定向肝细胞的聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸的聚合基因载体 与有关申请的交叉参考
本申请要求1998年5月20日提交的美国临时申请60/086,072地优先权。
发明背景
本发明涉及基因治疗。更具体地讲，本发明涉及一种聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸和肝细胞定向分子-聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸的组合物，该组合物用于基因送递到肝细胞中。
二十五年前，Friedmann指出了人类基因治疗的前景(T.Friedmann与R.Roblin(1972)“人类遗传疾病的基因治疗？”175《科学》949-955(1972))。从此，基因治疗已经代表着治疗人类疾病和给药的一种新的方式。现有研究暗含的侧重点在于确定基因转移步骤的安全性，并且通常将功效作为第二个目标。基因转移主要的技术障碍在于缺乏理想的基因送递系统。如果将基因以足够的数量并且在没有副作用的情况下送递到合适的特异性细胞中是可能的话，那么基因治疗将会是有效的。目前，非常少的器官或细胞可以被特异性地定向以便进行基因送递。现有许多用于将基因转移到细胞中的确定的方法，其中包括磷酸钙沉淀、电穿孔、粒子轰击、脂质体送递、病毒-载体送递以及受体介导的基因送递(MS Wadhwa，“具有低分子量的糖肽载体的定向基因送递”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995))。尽管这些所有的方法都可以用于哺乳动物的培养细胞，但是在将基因在体内引入到靶细胞中存在着许多困难。
采用逆转录病毒或腺病毒载体的转染方法克服了这些限制中的一些限制。特别是，逆转录病毒载体已被成功地用于将外源基因引入到活性分裂细胞的基因组中，从而获得了稳定的转化体(D.G.Miller等人“通过逆转录病毒载体的基因转移仅仅发生在感染阶段中进行活性复制的细胞中”10《分子细胞生物学》4239-4242(1990))。病毒载体系统通常涉及由插入到“辅助”细胞系中以产生转导感染剂的基因来互补缺损载体。但是，众所周知宿主对腺病毒的免疫应答限制了其用作转移促进剂以进行单一给药。为了应对这种限制，已经采用流感病毒血凝素的融合肽来代替腺病毒作为红细胞浆质(endosomal)溶解剂，但是获得了有限的成功(S.Gottschalk等人“有效地进行基因转移和在哺乳动物细胞中表达的新的DNA-肽复合体”3《基因治疗》448-457(1996))。但是，尽管其在体外转染的效率很高，但是该方法中将基因插入到宿主细胞的基因组中取决于病毒感染的途径。本申请中用于人类基因治疗的病毒感染途径的应用给内源病毒重组、致癌作用以及炎症或免疫反应带来了严重的关注(G Ross等人“美国的基因治疗：五年状况报告”7《人类基因治疗》1781-1790(1996))。由于这些忧虑，用于人类基因治疗的病毒载体的使用已经受到了极大的限制。
另一方面，作为另一种替代的途径广泛地研究了非病毒基因送递系统，比如阳离子脂质体或合成的基因载体，例如聚-L-赖氨酸(PLL)(M.A.Wolfert等人，“由DNA与合成的嵌段共聚物自组装形成的基因治疗载体的特性描述”7《人类基因治疗》2123-2133(1996)；AV Kabanov&VA Kabanov“用于将遗传材料送递到细胞中的具有聚阳离子的DNA复合体”6《Bioconj.Chem.》7-20(1995))。包括其相对的安全性和低的生产成本在内，采用基于非病毒的基因治疗具有许多的好处。基于质粒的途径的主要限制为采用非病毒途径在基因向若干重要身体目标(即肝和肺)送递的效率和体内基因表达水平两方面都要比采用病毒载体的低。
受体介导的基因送递具有其优势和限制(J.C.Perales等人“通过脱唾液酸糖蛋白受体能够定向基因go[sic]肝细胞的DNA复合体的生物化学与功能的特性描述”272《生物化学杂志》7398-7407(1997))。其在基因治疗中使用的优势如下。首先，可以针对特异的靶受体设计和定做基因送递载体。第二，不必将DNA整合到进行表达的宿主细胞的基因组中。第三，送递系统在理论上并不受转基因大小的限制。最后，该技术并不涉及使用潜在的感染试剂。在将该技术常规地用于人类的基因治疗之前，还存在着必须克服的不利之处。例如，该转基因并没有被整合到宿主细胞的染色体中，或者其表达是瞬时的。因此，最有可能的是必须使病人接受多次注射感兴趣的基因。DNA-配体复合体难于制备，并且直到最近有关其结构-功能之间的关系还所知甚少。而且，对参与转基因向细胞中的转移及其随后表达的生物过程仅仅有着不完整的了解。近来，已经详细地回顾了用于基因治疗的该系统的上述以及其它的特征(J.C.Perales等人对采用合成DNA-配体复合体的受体介导的基因转移的评价”226《欧洲生物化学杂志》255-266(1994))。
