离心1分钟抛干。
(4)将DNAMinicolumn套入Ep管中，加入10～20μl灭菌水，静置5分钟，10,000g离心1分钟，Ep管底溶液即为回收DNA。
2重组质粒pEGFP-C1-IL-24构建与鉴定
将纯化的PCR产物和载体pEGFP-C1用Bgl II和Sal I双酶切后，分别用Omega公司Gel Extraction Kit DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下定向连接IL-24片段至pEGFP-C1，将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，在LB(Kan+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，采用BglII和Sal I双位点单、双酶切鉴定。选取阳性克隆，送交上海华诺公司测序。测序结果与人IL-24 GeneBank序列(NM006850)完全一致。
3重组质粒在HIC细胞中的表达
提取重组质粒pEGFP-C1-IL-24及空载pEGFP-C1采用脂质体介导基因转移。HIC细胞用含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃ 50ml/L CO2条件下培养。采用灭菌的盖玻片铺在12孔板底部，接种HIC细胞。待HIC细胞生长至90％铺满培养板底部进行转染，分别用pEGFP-C1-IL-24、pEGFP-C1转染HIC细胞，具体方法按照Lipofectamine 2000试剂操作说明进行。转染质粒48小时后，取出盖玻片，依次用PBS冲洗2次，40g/L多聚甲醛固定30分钟及500ml/L甘油缓冲液封片后，用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM，德国Leika公司)观察阳性细胞并计算表达绿色荧光细胞的阳性率。
4IL-24基因转染的肿瘤细胞体外增殖能力的测定
IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力的测定：实验分为三组，包括HIC细胞组、空载pEGFP-C1转染的HIC细胞组(HIC/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24转染的HIC细胞组(HIC/pEGFP-C1-IL-24)。
IL-24基因转染的HepG2细胞体外增殖能力的测定：实验分为三组，包括HepG2细胞组、空载pEGFP-C1转染的HepG2细胞组(HepG2/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24转染的HepG2细胞组(HepG2/pEGFP-C1-IL-24)。
将细胞以2×105/ml浓度悬于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养基中，向96孔细胞培养板中每孔加入200μl，置于37℃ 50ml/L CO2条件下培养2天后，用MTT检测其增殖能力，结果用A值表示。
5肿瘤细胞的凋亡与周期分析
接种HIC于6孔培养板，待HIC细胞生长至90％铺满培养板底时分别用pEGFP-C1-IL-24，pEGFP-C1转染HIC细胞，并设置HIC细胞对照。转染48小时后分别收集3组细胞，应用美国BECKMAN COULTER公司的DNA-Prep Reagen Kit试剂及其流式细胞仪作细胞凋亡与细胞周期分析。
6小鼠荷瘤实验
将BALB/C小鼠随机分为3组(每组6只)，分别于右侧背部皮下注射1×106/100μl的小鼠黑色素瘤B16细胞，转染了空载pEGFP-C1的B16细胞及转染了pEGFP-C1-IL-24的B16细胞。观察小鼠皮下肿瘤形成率及其大小(用肿瘤结节垂直方向的直径平均值表示)。每2天用游标卡尺测量一次。
7瘤体直接注射IL-24基因治疗皮下荷瘤小鼠
将B16细胞接种于BALB/C小鼠右侧背部皮下，接种量为1×106/100μl。小鼠随机分为三组，每组6只。接种10天后，分别在瘤体内注射0.2ml脂质体包裹的pEGFP-C1-IL-24(10μg)、pEGFP-C1(10μg)、PBS。观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，每2天测量一次肿瘤大小。
发明的优点和效果
本发明提供了一种能对肿瘤细胞生长抑制的新型细胞因子IL24的构建和表达。并用IL-24基因在细胞及整体水平上抑制、预防和治疗肿瘤的生长。
本发明构建了IL-24基因的真核表达载体pEGFP-C1-IL-24，GFP由238个氨基酸组成，在各种真核细胞中都可被用作定位研究各种蛋白质的标记物。pEGFP-C1-IL-24的构建，为研究IL-24在细胞内的表达、定位、功能提供了直观便捷的工具。
肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，单一因素的介入往往不能达到理想的抑瘤效果。因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是肿瘤治疗研究的热点。目前临床肿瘤治疗主要采用三大常规疗法，但在实施过程中，或由于切除的不彻底，或由于严重的毒副作用不能够进一步加大剂量而使残存瘤细胞得以逃逸，从而使肿瘤的治疗被复发所困扰。因此如何消除残存肿瘤细胞是肿瘤治疗中防止复发的关键。IL-24基因治疗可作为一种辅助治疗方法，与手术切除、放疗、化疗联合应用，防止肿瘤复发。IL-24对肿瘤细胞具有特异性的生长和凋亡诱导作用，同时可刺激免疫系统发挥免疫调节作用。I1-24是目前发现的唯一一个细胞因子类的抑癌基因。本发明的重组新型细胞因子IL-24对肿瘤细胞生长具有明显的抑制和调亡作用，可作为有潜力的治疗肝癌、小肠癌、黑色素瘤等肿瘤的新型抗癌生物药物。本发明中，pEGFP-C1-IL-24经脂质体转染HIC细胞后，经LSCM检测其表达率为28％。体外研究显示，转染pEGFP-C1-IL-24的HIC细胞生长速度明显低于对照HIC细胞，且G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。说明IL-24基因对HIC细胞的生长具有抑制作用。FCM的检测结果还显示IL-24基因的转入可诱导HIC细胞的调亡。动物实验中接种转染pEGFP-C1-IL-24的B16细胞的小鼠与接种对照B16细胞的小鼠相比，前者的致瘤率明显低于后者，肿瘤皮下结节生长速度明显慢于后者，说明B16细胞转入IL-24基因可以减低肿瘤在活体内的侵袭能力，降低其生长速度。瘤体内注射脂质体包裹的IL-24基因后，可将IL-24基因在肿瘤部位直接转染至肿瘤细胞内并有效表达，从而抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，注射一次已显示出较有效的治疗效果。本发明为临床恶性肿瘤基因治疗的开展提供了较为可靠的实验依据与简便的治疗方法。
                          附图说明
图1.人IL-24真核细胞重组表达载体的构建
图2.人IL-24真核细胞重组表达载体的鉴定
将重组质粒pEGFP-C1-IL-24分别用BglII、Sal I进行单酶切及双酶切，pEGFP-C1大小4.7Kb，扩增产物IL-24大小为0.6Kb，线状重组质粒pEGFP-C1-IL-24大小为5.3Kb，说明重组质粒大小正确。pEGFP-C1-IL-24经BglII、Sal I双酶切后，分成4.7Kb和0.6Kb两个片段，与预期值相符，表明目的基因已正确插入pEGFP-C1载体中.。阳性克隆测序结果与GeneBank序列完全一致。
Note：1：DNA marker；2：IL-24 PCR product；3：pEGFP-C1/Bgl II；
4：pEGFP-C1-IL-24/Bgl II+Sal I；5：pEGFP-C1-IL-24/Bgl II；
6：pEGFP-C1-IL-24/Sal I
图3.重组质粒在HIC细胞中的表达鉴定。
提取重组质粒pEGFP-C1-IL-24转染HIC细胞，应用LSCM观察，在HIC细胞中，可见特异性EGFP。计数阳性细胞，表达率分别为28％。具体方法按照Lipofectamine 2000试剂操作说明进行。图左边为用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM，德国Leika公司)观察发绿色荧光的阳性细胞。右边为无激光扫描时对照图片。
图4.重组IL-24对人小肠癌细胞HIC的增殖抑制作用
图4显示HIC细胞转染IL-24基因后，肿瘤细胞的体外增殖与对照HIC相比受到明显抑制(P＜0.05)
图5.重组IL-24对人肝癌细胞HepG2.的增殖抑制作用
图5显示HepG2细胞转染IL-24基因后，肿瘤细胞的体外增殖与对照HepG2相比受到明显抑制(P＜0.05)
图6.IL-24对HIC细胞周期分布的影响
流式细胞仪的检测结果显示，转染pEGFP-C1-IL-24的HIC细胞与对照HIC细胞相比，G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24基因的HIC细胞调亡细胞百分率为7.4％。
注：A：HIC；B：HIC/pEGFP-C1；C：HIC/pEGFP-C1-IL-24
图7.接种肿瘤细胞后荷瘤B16小鼠皮下肿瘤结节生长曲线
本发明观察了小鼠接种1×106肿瘤细胞后皮下肿瘤结节的出现时间、大小变化。从图7可以看出，接种转染IL-24基因的HIC小鼠皮下结节生长速度明显慢于接种HIC小鼠，表明IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。
图8.基因治疗后肿瘤生长曲线
