硫酸酯化PEG脂质衍生物及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及硫酸(磺酸)酯化PEG脂质衍生物的制备及其在药物递送系统中的应用，是一种新型辅料聚乙二醇单甲醚胆固醇硫酸酯衍生物在医药技术领域的应用。硫酸(磺酸)酯化PEG脂质衍生物主要指“硫酸(磺酸)酯化PEG胆固醇”、“硫酸(磺酸)酯化PEG谷固醇”、“硫酸(磺酸)酯化PEG生育酚”、“硫酸(磺酸)酯化PEG维生素D”、“硫酸(磺酸)酯化PEG磷脂”或“硫酸(磺酸)酯化PEG－DSPE”。药物递送系统包括胶束、纳米胶束、乳剂、微乳、纳米乳、脂质体、纳米粒，将PEG硫酸(磺酸)酯化与胆固醇连接制备衍生物，既可以保护药物，降低降解，延长体内循环时间，也可以实现与HIV表面的gp120特异性结合，实现靶向递药的目的。

权利要求书
1、  硫酸酯化PEG脂质衍生物，其特征在于：其为硫酸酯化PEG胆固醇，其结构式如下：

n＝5～500(PEG分子量为300～30000)，R为SO2OH，SO2H，及其盐类。

2、  根据权利要求1所述的硫酸酯化PEG脂质衍生物，其特征在于：硫酸酯化PEG脂质衍生物还包括硫酸酯化PEG谷固醇，硫酸酯化PEG生育酚，硫酸酯化PEG维生素D，硫酸酯化PEG磷脂或硫酸酯化PEG-DSPE。

3、  硫酸酯化PEG脂质衍生物在制备药物递送系统中的应用。

4、  根据权利要求3所述的硫酸酯化PEG脂质衍生物在制备药物递送系统中的应用，其特征在于：所述的递送系统包括胶束、纳米胶束、乳剂、微乳、纳米乳、脂质体、纳米粒。

5、  根据权利要求3所述的硫酸酯化PEG脂质衍生物在制备药物递送系统中的应用，其特征在于：硫酸酯化PEG脂质衍生物可以与HIV的gp120结合位点结合，实现HIV靶向递药。

6、  一种如权利要求1所述的硫酸酯化PEG脂质衍生物的制备方法，其特征在于：用氯磺酸-吡啶法制备过程如下，将吡啶加入到三颈瓶中，冰浴下，滴加氯磺酸，5℃下搅拌反应30分钟后，加入胆固醇、末端含有羟基聚乙二醇2000，60℃搅拌反应1小时，倾入到冰水中，搅拌30分钟析出沉淀，过滤，水洗至pH值中性，干燥得白色固体，IR(KBr)(cm-1)：1287，1172，851(ROSO3H)。

7、  根据权利要求6所述的硫酸酯化PEG脂质衍生物的制备方法，其特征在于：氯磺酸-吡啶法可以用浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、三氧化硫-二甲基甲酰胺法替代。

