重组人干扰素Α2BDNA片段及编码的蛋白质.pdf

本发明公开了一种重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质，重组人干扰素α2bDNA片段是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质是序列表SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。本发明的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质主要以可溶性方式存在，其抗病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增殖活性。

权利要求书
1.  一种重组人干扰素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.  一种重组人干扰素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

3.  权利要求2的一种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，其特征是它是序列表SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。

4.  一种重组人干扰素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。

5.  权利要求4的一种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，其特征是它是序列表SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列。

6.  一种重组人干扰素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。

7.  权利要求6的一种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，其特征是它是序列表SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列。

说明书重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质
技术领域
本发明涉及医药生物工程技术领域，涉及一种重组人干扰素DNA片段及编码的蛋白质。
背景技术
干扰素α(interferon，IFNα)是一种细胞因子，具有抗肿瘤增生、抗病毒等生物活性，在炎症、病毒和恶性肿瘤等方面具有显著疗效。采用分子生物学及DNA重组技术，已经研发上市了重组人干扰素。但是人干扰素α2b作为药物，并没有达到最大优化，有的人干扰素α2b其比活不够高，也有的可溶性程度不高。人们不断应用新方法和技术，对人干扰素α2b进行改造，试图寻找和发现比活更高、可溶性程度较高的新型人干扰素。基因工程和PCR方法为改造干扰素基因序列提供了有力的技术支持，用于获得更高活性的干扰素α2b，提高疗效和延长半衰期。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重组人干扰素α2b DNA片段。
本发明的第二个目的是提供第二种重组人干扰素α2b DNA片段。
本发明的第三个目的是提供第二种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质。
本发明的第四个目的是提供第三种重组人干扰素α2b DNA片段。
本发明的第五个目的是提供第三种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质。
本发明的第六个目的是提供第四种重组人干扰素α2b DNA片段。
本发明的第七个目的是提供第四种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质。
本发明的技术方案概述如下：
一种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
第二种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO.2的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表SEQID NO.3所述的氨基酸序列。
第三种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO.4的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表SEQID NO.5所述的氨基酸序列。
第四种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO.6的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表SEQID NO.7所述的氨基酸序列。
分别含有序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒，用下述两种方法之一构建的：
第一种方法是：根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物EcolC1958，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体pBPE172，将含有序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接或将含有序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接或含有序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接，得到含有序列表SEQ ID NO.2的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID NO.4的重组人干扰素α2bDNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID NO.6的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒。
第二种方法是：将含有序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列与载体pET43.1a酶切后连接或将含有序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列与载体pET43.1a酶切后连接或含有序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列与载体pET43.1a酶切后连接，得到含有序列表SEQ IDNO.2的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID NO.4的重组人干扰素α2bDNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID NO.6的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒。