在20世纪70年代的中期，据表明PLL使得与DNA一起凝聚(condensate)(U.K.Laemmli“由聚环氧乙烷和聚赖氨酸引发的DNA凝聚物的特性描述”72《美国国家科学院学报》4288-4292(1975))。从此，已将用各种物质修饰的PLL用作基因载体(M.S.Wadhwa等人“具有低分子量的糖肽载体的定向基因送递”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995)；A.Maruyama等人(1997)“具有聚(L-赖氨酸)接枝物多糖共聚物和聚(D，L-乳酸)的纳米颗粒(nanoparticle)DNA载体”8《Bioconj.Chem.》735-742；G.Y.Wu与C.H.Wu“在体外定向基因送递至Hep G2肝癌细胞中的证据”27《生物化学》887-892(1988)；P.Midoux等人“由乳糖基化的聚-L-赖氨酸介导的向肝癌细胞中的特异性基因转移”21《核酸研究》871-878(1993)；P.Erbacher等人《糖基化聚赖氨酸/DNA复合体：与糖基化聚赖氨酸的大小和糖取代水平以及与质粒的大小有关的基因转移效率》6《Bioconj.Chem.》401-410(1995))。PLL本身可以用作DNA的凝聚剂(condensate)(U.K.Laemmli“由聚环氧乙烷和聚赖氨酸引发的DNA凝聚物的特性描述”72《美国国家科学院学报》4288-4292(1975))。但是，单独使用PLL作为基因送递载体具有若干不利之处。首先，由于PLL除了在电荷中和中使用的氨基以外没有官能团，因此其转染率是非常低的。而且，由于DNA磷酸盐骨架带有负电荷，因此DNA电荷中和程度的增加通常导致广泛的凝聚以及呈不溶的紧密结构的DNA相的分离(J.C.Perales等人“通过脱唾液酸糖蛋白受体能够定向基因go[sic]肝细胞的DNA复合体的生物化学与功能的特性描述”272《生物化学杂志》7398-7407(1997)；D.E.Olins等人“模型核蛋白复合体：有关阳离子型同聚多肽与DNA的相互作用的研究”24《分子生物学杂志》157-176(1967)；J.T.Shapiro等人“脱氧核糖核酸-聚赖氨酸复合体。结构与核苷酸特异性”8《生物化学》3219-3232(1969))。
鉴于前述内容，应当理解的是提供一种基因治疗的定向组合物和一种采用所述组合物的方法在本领域中将会产生显著的进步。
发明概述
本发明的一个目的在于提供一种有效地介导DNA送递到靶细胞中的组合物(composition)。
本发明进一步的目的在于提供一种用来有效地进行DNA送递的生物适合的组合物，从而导致非细胞毒性地转染到靶细胞中。
本发明的另一个目的在于提供一种用来把DNA送递到靶细胞中的方法。
上述以及其它的目的是通过合成出一种组合物(composition)来实现的，其中所述的组合物含有共价地接枝到一定百分比的聚乙二醇单元(member)上的聚赖氨酸单元，而聚乙二醇部分又共价地结合到定向部分上。此外，该组合物介导了DNA或基因部分转染到人的细胞中。该转染方法和组合物实现了这些目标，与此同时产生了最少的细胞毒性并且显著地提高了转染率。
因此，通过将定向部分(TM)偶联到PEG聚合物的一端并且共价地将TM-PEG的另一端连接到PLL的ε-氨基上来合成针对这些目的的聚合物。定向部分优选乳糖或半乳糖。采用定向部分的目的在于使得用于基因送递的细胞定向于特定的细胞。TM-PEG与PLL之比可以通过改变反应条件来调整。这种合成的载体、即TM-PEG-PLL(其中PLL中5-30％的氨基与TM-PEG缀合，而其余的氨基仍保持为未取代的游离氨基)能够与核酸一起形成稳定且可溶的复合体，其继而能够有效地进行转染。与单独使用PLL相比，这种接枝到PLL上的PEG部分使得核酸/载体复合体的溶解性更好并且细胞毒性下降。与美国专利5,733,762中公开的不含PEG的PLL相比，本发明PEG接枝的PLL提供了在生理血清和细胞培养基中与DNA形成的复合体的高度溶解性，并且防止了所形成的复合体(或纳米颗粒(nanopaticle))的沉淀和聚集，从而使得可以在体内以非常高的剂量水平给药。研究了TM-PEG-PLL系统的基因转染率和细胞毒性并且与仅以PLL复合的DNA进行了比较。举例来说，用质粒DNA/Lac-PEG-PLL复合体特异性地转染Hep G2细胞，这表明乳糖充当了肝癌细胞系的定向部分。本发明的PEG-PLL还降低了循环系统和细胞中DNA的蛋白水解降解程度并增强了细胞膜的融合，从而改善了转染率。另外，PEG还起到了连接PLL骨架和定向部分的接头的作用，从而提高了DNA送递到靶细胞中的定向效率。
附图若干视图的描述
图1显示出合成Lac-PEG-PLL的流程图。
图2为Lac-PEG-PLL说明性的1H-NMR分析的描绘，其中位于大约3.5ppm处的峰表明组合物中存在着PEG。
图3显示出采用30摩尔％Lac-PEG-PLL进行的说明性的条带阻滞测定(band retardation assay)。泳道1和10：分子量标记物；泳道2：质粒DNA(1μg)；泳道3：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(1μg)；泳道4：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(0.3μg)；泳道5：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(0.5μg)；泳道6：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(1μg)；泳道7：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(3.0μg)；泳道8：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(5.0μg)；泳道9：质粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(10.0μg)。