说明书硫酸酯化PEG脂质衍生物及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及硫酸酯化PEG脂质衍生物及其制备方法和在药物递送系统中的应用，更具体地是涉及一种新型辅料聚乙二醇单甲醚胆固醇硫酸酯衍生物在医药技术领域的应用。
背景技术：
一般而言，药物递送系统，如乳剂、微乳、纳米乳、脂质体、纳米粒等在血液中均会遭受多种因素，主要是调理素(opsonin)的破坏作用，大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统(MPS)丰富的部位，为了减少MPS的摄取量，延长循环时间，出现了PEG化载体。目前较为常见的PEG脂质衍生物是PEG-DSPE，其中PEG2000-DSPE(PEG2000-磷脂酰乙醇胺)已经成为药用辅料，用于阿霉素脂质体DOXI L中。由于所采用的PEG是单甲醚，在体内存在代谢/产生相对应的抗体，从而加速载体的清除的问题。
艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(Acquired ImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，其病原为艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒，HumanImmunodeficiency Virus，HIV)。艾滋病病毒能破坏人的免疫系统，使人体丧失抵抗各种疾病的能力。艾滋病自发现至今在全球肆虐，成为危害人类最凶险的传染病之一。据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织(UNAIDS/WHO)在2004年全球艾滋病流行形势报告中称，截止2004年底现存活的HIV感染人数达3940万，在2004年新感染的人数为490万，死亡人数达310万。
Haseltine等研究表明HIV感染的细胞表面同样表达gp120，会与未感染的CD4+细胞表面CD4受体结合，诱导合胞体的形成，造成艾滋病患者T4淋巴细胞的耗竭。因而DS一方面可以竞争性地封锁了病毒感染细胞；另一方面可以抑制已感染的细胞与正常细胞形成合胞体。(Haseltine WA.Replication and pathogenesis of the AIDS virus.J AIDS 1988；1：217-240.)
另外，有文章指出大量研究表明DS等硫酸酯化多糖能抑制HIV的细胞病变，防止HIV诱导的合胞体(巨细胞)形成，有效阻断HIV在培养细胞中的复制，并与AZT等抗病毒药物有协同作用[Nakashima H，Kido Y，Kobayashi N，et al.Antiretroviral activity in a marine red alga：reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract ofSchizymenia pacifica.J Cancer Res Clin Oncol 1987；113：413-416.Baba M，Pauwels R，Balzarini J，et al.mechanism of inhibitory effectof dextran sulfate and heparin on replication of humanimmunodeficiency virus in vitro.Proc Natl Acad Sci USA 1988；85：6132-6136.Baba M，Schols D，Pauwels R，et al.Sulfatedpolysaccharides as potent inhibitors of HIV-induced syncytiumformation：a new strategy towards AIDS chemotherapy.J AIDS 1990；3：493-499.Mitsuya H，Looney DJ，kuno S，et al.Dextran sulfatesuppression of virus es in the HIV family：inhibition of virionbinding to CD4+cells.Science 1988；240：646-649.Piret J，Lamontagne J，Bestman Smith J，et al.In vitro and in vivo evalutionsof sodium lauryl sulfate and dextran sulfate as microbicides againstherpes simplex and human immunodeficiency viruses.J Clin Microbiol2000；38：110-119.]。其作用机理是带负电荷的硫酸酯化基团，能够与HIV外膜蛋白gp120上一个重要功能区——V3环(带正电荷)结合。利用HIV中和抗体已证明V3环的重要功能，并将其称为主要中和决定簇(PND)。诱变与抗体竞争实验证明，缺失V3环的gp120能与CD4正常结合，但不能结合CCR5/CXCR4，无法与细胞融合。
发明内容：
基于上述基础，我们设计并合成了硫酸(磺酸)酯化PEG脂质衍生物的制备及其在药物递送系统中的应用。所说的脂质衍生物包括“硫酸(磺酸)酯化PEG胆固醇”、“硫酸(磺酸)酯化PEG谷固醇”、“硫酸(磺酸)酯化PEG生育酚”、“硫酸(磺酸)酯化PEG维生素D”、“硫酸(磺酸)酯化PEG磷脂”或“硫酸(磺酸)酯化PEG-DSPE”。其中“硫酸(磺酸)酯化PEG胆固醇”具有如下的结构式：