本发明的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质主要以可溶性方式存在，其抗病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增殖活性。
附图说明
图1是PCR后的rh-mIFN-1片段的电泳图。
图2是大引物法获得的rh-mIFN-2片段的电泳图。
图3是大引物法获得的rh-mIFN-3片段的电泳图。
图4是重叠延伸获得的rh-mIFN-7片段的电泳图。
图5是pBPE172-rh-mIFN-7人干扰素产物的质粒双酶切的电泳图。
图6是pPET43.1a-rh-mIFN系列质粒双酶切电泳图。
具体实施方式
本发明在干扰素研究方面，进行了大量的前期工作。对目前发现的干扰素进行生物信息学同源性分析和功能预测，根据相关文献中报道的干扰素基因序列的活性位点，比较了几种干扰素药物的差异，设计出了1种可具有高比活性的人干扰素α2b氨基酸序列，并反向推出一种重组人干扰素α2b DNA片段(序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)。并依据大肠杆菌的密码子偏嗜性和表达特性，进行定向突变改造，得到三种重组人干扰素α2bDNA片段(序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列)，分别将三种重组干扰素α2b DNA片段序列与载体连接后，导入宿主细胞进行表达，得到重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质(序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)。本发明的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质其抗病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增殖活性。
首先通过对人干扰素IFNα2b基因进行结构和功能关系的分析，选择性将人干扰素受体结合区域和活性位点的氨基酸残基置换成其它氨基酸残基后的结果的分析，选择了对52、53、55、103、107、113、121、125、132、161位氨基酸10个残基进行定向改造，应用PCR技术，不断地优化PCR反应体系和反应条件，首先设计并合成了rh-mIFN-1(序列表SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列)，再根据基因片段52、53、55和103、107位氨基酸相隔较近的特点，采用大引物PCR的方法对其进行多位点诱变，依顺序获得了rh-mIFN-2和rh-mIFN-3编码基因，在获得rh-mIFN-2时，利用下游引物对161位进行突变，最后采用重叠延伸定点突变方法以rh-mIFN-6为模板，分别对113、121、125、132位氨基酸残基进行定点诱变，获得了rh-mIFN-4、rh-mIFN-5、rh-mIFN-6、rh-mIFN-7。通过对rh-mIFN-7测序确定最终获得了一种重组人干扰素α2b DNA片段(序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列)。
然后分别将序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列连接到高效表达载体pBPE172或pET43.1a上，将重组载体pBPE172-rh-mIFN或pET43.1a-rh-mIFN在表达菌E.coli.BL21进行诱导表达，在选择表达菌株时，我们需选择可以表达相应的识别其稀有密码子tRNA较多的菌株E.coli BL21，最后比较了重组载体pBPE172-rh-mIFN或pET43.1a-rh-mIFN的表达形式，由于前者具有EcolC1958-Tag融合蛋白，后者具有Nus-tag融合蛋白，使得本发明的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质(序列表SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列、序列表SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)以可溶性蛋白形式存在。
并且通过对诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度的选择，初步优化了工程菌的表达条件，在30℃，IPTG浓度为1mM，诱导5h后获得的蛋白表达量高，工程菌稳定性好。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。基因片段的设计与合成为：
(1)通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库检索的人源干扰素α2b原始序列，并根据已知上市的干扰素α2b氨基酸序列，在总结和分析大量关于干扰素活性位点的文献后，定向设计一种重组人干扰素α2b DNA片段(序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)；
(2)重组人干扰素α2b DNA片段(序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)的合成。
重组人干扰素α2b中含有166个氨基酸，其基因序列的长度在498bp。
引物的设计与合成：
根据设计序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列设计合成8对引物(A1～A8)，长度为60～80bp，相邻引物的重叠区域为12bp，Tm值在50～60℃范围。设计上游引物ES和下游引物HX，上游引物ES引入酶切位点EcoRI，下游引物HX引入酶切位点HindIII；
各引物序列如下：
ES(直线为酶切位点)：CGCGAATTCATGTGCGATCTGCCG(SEQ ID NO.8)
HX(直线为酶切位点)：GTCAAGCTTTTCTTTGCTACGCAGTCTTTC(SEQ ID NO.9)
A1：
ATGTGCGATCTGCCGCAGACCCATAGCCTGGGCAGCCGTCGTACCCTGATGCTGC
TGGCCCAG(SEQ ID NO.10)
A2：
CTTCCTGCGGAAAGCCAAAATCATGACGATCTTTCAGGCAGCTAAACAGGCTAA
TACGACGCATCTGGGCCAGCAG(SEQ ID NO.11)
A3：
TTCCGCAGGAAGAATTTGGCAACCAGTTTCAGAAAGCGGAAACCATTCCGGTGC
TGCATGAAATGATTCAGCAGAT(SEQ ID NO.12)