BALB/C小鼠背部皮下接种B16细胞后6～8d均长出肿瘤。瘤体内注射脂质体包裹的IL-24基因后，荷瘤小鼠的生长明显受抑制，因此瘤体内注射脂质体包裹的IL-24基因对早期荷瘤小鼠的生长具有较明显的抑制作用。
                       具体实施方式
1.人IL-24真核细胞重组表达载体的构建方法
1.1目的基因的扩增与纯化
引物设计与合成：根据人IL-24 GeneBank序列(NM006850)设计引物，上游引物：5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位点；下游引物：5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有Sal I酶切位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。以插入人IL-24完整编码区基因的质粒TRAPIL-24为模板，采用上述引物从人IL-24N端编码的第2个氨基酸开始进行PCR扩增。扩增的反应条件为；95℃预变性2分钟，以95℃变性36s，56℃退火36s，72℃延伸1分钟24s，扩增25个循环，再以72℃延伸5分钟。PCR扩增产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA回收试剂盒回收纯化。
1.2重组质粒pEGFP-C1-IL-24构建与鉴定(见图1、图2所示)
将纯化的PCR产物和载体pEGFP-C1用BglII和Sal I双酶切后，分别回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下定向连接IL-24片段至pEGFP-C1，将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，在LB(Kan+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒。将重组质粒pEGFP-C1-IL-24分别用BglII、Sal I进行单酶切及双酶切，pEGFP-C1大小4.7Kb，扩增产物IL-24大小为0.6Kb，线状重组质粒pEGFP-C1-IL-24大小为5.3Kb，说明重组质粒大小正确。pEGFP-C1-IL-24经BglII、Sal I双酶切后，分成4.7Kb和0.6Kb两个片段，与预期值相符，表明目的基因已正确插入pEGFP-C1载体中.。选取阳性克隆，送交上海华诺公司测序。测序结果与人IL-24 GeneBank序列(NM006850)完全一致，翻译为蛋白质其相应氨基酸序列(GeneBank NM006850)为：
NFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQE
FHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAE
SCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENE
MFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL
2.抗肿瘤细胞增殖应用
2.1重组质粒在HIC细胞中的表达(见图3所示)
提取重组质粒pEGFP-C1-IL-24及空载pEGFP-C1采用脂质体介导基因转移。HIC细胞用含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃ 50ml/L CO2条件下培养。采用灭菌的盖玻片铺在12孔板底部，接种HIC细胞。待HIC细胞生长至90％铺满培养板底部进行转染，分别用pEGFP-C1-IL-24、pEGFP-C1转染HIC细胞，具体方法按照Lipofectamine 2000试剂操作说明进行。转染质粒48小时后，取出盖玻片，依次用PBS冲洗2次，40g/L多聚甲醛固定30分钟及500ml/L甘油缓冲液封片后，用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM，德国Leika公司)观察阳性细胞并计算表达绿色荧光细胞的阳性率。在HIC细胞中，均可见特异性EGFP。计数阳性细胞，表达率分别为28％、30％。
2.2 IL-24基因转染的肿瘤细胞体外增殖能力的测定(见图4、图5所示)
IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力的测定：实验分为三组，包括HIC细胞组、空载pEGFP-C1转染的HIC细胞组(HIC/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24转染的HIC细胞组(HIC/pEGFP-C1-IL-24)。