图4显示出质粒pSV-β-gal和处于Lac-PEG-PLL中的溶解度的测试结果。
图5为显示出采用不同程度的乳糖-PEG取代之转染实验结果的图示表示。(◆)6摩尔％Lac-PEG；(■)12摩尔％Lac-PEG-PLL；(▲)22摩尔％Lac-PEG-PLL；(×)30摩尔％Lac-PEG-PLL。
图6显示出作为聚合物基因载体的LIPOFECTIN、PLL、PEG-g-PLL、Gal-PEG-PLL和Lac-PEG-PLL在Hep G2细胞中的转染率的比较。
图7显示出对照培养基以及作为聚合物基因载体的LIPOFECTIN、PLL、PEG-g-PLL、Gal-PEG-PLL和Lac-PEG-PLL在Hep G2细胞中的细胞毒性的比较。
图8显示出本发明的组合物对各种细胞系的转染率的比较：阴影柱-Hep G2细胞；实心柱-NIH3T3细胞；点划线柱-A7R5细胞。
图9显示出DNA的数量对转染的影响；阴影柱-DNA：聚合物组合物为1∶2；实心柱-DNA：聚合物组合物为1∶3。
图10显示出培养时间对转染率的影响。
图11显示出培养时间对转染细胞的基因表达的影响。
图12显示出合成Lac-PEG-PLL的另一幅流程图。
图13显示出合成Gal-PEG-PLL的流程图。
发明的详细描述
在公开和描述本发明用于基因送递的组合物以及方法之前，应当了解的是本发明并不限于本文所公开的具体的构型、方法步骤和物质，这是因为这样的构型、方法步骤和物质可以多少发生些变化。还应当了解的是本文使用的术语仅仅是用于描述具体实施方案的目的并且并不打算进行限制，这是因为本发明的范围将仅仅受到所附权利要求及其等同内容的限制。
必须指出的是正如本说明书和所附权利要求书中使用的那样，除非上下文另外清楚地加以描述，单数形式的“一种”和“所述”均包括复数的相应内容。
本发明涉及一种能够与核酸形成稳定的、可溶的复合体的组合物及其制备方法，所述的组合物含有与聚乙二醇单元共价连接的聚赖氨酸(PLL)单元(PEG-PLL)，其又与可被细胞膜受体识别的定向部分(TM)共价连接。在解离的过程中，该复合体能够释放出核酸以便转染几种类型的细胞，并且定向部分(TM)使得选择性地转染到含有TM受体的细胞中。本发明还提供了一种用于在体外和体内进行特异性细胞转染的方法。TM优选选择性地定向肝癌细胞的乳糖或半乳糖。
在其最一般的定义之一的概念上，本发明涉及一种在至少一种带负电的核酸和至少一种带正电的聚合缀合物之间形成的复合体，其中所述核酸和所述聚合缀合物之间的关系本质上是静电的，所说的带正电的聚合缀合物基本上由聚L-赖氨酸(PLL)和PEG组成，其中大约5-30％的PLL(分子量为20-30K)的NH3+与PEG(分子量为0.5-20K)共价连接，其又与定向部分(TM)共价连接。本发明的PEG-PLL基因载体使得DNA凝聚(condensation)，由于PLL的正电荷和所述核酸的负电荷之间协同现象的结果，该作用仍保持得非常强烈。另外，在PLL的氨基部分上加入PEG防止了由PEG-PLL与核酸形成的复合体(或纳米颗粒)的沉淀和聚集，从而增加了复合体的溶解度。与PLL连接的PEG还起到了融合细胞膜与防止核酸蛋白酶解降解的作用，从而提高了转染率。此外，由于PEG可以起到连接PLL骨架和定向部分(TM)的接头的作用，因而它提高了所述复合体的定向效率。
在本发明的组合物中，定向部分(TM)可以是任何可被细胞膜受体识别的信号部分，优选地，，TM为含有特异性地结合肝细胞或肝癌细胞的半乳糖的糖。优选地，所述含有半乳糖的糖为选自乳糖和半乳糖的部分。
本发明的组合物可以与核酸一起形成稳定且可溶的复合体，它可以有效地转染哺乳动物的细胞。所述核酸可以在下列物质中进行选择：a)基因标记，诸如萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、赋于对抗生素(诸如潮霉素或新霉素)具有抗性的基因；b)用于治疗目的的基因，诸如编码在血胆固醇过多的情况下(肝脏)缺陷的低密度脂蛋白受体的基因、编码凝固因子(coaglulation factor)的基因、肿瘤的抑制基因、编码主要组织相容性蛋白的基因、抗癌基因、有义和反义RNA和编码核酶的基因；以及c)具有疫苗目的的基因，诸如编码病毒抗原的基因。
本发明中使用的PEG的分子量为0.5-20K道尔顿，优选0.5-5K道尔顿，其中具有重复单元为11-114。
本发明中使用的PLL的分子量为2-100K道尔顿，优选15-50K道尔顿，其中具有重复单元为10-250。
与采用仅仅具有PLL的相比，采用本发明组合物来将携带有待送递基因的质粒以增强的转染率送递到定向的肝细胞中。通常把质粒pSV-β-gal(为对pRSV-β-半乳糖苷酶载体的修饰)用作标记基因来监测基因在哺乳动物细胞中的表达(Promega公司pSV-β-半乳糖苷酶对照载体的图谱和序列TB094Promega Technical公告1(1994))。SV40早期启动子和增强子驱动lacZ基因在哺乳动物细胞中的转录。β-半乳糖苷酶是一种非常好的报道酶(N Rosenthal(1987)“通过功能测定对克隆基因调节元件的鉴定”152《Methl.》704-720(1987))并且通过分光光度测定可以在细胞提取物中快速和直接地测定。