A4：
GAATTTATCCAGCAGGGTTTCATCCCACGCCGCGCTGCTATCTTTGGTGCTAAAC
AGGTTGAAGATCTGCTGAATC(SEQ ID NO.13)
A5：
CTGGATAAATTCTATACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGC
GTGATTCAGGGCGTGGGCGTGA(SEQ ID NO.14)
A6：
GTGATGCGCTGAAAATATTTACGCACGGCCAGAATGCTATCTTCTTTCATCAGCG
GGGTTTCGGTCACGCCCACGC(SEQ ID NO.15)
A7：
TCAGCGCATCACCCTGTATCTGAAAGAAAAAAAATATAGCCCGTGCGCGTGGGA
AGTGGTGCGTGCGGAAATTATG(SEQ ID NO.16)
A8：
TTCTTTGCTACGCAGGCTTTCCTGCAGGTTGGTGCTCAGGCTAAAGCTACGCATA
ATTTCCGC(SEQ ID NO.17)
人干扰素α2b基因片段的PCR扩增：
PCR反应体系：
10×pfu Buffer(含Mg2+15mM)                       5μL
dNTP(各2.5mM)                                    5μL
上游引物ES(20ng/μL)                              2μL
下游引物HX(20ng/μL)                              2μL
引物A1～A8(20ng/μL)                              各0.2μL
超纯水                                           33.9μL
pfu酶(5U/μL)                                     0.5μL
反应条件：95℃，5min；95℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min，4℃保存。电泳验证PCR结果(见图1，泳道1为500bp左右)，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号rh-mIFN-1(序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)，4℃保存。
实施例2
一种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。步骤为：
利用大引物扩增方法对第52、53、55位氨基酸进行定点突变，同时设计下游引物HX2突变161位氨基酸，从而获得重组干扰素序列rh-mIFN-2(序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列)；
突变引物设计：(波浪线为突变位点)
Mut2(5’---3’)：TTC ATG CAG CAC  AAT  CGC TTT CTG(SEQ IDNO.18)
设计下游引物：
HX2(直线为酶切位点)：GTC AAG CTT TTC TTT GCT ACG CAG  TTC(SEQID NO.19)
具体过程为：
第一轮反应体系(总体积为100μL)：以上游引物ES(SEQ ID NO.8)和突变引物Mut2(SEQ ID NO.18)为引物，以rh-mIFN-1(SEQ ID NO.1)序列为模板。
PCR反应条件：94℃，4min，1个循环；94℃，40s，60℃，30s，72℃，30s，共24个循环；72℃，5min，1个循环；
第一轮PCR反应结束后，向100μL的上述反应物中补加：
dNTP(各2.5mM)                            6μL
下游引物HX2(20ng/μL)                     2μL
pfu酶(5U/μL)                             1μL
PCR反应条件：94℃，40s，68℃，25s，72℃，1min，共10个循环；94℃，40s，55℃，25s，72℃，1min，共12个循环；72℃，延伸1min，PCR反应结束，电泳验证(见图2，图中泳道1为.第一轮PCR产物；泳道2为.第二轮PCR产物)，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号rh-mIFN-2(序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列)，4℃保存。
实施例3
一种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。
步骤为：
在获得rh-mIFN-2目标片段后，再以此序列为模板，采用大引物方法，对103、107位氨基酸进行定点突变，从而获得目标序列rh-mIFN-3(序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列)；
突变引物如下：
Mut3(5’---3’)：CAG CGG GGT TTC  CAC GCC CAC  CTG AAT CAC GCA(SEQ ID NO.20)；
进行PCR，得到产物，电泳验证(见图3，图中泳道1为第一轮PCR产物；泳道2为第二轮PCR产物)采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，获得编号rh-mIFN-3(序列表SEQID NO.4所述的核苷酸序列)，4℃保存。
实施例4
一种重组人干扰素α2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
步骤为：
(1)采用重叠延伸PCR定点突变方法对第132位氨基酸进行定点突变，从而获得重组干扰素序列rh-mIFN-4，两条突变引物如下：
Mut132F：GCT ATA TTT TTT TTC  CAG ATA CAG(SEQ ID NO.21)
Mut132R：ACC CTG TAT CTG  GAA AAA AAA TAT(SEQ ID NO.22)
重叠延伸需要进行两轮三次PCR反应，具体步骤如下：
大片段PCR反应体系：
10×pfu Buffer(含Mg2+15mM)                         10μL
dNTP(各2.5mM)                                      8μL
上游引物ES(20ng/μL)                                2μL
突变引物Mut132F(20ng/μL)                           2μL
模板DNA rh-mIFN-3(15ng/μL)                         2μL
超纯水                                             75μL
pfu酶(5U/μL)                                       1μL