本发明的优点：PEG在体内的代谢途径是硫酸(磺酸)酯化，将PEG硫酸(磺酸)酯化与胆固醇连接制备衍生物，既可以保护药物，降低降解，延长体内循环时间，也可以实现与HIV表面的gp120特异性结合，实现靶向递药的目的。此类尚未见报道。初步试验结果说明，以所合成的衍生物对载药脂质体进行修饰，体外抑制HIV活性得到显著提高，主要原因是PEG硫酸酯胆固醇分子中的硫酸酯基团与HIV外膜蛋白gp120的带正电荷的V3环结合，特异性结合游离HIV，抑制病毒对敏感细胞的吸附，阻止病毒进入细胞，同时将药物靶向递送至HIV感染细胞，抑制感染细胞内的HIV增殖。硫酸酯化PEG脂质衍生物可以与HIV的gp120结合位点结合，实现HIV靶向递药。
具体实施方式：
下面结合实施例(以齐多夫定(AZT)的脂前药齐多夫定棕榈酸酯(AZTP)为模型药物)对本发明做进一步详细的描述，但方法不仅局限于所给出的实施例。
附注：HPLC色谱条件
色谱柱：Betasil C18柱(200mm×4.6mm 5μm，Diamonsil，Dikma，USA)；
保护柱：Fusion-RP(4×3.0mm，AJO-7557，Phenomenex，USA)；
流动相：甲醇/水(35∶65)；
流速：1.0mL□min-1；
柱温：40℃；
检测波长：266nm；
进样量：20μL。
实施例1：胆固醇聚乙二醇硫酸酯的制备
制备式I化合物的方法，这些方法有：浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-二甲基甲酰胺法等。
氯磺酸法：
将2mL吡啶加入到2 5mL三颈瓶中，冰浴下，滴加0.2mL氯磺酸，5℃下搅拌反应30分钟后，加入0.2g胆固醇聚乙二醇2000(PEG末端含有羟基)，60℃搅拌反应1小时，倾入到冰水中，搅拌30分钟析出沉淀，过滤，水洗至pH值中性，干燥得白色固体0.23克。IR(KBr)(cm-1)：1287，1172，851(ROSO3H)。
同法可以制备分子量分别为300或30000的PEG硫酸酯胆固醇衍生物及其盐。
实施例2：增加AZTP在大鼠血浆中的降解稳定性
按照常规方法，以AZTP/SPC 4/VE(1∶10∶0.1)的比例制备脂质体；以AZTP/SPC 4/VE/化合物I(1∶10∶0.1∶0.1)的比例制备包衣脂质体。同样，按照常规方法制备亚微乳剂和包衣亚微乳剂。
将齐多夫定(AZT)溶液及脂前药齐多夫定棕榈酸酯(AZTP)的不同脂质体组(普通脂质体、聚乙二醇醇硫酸酯胆固包衣脂质体)、不同亚微乳组(普通亚微乳、聚乙二醇硫酸酯胆固醇包衣亚微乳)分别置于10％大鼠血浆中，37℃孵育，于不同时间点取样，测定血浆中齐多夫定的浓度，溶液组、普通脂质体组、包衣脂质体组的t1/2分别溶液组的18倍和171倍，普通亚微乳组、包衣亚微乳组的t1/2分别为溶液组的8倍和120倍，具体数值见附表1。结果表明：药物受到包衣材料的保护，在血浆中稳定性大大提高，这不仅延长了药物的体内滞留时间，增加了寻靶机会，而且可以达到延长半衰期、缓释长效的目的。
附表1.AZT溶液和AZTP各脂质体组在小鼠血浆中的降解的表观一级动力学速率常数及半衰期
实验组  AZT溶  液组  AZTP  脂质体组  AZTP  亚微乳组 AZTP 包衣脂质体组 AZTP 包衣亚微乳组Kobs/min-1  0.3480  0.0198   0.0073 0.0038 0.0036t1/2/min  1.99  35.01   94.95 180.32 192.54
实施例3：制备聚乙二醇硫酸酯胆固醇衍生物包衣的注射用脂质体，考察其在小鼠各组织中的分布情况。
将母药齐多夫定(AZT)溶液及脂前药齐多夫定棕榈酸酯(AZTP)脂质体组(聚乙二醇硫酸酯胆固醇包衣脂质体(PEG-CH-S组))小鼠尾静脉给药，考察齐多夫定在小鼠不同组织的分布情况。与AZT溶液剂相比，脂质体中药物在心、肝、脾、肺、脑中的分布均有增加，相对摄取率(re)均大于1，具体数值见附表2，说明脂质体能增加药物在这些组织的靶向性，其中以脑中药物浓度提高的最为显著。和溶液组相比，脂质体组在肾中的分布明显减少，有利于降低齐多夫定的肾毒性。
附表2.小鼠尾静脉注射AZT溶液和AZTP各脂质体组后，各组织中AZT的AUC0-60及靶向效率(re)
  组织  (μg·min/g)          心        肝        脾        肺        肾        脑  AUC  reAUCre AUC re AUCre AUC  re AUC re  AZT-Sol  216.2145.4 231.4 216.8 637.0 46.7  PEG-CH-S  378.4 1.75262.11.80 378.2 1.63 453.82.09 555.4  0.87 98.1 2.1
附表3.小鼠尾静脉注射AZT溶液和AZTP各脂质体组后，血中AZT的半衰期t1/2/min
    实验组    AZT    溶液组  AZTP  脂质体组  经DSPE-PEG包衣的  AZTP脂质体组  经PEG-CH-S包衣  的AZTP脂质体组    t1/2/min    11.0  18.1  21.7   21.1
实施例4胶束/前体胶束的制备
胶束：AZT肉豆蔻酸酯(AZTM)/PEG30000硫酸酯胆固醇衍生物或其盐(PEG平均分子量为30000)(1∶100)，先用适量乙醇溶解，减压除尽乙醇，加入水即成为胶束。在此基础上加入适量的冻干保护剂，如5％-15％甘露醇或5％-15％乳糖或5％-15％海藻糖或者它们中任意两个或者三个组合，进行冷冻干燥即得固体胶束。
前体胶束：AZT肉豆蔻酸酯(AZTM)/PEG10000硫酸酯胆固醇衍生物或其盐(PEG平均分子量为10000)(1∶80)，用适量乙醇溶解，即得前体胶束。临用时加入稀释溶剂即可形成胶束。
实施例5纳米粒的制备
在处方增加PEG300-30000硫酸酯胆固醇衍生物或其盐(1％-30％，w/w)，按照常规方法制备纳米粒即可。