据条带阻滞测定表明乳糖-PEG-修饰的PLL具有与pSV-β-gal形成复合体的能力(图3)。电泳过程中pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL条带的迁移取决于pSV-β-gal与Lac-PEG-PLL之比，而这改变了复合体的净电荷及其大小和密度(A.V.Kabanov&VA Kabanov“用于将遗传材料送递到细胞中的具有聚阳离子的DNA复合体”6《Bioconj.Chem.》7-20(1995))。pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL复合体电泳迁移率的下降伴随着该系统中Lac-PEG-PLL含量的增加，而这是由于DNA的负电荷被载体的正电荷中和所致。在染料置换测定中同样观察到DNA-载体复合体的形成。
本发明在体外或体内转染的方法包括在使存在如下所列的条件下向含有待转染细胞的培养基中引入核酸和PEG接枝的PLL聚合载体的复合体：使所述复合体经过培养基进入到细胞的细胞质中，使前述复合体的核酸释放到细胞的细胞溶胶中，在转染的细胞中转录和表达所述的核酸。
正如前面讨论的那样，未经修饰的PLL作为基因载体的问题之一为PLL与DNA之间的复合频繁地导致形成了细小的沉淀，从而限制了可以使用的浓度(T.D.McKee等人“脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合物的制备”5《Bioconj.Chem.》306-311(1994))。因此，在含有0.15M NaCl的20mM HEPES(pH7.4)中pSV-β-gal与PLL的复合导致生成了50μg/ml pSV-β-gal的沉淀。而当在该浓度下与DNA形成复合体时，本发明的PEG-g-PLL和TM-PEG-PLL维持了pSV-β-gal的溶解性。因此，显而易见的是所连接的PEG部分使得pSV-β-gal/基因载体的复合体基本上更加易于溶解，从而更能发挥作用。
本发明还涉及一种作为上述聚合基因载体的PEG接枝的PLL组合物的制备方法。举例来说，在附图以及实施例1、15和16中描述了用于合成Lac-PEG-PLL和Gal-PEG-PLL的方法。
本发明还涉及由核酸和本发明聚合基因载体形成的复合体用于转染细胞的用途，其中所述的细胞可以选自下列细胞：造血细胞(cellsfrom hematopoietic strains)；肝细胞；骨骼肌细胞；皮肤细胞，诸如成纤维细胞、角质细胞、树突细胞或黑素细胞；血管壁细胞，诸如内皮细胞或平滑肌细胞；呼吸道的上皮细胞；中央神经系统的细胞；癌细胞；免疫系统的细胞，诸如淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等。
作为本发明的一个实例，研究了合成载体Lac-PEG-PLL的基因送递能力及其特异性。选出Hep G2细胞用于特异性测试，这是因为它们在表面上具有特异的乳糖受体。乳糖的识别是通过位于肝细胞上的乳糖受体介导的(L.Stryer《糖的生物化学》(第3版)第345页，WH Freemanand公司，纽约(1988))。采用它们从血液中除去糖蛋白。许多新合成的糖蛋白(诸如免疫球蛋白和肽激素)含有具有末端唾液酸和半乳糖残基的糖单元。在几个小时或者几天的时间里，依赖于特殊的蛋白，末端的唾液酸残基被位于血管表面上的唾液酸酶除去。这些修整蛋白暴露出的半乳糖残基是通过肝细胞质膜中的脱唾液酸糖蛋白受体来检测的。然后通过胞吞过程使脱唾液酸糖蛋白及其受体的复合体进入到肝细胞内部，以便从血液中除去经修整的糖蛋白。本发明公开的内容表明载体上的乳糖部分能够起到针对肝癌细胞系的定向物质的作用。
Lac-PEG-PLL是通过包括两个反应的流程来合成的，其中包括乳糖-PEG二酸的合成以及由乳糖-PEG二酸和PLL合成出梳状聚合物Lac-PEG-PLL(图1和图15)。在第一个反应中，氯甲酸异丁酯(IBCF)和羧酸在PEG二酸中生成活性酯，并释放出一分子的盐酸。采用三乙醇胺(TEA)作为碱来中和反应过程中生成的盐酸。对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷中的氨基与PEG上的酮基反应，从而在糖和PEG之间生成了酰胺键。在4个小时的反应之后，采用过量的乙醚使产物沉淀。然后将沉淀重新溶解在蒸馏水中，并使用1,000MWCO的透析膜进行透析以除去未反应的对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷。使用Con A-Sepharose柱来除去未反应的PEG。通过向所述组合物中加入含有0.1M甲基-a-D-甘露吡喃糖苷的缓冲液，从Con A-Sepharose柱中分离出乳糖-PEG二酸。与乳糖-PEG二酸一同洗脱出乳糖-PEG-乳糖级分(其中PEG二酸的两个羧酸端都已与乳糖部分发生了酯化)，但该级分却无需进行进一步的纯化，这是因为乳糖-PEG-乳糖在第二步反应条件下是不反应的。而且在第二步反应的透析过程中，完全除去了乳糖-PEG-乳糖。在第二步反应中，IBCF活化了乳糖-PEG中的羧酸，从而有助于在PLL中的氨基与羧酸或酯之间形成酰胺键。