大片段PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1min，60℃，1min，72℃，1min，20个循环；72℃，延伸5min，4℃保存。电泳验证PCR结果，采用采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号CYL-B1，4℃保存；
小片段的PCR反应体系：
10×pfu Buffer(含Mg2+15mM)                        10μL
dNTP(各2.5mM)                                     8μL
下游引物HX2(20ng/μL)                              2μL
突变引物Mut132R(20ng/μL)                          2μL
模板DNA rh-mIFN-3(15ng/μL)                        2μL
超纯水                                            75μL
pfu酶(5U/μL)                                      1μL
PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1min，55℃，25s，72℃，30s，20个循环；72℃，延伸5min，4℃保存。电泳验证PCR结果，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号CYL-S1，4℃保存；
配制反应体系(总体积为100μL)：以扩增序列正确的基因为模板，取1支洁净的微量离心管，依次加入：
10×pfu Buffer(含Mg2+15mM)                               10μL
dNTP(各2.5mM)                                            8μL
上游引物ES(20ng/μL)                                      2μL
下游引物HX2(20ng/μL)                2μL
CYL-B1                              1μL
CYL-S1                              1μL
超纯水                              75μL
pfu酶(5U/μL)                        1μL
PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。电泳验证，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号rh-mIFN-4，4℃保存；
(2)rh-mIFN-5113位进行定点突变
以rh-mIFN-4为模板，两条突变引物设计如下：
Mut113F：AAT GCT ATC TTC  CAT CAG CGG(SEQ ID NO.23)
Mut113R：ACC CCG CTG ATG AAC GAA GAT AGC(SEQ ID NO.24)
PCR过程如步骤(1)，得到rh-mIFN-5；
(3)rh-mIFN-6 121位进行定点突变
以rh-mIFN-5为模板，突变引物设计如下：
Mut121F：CTG AAA ATA TTT  CAC GGC CAG AAT(SEQ ID NO.25)
Mut121R：ATT CTG GCC GTG  AAA TAT TTT CAG(SEQ ID NO.26)
PCR过程如步骤(1)，得到rh-mIFN-6；
(4)rh-mIFN-7 125位进行定点突变
以rh-mIFN-6为模板，突变引物设计如下：
Mut125F：CAG GGT GAT GCG  AAA ATA TTT TTT CAC(SEQ ID NO.27)
Mut125R：AAA AAA TAT TTT  CGC ATC ACC CTG(SEQ ID NO.28)
PCR过程如步骤(1)获得了一种重组人干扰素α2b DNA片段rh-mIFN-7，是序列表SEQIDNO.6所述的核苷酸序列。(见图4，图中泳道1为小片段；泳道2为大片段；泳道3为重叠延伸产物rh-mIFN-7)。
实施例5
含有序列表SEQ ID NO.2的重组人干扰素α2bDNA片段的质粒
(pBPE172-rh-mIFN-2)的构建：
根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计两条引物，分别引入酶切位点XbaI和EcoRI，以大肠杆菌DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物EcolC1958，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，纯化酶切产物，连接，构建载体pBPE172；
将PCR所获得的重组干扰素rh-mIFN-2基因片段用EcoRI和HindIII双酶切，反应体系为EcoRI和HindIII各1μl，DNA产物10μl，10×M Buffer 2μl，无菌水补足20μl，37℃反应3h，反应产物用EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit Cat纯化(纯化步骤依照试剂盒说明依步操作)。同样，用EcoRI和HindIII双酶切pBPE172质粒，纯化酶切产物。
将pBPE172酶切片段与重组干扰素rh-mIFN-2基因片段进行琼脂糖电泳，估测浓度后，按3：1摩尔浓度混合，加入等体积DNA Ligation Kit Ver 2.0连接酶，16℃连接1h。
将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入400μl LB液体培养基(不含Amp)，37℃摇床静置50min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200μl，均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，第二天挑单菌落，用碱法提取质粒进行双酶切验证，最后经测序正确即为表达质粒pBPE172-rh-mIFN-2。
实施例6
含有序列表SEQ ID NO.4的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒
(pBPE172-rh-mIFN-3)的构建。步骤同实施例5。
实施例7
含有序列表SEQ ID NO.6的重组人干扰素α2b DNA片段的质粒(pBPE172-rh-mIFN-7)的构建。步骤同实施例5。见图5。
实施例8
表达载体也可以选pET 43.1a替代实施例5中的pBPE172，构建出表达载体pET43.1a-rh-mIFN-2。
实施例9
表达载体也可以选pET 43.1a替代实施例6中的pBPE172，构建出表达载体pET43.1a-rh-mIFN-3。