IL-24基因转染的HepG2细胞体外增殖能力的测定：实验分为三组，包括HepG2细胞组、空载pEGFP-C1转染的HepG2细胞组(HepG2/pEGFP-C1)、pEGFP-C1-IL-24转染的HepG2细胞组(HepG2/pEGFP-C1-IL-24)。
将细胞以2×105/ml浓度悬于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养基中，向96孔细胞培养板中每孔加入200μl，置于37℃ 50ml/L CO2条件下培养2天后，用MTT检测其增殖能力，结果用A值表示。HIC、HepG2细胞转染IL-24基因后，肿瘤细胞的体外增殖与对照细胞相比均受到明显抑制(P＜0.05)。
2.3.肿瘤细胞的凋亡与周期分析(见图6所示)
接种HIC于6孔培养板，待HIC细胞生长至90％铺满培养板底时分别用pEGFP-C1-IL-24，pEGFP-C1转染HIC细胞，并设置HIC细胞对照。转染48小时后分别收集3组细胞，应用美国BECKMAN COULTER公司的DNA-Prep Reagen Kit试剂及其流式细胞仪作细胞凋亡与细胞周期分析。流式细胞仪的检测结果显示，转染pEGFP-C1-IL-24的HIC细胞与对照HIC细胞相比，其G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24基因的HIC细胞调亡细胞百分率为7.4％。
2.4.小鼠荷瘤实验(见图7所示)
将BALB/C小鼠随机分为3组(每组6只)，分别于右侧背部皮下注射1×106/100μl的小鼠黑色素瘤B16细胞，转染了空载pEGFP-C1的B16细胞及转染了pEGFP-C1-IL-24的B16细胞。观察小鼠皮下肿瘤形成率及其大小(用肿瘤结节垂直方向的直径平均值表示)。每2天用游标卡尺测量一次。我们观察了小鼠接种1×106肿瘤细胞后皮下肿瘤结节的出现时间、大小变化。从表一可以看出，转染IL-24的B16细胞与B16细胞相比致瘤率明显降低。从图7可以看出，接种转染IL-24基因的HIC小鼠皮下结节生长速度明显慢于接种HIC小鼠，表明IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。
         表1  小鼠接种肿瘤细胞B16后皮下肿瘤结节阳性率
Groups                          Mice with detectable tumor(％)
Only B16                        100
pEGFP-C1                        83.3
pEGFP-C1-IL-24                  50
2.5.瘤体直接注射IL-24基因治疗皮下荷瘤小鼠(见图8所示)
将B16细胞接种于BALB/C小鼠右侧背部皮下，接种量为1×106/100μl。小鼠随机分为三组，每组6只。接种10天后，分别在瘤体内注射0.2ml脂质体包裹的pEGFP-C1-IL-24(10μg)、pEGFP-C1(10μg)、PBS。观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，每2天测量一次肿瘤大小。BALB/C小鼠背部皮下接种B16细胞后6～8d均长出肿瘤。瘤体内注射脂质体包裹的IL-24基因后，与注射空载DNA相比，仅一次注射IL-24基因荷瘤小鼠的生长就明显受抑制(表2、图8)，因此瘤体内注射脂质体包裹的IL-24基因对早期荷瘤小鼠的生长具有较明显的抑制作用。
                            表2瘤体注射基因治疗后肿瘤的大小
         Table2 Average diameter of tumor size after injection of IL-24
                           基因治疗后肿瘤大小(X±s)mm
组别
                     2d           4d            8d           12d          16d            20d
PBS              6.60±0.86   8.10±0.44   11.20±0.61   14.50±0.32   17.20±0.67   19.00±0.89
pEGFP-C1         6.70±0.35   8.20±0.58   11.40±2.11   15.00±2.29   17.60±2.48   19.40±2.69
pEGFP-C1-IL-24   6.20±0.61   6.30±0.52   5.60±0.58    6.10±1.35    7.20±2.02    8.20±2.16
注：pEGFP-C1-IL-24组与PBS组肿瘤大小比较，2d后无显著性差异(P＞0.05)，4d、8d、12d、16d、20d后均有显著性差异(P＜0.05)。