本发明的Lac-PEG-PLL聚合物与pSV-β-gal一起形成了一种复合体。本发明的Lac-PEG-PLL化合物使得该复合体可溶，而pSV-β-gal与单独PLL之间形成的复合体却生成了细小的沉淀。当与PLL复合体作用于Hep G2细胞相比时，Lac-PEG-PLL载体/DNA复合体的转染率要高出10倍以上。这种提高可能是由于乳糖部分的细胞定向作用，并且一部分是由于PEG的融合作用。相连的PEG基团还使得Lac-PEG-PLL与pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL复合体比起PLL的细胞毒性要低。乳糖部分特异性地起到了用于转染到肝细胞中的定向部分的作用。这可以通过两个证据来证明。首先，游离的乳糖在毫摩尔浓度的水平上抑制了转染。其次，当将其它乳糖受体缺陷型细胞系用于转染时，监测到非常低的转染率。FBS和氯奎的存在改善了转染，从而进一步表明转染是通过胞吞作用机理发生的。
提供了下列实施例来说明制备所述组合物的方法以及使用本发明组合物的方法。
实施例1Lac-PEG二酸的合成
乳糖-PEG二酸的合成进行如下。在氮气氛下在冰水浴中，将600毫克(1.0mM)的PEG二酸(分子量＝600；Fluka，Ronkonkoma，NY)溶解在含有1.0mM三乙胺(TEA；Aldrich)的1.5mL无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF；Aldrich)中。在冰水浴中逐滴地加入溶于1.0mL干燥DMF的1mM氯甲酸异丁酯(IBCF；Aldrich)，并且搅拌混合物15分钟。IBCF起到了羧酸活化剂的作用。然后加入溶于1.0mL DMF的对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷(1.0mM；Sigma)，并且在冰水浴中搅拌混合物30分钟，然后在室温下再搅拌3小时。在过量的干乙醚(25mL)中沉淀产物。然后将沉淀溶解在20mL蒸馏水中，在蒸馏水中进行透析(透析袋的MWCO为1,000；Spectrum，Houston，TX)并且冷冻干燥。通过在Con A-Sepharose柱(Sigma)中除去未反应的PEG二酸来纯化产物。将40毫克冻干的产物溶解在40mL的0.02M Tris缓冲液(pH7.4)、0.5M NaCl、3mM CaCl2和3mM MnCl2中，并以0.10mL/分钟的流速装入Con A-Sepharose柱中。洗脱该柱直至280nm处的吸光值降低到低于0.01，然后加入类似的、但却含有0.1M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷(Sigma)的缓冲液。通过在280nm下监测检测出乳糖-PEG和乳糖-PEG-乳糖混合物特异的洗脱峰，收集该部分，在蒸馏水中透析并且最终进行冷冻干燥。通过滴定测定羧酸的含量。乳糖-PEG与乳糖-PEG-乳糖的摩尔比约为2∶1。
实施例2乳糖-PEG二酸与PLL的接枝
在该实施例中描述了Lac-PEG-PLL具有30％(摩尔/摩尔％)乳糖-PEG)的合成。在氮气氛下在冰水浴中，将根据实施例1的步骤制备的乳糖-PEG和乳糖-PEG-乳糖混合物(51.5mg；含有0.042M的乳糖-PEG)溶解在0.5mL无水的DMF中。将溶于0.5mL DMF的IBCF(0.036M)逐滴添加到上述溶液中。将该混合物在冰水浴中搅拌30分钟，然后逐滴地加入到含有25mg PLL-HBr(120个重复单元；分子量＝25,000；Sigma)和10μLTEA的1mL无水的二甲亚砜(DMSO；Aldrich)(其已在冰水浴中用氮气清洗了10分钟)中，然后在室温下再搅拌3小时。在100mL的无水乙醚中沉淀产物，并将沉淀溶解在10mL蒸馏水中。将其在0.01M的NaHCO3溶液中透析(透析袋的MWCO为25,000)，然后再在0.01M的盐酸溶液中透析，之后再在蒸馏水中透析。最后冷冻干燥透析所得的产物。通过1H-NMR计算出乳糖-PEG与PLL中氨基的摩尔比。
实施例3乳糖-PEG-PLL的1H-NMR分析
在水中进行由实施例1和2的步骤制得的Lac-PEG-PLL的1H-NMR分析。在图2中显示出30摩尔％的Lac-PEG-PLL的1H-NMR谱。大约3.5ppm处的峰表明该组合物中存在着PEG。通过将PEG(-CH2CH2-.s.3.4-3.7ppm)峰与PLL侧链(-CH2CH2CH2-.m.1.1-1.8ppm)峰相关联，从NMR谱中计算出PEG的含量。通过该方法证实了由本发明制得的四种说明性的载体组合物中乳糖-PEG含量之比如下：分别为6，12，20和30摩尔％。
实施例4生化表征：条带阻滞测定
进行了多次实验来研究本发明的Lac-PEG-PLL组合物是否与pSV-β-gal质粒DNA(Promega公司，Madison，Wisconsin；EMBL登记号为X65335)形成了复合体。将根据实施例1和2的步骤制备的不同数量的Lac-PEG-PLL(0.1-10μg)添加到1μg的质粒DNA中，并在室温下培养30分钟。将凝胶电泳样品缓冲液加入到每个样品中，然后采用Easy-CastTM电泳系统(Owl Scientific公司，Woburn，MA)在100V下通过在1％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳90分钟来分离样品。使用TBE(45mM Tris-硼酸盐，1mM EDTA，pH8.0)缓冲液作为电泳缓冲液。用溴化乙锭(0.5μg/mL)对凝胶染色30分钟并用紫外发光器照明以显示DNA的位置。采用由EcoRI消化的λDNA(Promega)作为DNA大小的标记物。