实施例10
表达载体也可以选pET 43.1a替代实施例7中的pBPE172，构建出表达载体pET43.1a-rh-mIFN-7。
见图6，图中，泳道6为pET 43.1a-rh-mIFN-2，泳道8为pET 43.1a-rh-mIFN-3，泳道22为pET 43.1a-rh-mIFN-7。
实施例11
重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质(序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)的制备。
a、重组人干扰素α2b的分离纯化：
(1)诱导表达：
将正确重组的pBPE172-rh-mIFN-2、pBPE172-rh-mIFN-3和pBPE172-rh-mIFN-7质粒分别转化表达菌株E.coli.BL21感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，37℃静置45min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200μl，均匀涂布在含有抗生物的LB固体培养基上，37℃培养过夜，做为种子菌。
(2)菌体收获
将种子菌接入5ml LB液体培养基中(含氯霉素和氨苄青霉素)，37℃过夜复苏。然后将复苏的菌液按1：100接种于50ml LB液体培养基中(含氯霉素和氨苄青霉素)，37℃培养OD600为0.5—0.6，加入1mM IPTG诱导培养，30℃诱导表达5h。用冷冻离心机8000rpm、4℃下离心10min，收集菌体。
(3)超声破菌
将收集的菌体用1/10体积的PBS(pH8.0)悬浮，置冰上，用超声裂解，采用功率水平为6～7，超10s，停10s，共30次。当裂解液粘度变小，基本澄清时，说明菌体已经基本破碎。基本破碎后，将破碎液在12000rpm，4℃离心10min，收集上清和沉淀，沉淀用等体积PBS悬浮，冷冻保存，SDS-PAGE电泳分析。
(4)SDS-PAGE电泳分析
按照以下步骤进行电泳：
样品处理
取适量体积的各部分样品，包括诱导前和诱导后的菌体、超声后上清和沉淀，加入1/5体积的5×SDS电泳缓冲液。100℃水浴加热10min使蛋白充分变性。
凝胶配制
12％分离胶的配制：4ml A液、3.5ml B液、2.5ml超纯水，50μL10％过硫酸胺，5μLTEMED。
4×浓缩胶配制：0.67ml A液、1ml C液、2.3ml超纯水、30μL10％过硫酸铵、5μL TEMED。
加入TEMED后，立即混匀，灌胶。
上样
当PAGE胶凝固后，电泳槽内加入电泳缓冲液，上样。
电泳
电泳时先用较低电压，先150V，待样品进入分离胶后，电压提高到180V，直至溴酚蓝至胶的底部为止。
染色
电泳完毕后，剥离分离胶，立即泡入考马斯亮蓝染色液中，摇床上缓慢摇30min，然后更换脱色液冲洗两次，每次约45min，染色后扫描，确认有目标条带，以标准Marker做参照估算特异性产物(序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)的表达量及其在菌体总蛋白中的比例。
(5)上清过柱纯化：
将树脂加入层析柱中，结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠；500mmol/L氯化钠；pH7.8)引流到顶部，使树脂沉淀至底部。将获得的细胞裂解液上清上柱，调整流速为每小时10个柱体积，约3～4秒一滴。用6倍柱体积的结合缓冲液洗柱。用洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸钠；500mmol/L氯化钠；pH6.0)洗柱，直至流出液280nm下的吸光值小于0.01，大约为20倍柱体积的缓冲液。用6个柱体积的100mmol/L的咪唑洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠；500mmol/L氯化钠；100mmol/L咪唑；pH7.8)，洗脱结合的蛋白。分步收集蛋白，每份1ml，检测280nm下的吸光值。
b、重组人干扰素α2b的发酵优化：
(1)诱导温度的优化
在3个250ml摇瓶中(含50ml LB液体培养基)分别接种表达菌，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度1mM的IPTG诱导，分别在25℃、30℃、37℃诱导，继续培养5小时，取出摇瓶，用冷冻离心机在8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，取样分析。
(2)诱导时间的优化
按上述方法接种表达菌，37℃摇瓶培养至OD600为0.6左右时，加入1mM的IPTG，在30℃下诱导，分别在1h、2h、3h、4h和5h取样电泳，分析不同诱导时间对蛋白表达量的影响。
(3)诱导剂浓度的确定
按上述方法接种表达菌，37℃摇瓶培养至OD600为0.6左右时，加入0.1mM、0.5mM、1mM的IPTG，在30℃下诱导，取样电泳，分析不同诱导剂浓度对蛋白表达量的影响。结论：
从诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度进行优化，初步确定发酵表达条件为30℃，IPTG浓度为1mM，诱导5h。
(也可以用pET 43.1a-rh-mIFN-2替代pBPE172-rh-mIFN-2、pET 43.1a-rh-mIFN-3替代pBPE172-rh-mIFN-3、pET 43.1a-rh-mIFN-7替代pBPE172-rh-mIFN-7进行诱导表达)
实施例12
本发明制备的重组人干扰素α2b活性的测定
(1)抗病毒活性检测：
以WISH细胞/VSV系统进行抗病毒活性检测，按标准方法计算其抗病毒活性。
结果为：
人天然干扰素为1.0×108IU/mg。本发明所制备的三种重组人干扰素α2b(序列表SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)的活性分别为8.0×108IU/mg、3.0×109IU/mg、5×109IU/mg，其抗病毒活性分别是人天然干扰素的8倍、30倍和50倍。
(2)抗肿瘤活性检测：
以A549细胞作为靶细胞，用MTT法检测本发明所制备的三种重组人干扰素α2b(序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)的抗肿瘤活性，以A549细胞作为靶细胞，以人天然干扰素作为对照。
结果为：以相同活性(抗病毒)的人天然干扰素与α2b衡量它的抗增殖活性，本发明所制备的三种重组人干扰素α2b与人天然干扰素相比，都具有较高的抗增殖活性。
序列表
<110>天津大学
<120>重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质
<160>28
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>PRT
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<222>(1)…(27)
<400>28