实施例5生化表征：溶解性
通过Wadhwa等人(MS Wadhwa等人，“具有低分子量的糖肽载体的定向基因送递”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995))开发的并作了细小改进的方法测定载体/质粒DNA复合体的溶解性。将pSV-β-gal质粒DNA和根据实施例1和2的步骤制备的Lac-PEG-PLL载体在1mL含有20mM HEPES、0.15M NaCl的缓冲液(pH7.4)中混合，其在1.5mL离心管中的最终浓度为50μg/mL。在室温下培养30分钟后，将试管在10,000rpm下离心5分钟。取出上清液并测量其在260nm下的吸光值以确定溶液中残留的DNA。将不含载体的DNA样品用作标准样品。通过将DNA与PLL或与PEG-g-PLL(根据美国系列申请号60/069,351来制备，该文献插入本文仅供参考)混合生成了用于比较的复合体。
如果在选择的条件下离心并未从上清液中除去DNA的话，那么定义质粒DNA/载体复合体是可溶的。图4显示出pSV-β-gal与最终浓度50μg/ml的PLL之间复合体的形成导致生成了细小的沉淀，当在10,000rpm下离心5分钟时其沉积下来。但是，当使用经PEG修饰的PLL与pSV-β-gal形成复合体时，离心后仍有将近98％的DNA残留在上清液中。当与pSV-β-gal/PEG-g-PLL复合体相比时，带有乳糖部分的PEG基团末端的修饰并没有导致溶解度下降超过10％。因此，在PLL上连接的PEG基团防止了pSV-β-gal/载体复合体生成细小的沉淀和变得不能溶解。
实施例6转染
采用Hep G2细胞系(ATCC No.HB8065)评价根据实施例1和2合成的Lac-PEG-PLL的体外转染率。Hep G2细胞为一种人的肝细胞瘤(肝癌)细胞系，在其表面上具有特异的乳糖受体。在37℃下，在5％CO2NapcoTM培养箱(Precision Scientific公司，芝加哥，IL)中，在补充有1mM丙酮酸钠和10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的MEM培养基中维持细胞。对转染实验来说，不同的pSV-β-gal/PEG-g-PLL复合体是用固定量的pSV-β-gal(10μg/mL)和增加量的Lac-PEG-PLL(1-100μg/mL)配制的。使用不含FBS的细胞培养基作为混合培养基。
体外转染通常进行如下。将Hep G2细胞以20×104个细胞/mL的密度、100μL/孔的量接种在96孔平底微量测定平板(Falcon公司，Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)中，并且在加入质粒DNA/载体复合体或者单单加入载体之前培养24小时。
在转染之前，采用探针型超声波仪(Sonifer250，branson)对Lac-PEG-PLL载体超声处理6-8分钟。在转染实验中使用的所有试剂都通过0.22μm聚碳酸酯滤膜过滤加以灭菌。通过在100μl不含FBS的细胞培养基中混合1μg的pSV-β-gal和不同数量的载体来制备质粒pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL复合体。并在室温下培养30分钟。分别以10％(v/v)和100μM的最终浓度添加FBS和氯奎。用100μL的转染混合物替换96孔平板中每个孔中的培养基。然后在37℃下在5％CO2培养箱中培养细胞4小时。4个小时后，除去转染混合物并向每个孔中加入100μL含有10％FBS的新鲜培养基。在37℃下再培养细胞48小时。通过测量由pSV-β-gal引入细胞中的β-半乳糖苷酶的活性来测定转染率。采用进行了轻微修饰的O-硝基苯基-b-D-半乳吡喃糖苷(ONPG；Sigma)在420nm下通过分光光度法测定转染细胞中β-半乳糖苷酶的活性(J.R.Saneset等人“采用重组的逆转录病毒研究小鼠胚胎中移植后的细胞谱系”5《EMBO J.》3133-3142(1986)，该文献插入本文仅供参考)。在96孔板中从细胞中除去生长培养基以便进行测定，并且用1X PBS仔细地洗涤细胞两次以防止粘附的细胞脱离。通过向细胞中加入60μL的1X报道溶解缓冲液(Promega，Madison，WI)并在室温下培养30分钟、在培养过程中中途摇晃平板来溶解细胞，接下来刮去细胞。将60微升溶于2X测定缓冲液(Promega，Madison，WI)的ONPG(1.33mg/mL)加入到溶解的细胞中，并在37℃下培养细胞4小时。通过向每个孔中加入150μL的1M碳酸钠溶液来终止反应，并且采用Bio-Tek EL-311微量板读出器(Bio-Tek仪器公司，Winooski，VT)读取420nm下的吸光值以测定β-半乳糖苷酶的活性。
采用体外Hep G2细胞系来评价合成的Lac-PEG-PLL的转染率。HepG2细胞(一种肝癌细胞系)在其表面上具有特异的乳糖受体。对转染实验来说，不同的pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL复合体是用固定数量的pSV-β-gal(10μg/mL)和增加量的Lac-PEG-PLL(1-100μg/mL)配制的。使用不含FBS的细胞培养基作为混合培养基。
Lac-PEG-PLL呈现出转染到Hep G2细胞中的能力(图5)。无论使用任何乳糖基化的载体都观察到当pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL(0.3或0.5mg的载体)的重量比低于1∶1时非常低的乃至为零的转染率。当DNA/载体的重量比为1∶2和1∶3时，那些乳糖的量越高的载体显示出越高的转染率。在这些比例中4种乳糖基化的载体中，30摩尔％的Lac-PEG-PLL是最佳的载体。尽管本发明并不局限于任何所提出的科学解释，但是这种效率的提高可能是由于乳糖对Hep G2细胞的定向能力，而这揭示了与PEG-g-PLL的情况极为不同的趋势。正如前面讨论的那样，10摩尔％的PEG-g-PLL显示出比25摩尔％的PEG-g-PLL的效率要高。当采用30摩尔％的Lac-PEG-PLL载体时，在1∶3的重量比下达到了最高的转染率，但是重量比为1∶2时也呈现出几乎相同的转染程度。据证明载体中乳糖-PEG取代的程度越高，达到最高转染率所需的载体数量也越大。当使用5摩尔％的Lac-PEG-PLL时，比值为1∶1的复合体显示出最高的效率。在30摩尔％Lac-PEG-PLL的情况下，比值为1∶3的复合体显示出最高的效率。这可以由基因载体与pSV-β-gal形成复合体的能力来解释。取代越多的Lac-PEG-PLL具有越少的游离胺基与DNA上的负电荷发生相互作用。因此，需要更多的载体与DNA形成复合体，以便达到与含有更少量游离胺相互作用之Lac-PEG-PLL相同的程度。
图6归纳了采用PLL和修饰的PLL转染的结果。采用LIPOFECTIN试剂(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)来比较转染率。在该实验所用的载体中，对HepG2细胞而言，PLL、PEG-g-PLL和Lac-PEG-PLL-以及LIPOFECTIN、Lac-PEG-PLL显示出最佳的效率。
Lac-PEG-PLL显示出要比PLL和PEG-g-PLL的改进的转染率。在具有不同修饰的比值的Lac-PEG-PLL中，在与pSV-β-gal的重量比为1∶3的情况下，30摩尔％的Lac-PEG-PLL达到了最高的效率。据证实位于PEG末端上的乳糖部分赋予了细胞定向能力到pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL复合体上。此外，PEG的融合能力可以起到所观察到的提高转染率的另一个因素的作用。这一断言得到了这样一种事实的支持，即已知PEG与细胞膜的磷脂头部基团有关，它协助了修饰蛋白渗透进入细胞膜中(M.Yamazaki&T.Ito，“由憎渗透压的缔合作用导致的磷脂小泡膜结构中的变形和不稳定性：聚乙二醇诱导的融合机理的机械应力模型”29《生物化学》1309-1314(1990))。
实施例7细胞毒性
在本实施例中，根据实施例6的步骤用pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL转染Hep G2细胞。以96孔板中每个孔3μg的浓度(细胞培养基中为30μg/mL)测试不同的基因载体。在37℃下使基因载体与细胞一起培养4小时，然后通过Y.H.Choi等人的方法(“用作聚合基因载体的聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸”《J.Control.Rel.》(1997)该文献插入本文仅供参考)测定细胞的存活。在图7中显示出针对Hep G2细胞的合成载体的细胞毒性。在有30μg/mL基因载体存在的情况下培养Hep G2细胞4小时。之所以选择30μg/mL的浓度是因为在该浓度下PEG-PLL和Lac-PEG-PLL呈现出其最佳的转染率。对Lac-PEG-PLL而言，在Hep G2细胞中没有观察到细胞毒性，而PLL则呈现出中等至高度的细胞毒性。乳糖-PEG取代比例的不同并未在细胞生存力方面带来显著的变化。这可以得到相差显微观测的进一步支持，即把Lac-PEG-PLL与Hep G2细胞一同培养并未给细胞的生存力带来任何显著的影响。将PLL与细胞一起培养4小时改变了细胞的形态，但是在相同的浓度和培养时间下PEG-g-PLL或Lac-PEG-PLL并未显著地改变细胞的形态。
实施例8DNA的量对转染的影响
测试了质粒DNA的数量对转染的影响。根据上述实施例的步骤进行转染。使用了30摩尔％的Lac-PEG-PLL。pSV-β-gal的量由0.1变化至5μg。DNA与载体的重量比为1∶2或1∶3。转染的条件包括10％的FBS和100M的氯奎。在转染和随后培养48小时后，溶解细胞并测定β-半乳糖苷酶的活性。图9中所示的结果表明在这些条件下，1μg的质粒DNA产生了最佳的结果。
实施例9时间对转染的影响
测试了时间对转染的影响。根据上述实施例中所述的步骤进行转染。在质粒与Lac-PEG-PLL之比为1∶3的情况下，采用30摩尔％的Lac-PEG-PLL和1μg的pSV-β-gal来转染Hep G2细胞。在有10％FBS和100μM氯奎存在的情况下，转染时间由0.5变化至6小时。转染后，培养细胞48小时，然后测定β-半乳糖苷酶的活性。图10中所示的结果表明经过4个小时的培养获得了最佳的转染率。
实施例10时间对基因表达的影响
采用LIPOFECTIN试剂或30摩尔％的Lac-PEG-PLL作为基因载体。根据上述实施例的步骤进行转染。在质粒DNA与载体之比为1∶3的情况下，pSV-β-gal的量为1μg。在与HepG2细胞一起培养4小时后，除去转染培养基并培养细胞。在1-4天的时间里，溶解细胞并测定β-半乳糖苷酶的活性。图11中所示的结果表明在所述条件下，在介导转染的过程中Lac-PEG-PLL的存在比起LIPOFECTIN试剂要有效得多。对这两种载体而言，β-半乳糖苷酶的活性都随时间增加。但是，Lac-PEG-PLL在第1天产生的β-半乳糖苷酶的活性相当于LIPOFECTIN试剂在第4天培养时获得的活性。
在整个96小时的观察期内维持表达。对在培养细胞中的转染来说，维持基因的表达多达96个小时是本发明基因载体的一个优点，这是因为在可能发生转染细胞的操作的过程中，这种表达的耐力提供了一个机会。已知在仅仅24个小时后，带有甘露糖基化PLL/DNA的人巨噬细胞中转染的萤光素酶的活性达到最大值，然后在72个小时后该活性迅速地降低至仅为2％。
实施例11Lac-PEG-PLL的另一种合成方法
在图12中说明了Lac-PEG-PLL的另一种合成途径并且具体描述如下：
1)具有PEG的分子量为3,400的Lac-PEG二酸的合成：
将1.08g的叔丁氧羰基胺-聚乙二醇甲基羧基琥珀酰亚胺(tert-butyl carbonate amine-polythylene glycol methyl carboxysuccinimide)(Shearwater Polymer公司)溶解在20mL含有50mg TEA并用氮气清洗的DMF中。加入0.14g(0.33微摩尔)的对-氨基-苯基-吡喃型乳糖(PAPL，Sigma)并且搅拌过夜。通过用MWCO为1,000的Spectrum膜在DI水中透析来除去DMF、未反应的PAPL、羟基琥珀酰亚胺和TEA。通过冷冻干燥得到产物。
2)氨基-PEG-Lac的合成：
将上述产物在-5℃下溶解在含有10％(v/v)茴香醚的并用氮气清洗过的三氟乙酸中并且搅拌1个小时。用乙醚沉淀产物并且过滤。用醚洗涤沉淀三次。最后，通过用MWCO为1,000的Spectrum膜在DI水中透析来进一步纯化产物。通过冷冻干燥获得了氨基-PEG-Lac。
3)琥珀酸-PEG-Lac的合成：
通过使氨基-PEG-Lac与琥珀酸酐(Aldrich)反应，将氨基-PEG-Lac转化成琥珀酸-PEG-Lac。将0.76g氨基-PEG-Lac溶解在10ml含有22.0mg琥珀酸酐的甲苯中并回流6小时。然后用过量的醚使聚合物Suc-PEG-Lac沉淀。用醚洗涤沉淀三次。最后将产物在真空下干燥3天。
将0.39g的Suc-PEG-Lac溶解在2mL含有12.7mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF中。然后加入22.7mg的DDC和15mg的TEA，并且搅拌过夜。通过过滤除去沉淀。将产物HOSu-Suc-PEG-Lac在真空下完全干燥2天。
4)Lac-PEG-PLL的合成：
举例来说，含有5％Lac-PEG的Lac-PEG-PLL的合成描述如下。将溶于0.5mL DMSO的23.7mg(0.11微摩尔)Suc-PEG-Lac在5分钟的时间里逐滴添加到2mL含有25mg(0.11微摩尔)PLL的DMSO中，并且再搅拌5个小时。然后通过使用MWCO为25,000的Spectrum膜在DI水中使产物透析2天来除去DMSO、N-羟基琥珀酰亚胺和未反应的PEG。通过冷冻干燥得到了最终的产物并且储存于-20℃下。
实施例12Gal-PEG-PLL的合成方法
在图13中说明了Lac-PEG-PLL的另一种合成途径并且具体描述如下：
1)HOSu-PEG二酸的合成：
在室温下将1.20g(2.0微摩尔)PEG二酸(分子量为600，Fluka，Ronkonloma，NY)溶解在20ml醋酸乙酯(Aldrich)中。然后加入69.0mg(0.6微摩尔)的N-羟基琥珀酰亚胺(Aldrich)、144.4mg(0.70微摩尔)的N，N’-二环己基碳酰亚胺(Aldrich)和300μL。在室温下将上述溶液搅拌过夜。在反应后，通过采用孔径为0.22μm的Durapore滤膜过滤除去沉淀二环己脲，并用醋酸乙酯洗涤3次。在真空下通过Rotavap除去醋酸乙酯。将残渣溶解在二氯甲烷中，然后在-20℃下用乙醚沉淀PEG产物。通过在-20℃下离心并滗去上清液来收集沉淀。最后在室温下在真空中完全干燥HOSu-PEG二酸若干天。
2)Gal-PEG的合成：
在室温下将350mg(0.5微摩尔)的HOSu-PEG二酸、107.8mg(0.5微摩尔)的D(＋)-半乳糖胺(Sigma)、101mg(1.0微摩尔)的三乙胺(TEA，Aldrich)溶解在2ml二甲亚砜(DMSO，Aldrich)中，并且搅拌过夜。通过在-70℃下沉淀PEG的衍生物来除去未反应的半乳糖胺、DMSO、TEA和N-羟基琥珀酰亚胺，并通过离心得到沉淀。通过离子交换柱除去由HOSu-PEG的水解产生的PEG二酸。在DI水中进一步纯化半乳糖-PEG(Gal-PEG)，并通过冷冻干燥得到产物。
3)将Gal-PEG二酸接枝到PLL上：
采用与实施例2所述类似的Lac-PEG-PLL的接枝方法将Gal-PEG二酸接枝到PLL上。
提供上述实施例只是出于说明的目的，并且并不打算和不应当以任何方式构成对本发明的限制。在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的化合物和方法作出各种改动，并且应当了解的是本发明仅仅受到所附权利要求限定的范围的限制。