抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体、其制备方法及用途.pdf

本发明公开了抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体，还公开了该抗体的人源化改构体。上述抗体通过以下方法制备：首先通过分子生物学或其它方法制备抗体的CDR区或可变区或IgG部分或全基因，在原核细胞如大肠杆菌等，真核细胞如酵母菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞如CHO等中表达，经过纯化获得本发明的抗体。本发明的抗体具有特异中和活性强、亲和力高的特点，人源化抗体更具有毒副作用小的特点，适用于B型肉毒神经毒素中毒的急救治疗，同时适用于B型肉毒神经毒素的检测，具有良好的应用前景。

权利要求书
1.  抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体，其特征在于重链和轻链的可变区分别具有如序列表中序列2和序列4所示的氨基酸序列。

2.  根据权利要求1所述的抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体，其特征在于重链和轻链的可变区编码基因分别具有如序列表中序列1和序列3所示的核苷酸序列。

3.  权利要求1或2所述抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体的人源化改构体，其特征在于重链和轻链的可变区分别具有如序列表中序列6和序列8所示的氨基酸序列。

4.  根据权利要求3所述的人源化改构体，其特征在于重链和轻链的可变区编码基因分别具有如序列表中序列5和序列7所示的核苷酸序列。

5.  权利要求1-4任一所述抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体或其人源化改构体的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体或其人源化改构体编码基因，包括CDR区或可变区或IgG部分或全基因；
(2)将该基因克隆入原核或真核表达载体，制备重组表达质粒；
(3)将制备的重组表达质粒分别转入原核细胞或真核细胞中进行表达。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其中制备抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体或其人源化改构体编码基因采用化学合成或基因工程方法。

7.  根据权利要求5所述的制备方法，其中真核表达载体为酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞表达载体；原核细胞是大肠杆菌，真核细胞是酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

8.  根据权利要求5或7所述的制备方法，其中原核表达载体为pCANTAB-5E或pET系列，真核表达载体为pPIC系列、pEF1或pTriEx；大肠杆菌为HB2151或BL21(DE3)，真核细胞是GS115或CHO。

9.  权利要求1-4任一所述制备抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体或人源化改构体在制备B型肉毒神经毒素中毒预防或治疗药剂中的用途。

10.  权利要求1-4任一所述制备抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体或人源化改构体在制备B型肉毒神经毒素检测试剂中的用途。

说明书抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种抗毒素单克隆抗体，具体涉及一种抗肉毒神经毒素的中和性单克隆抗体，还涉及该抗体的制备方法与用途。
背景技术
肉毒神经毒素(Clostridium Botulinum Neurotoxins，BN，简称肉毒毒素)是一组已知毒力最强的蛋白质(包括A-G型)。当肉毒毒素从污染食品或经感染进入人体循环后，通过阻断神经递质乙酰胆碱(兴奋性突触递质)在神经肌肉接头的释放，引起严重的神经失调和进行性神经肌肉麻痹的肉毒中毒症状，造成骨骼肌无力和延髓麻痹，严重的最终出现呼吸衰竭、心跳停止而导致死亡。引起人类中毒的主要是A、B、E型。病例统计表明，而B型肉毒毒素是我国肉毒中毒的最常见血清型。
应用抗毒素提供被动免疫在毒素中毒的预防和治疗中能起到有效的保护作用。目前，临床特异性治疗肉毒中毒主要是使用肉毒多价抗毒素—马血清。马血清来源的多克隆抗毒素(HIG)已用于80％以上肉毒中毒病人的治疗。多克隆抗毒素可识别大量的不同表位，可以保证一小部分保护性抗体的存在。1984年Tacket CO报道马抗的应用，在暴露于肉毒毒素前和暴露后24小时内使用马抗体也是有效的。但是，使用马抗有明显的副作用，Black RE报道临床治疗中约有9％病例出现血清病和过敏性反应(Black RE，Gunn RA.Hypersensitivity reactions associated with botulinal antitoxin.Am J Med 1980；69:567-570)。这种异源性产生的强免疫排斥反应和血清病等严重限制了马血清抗毒素的临床应用。为了避免和克服这些副作用，人们从志愿免疫献血者的血清中制备人免疫球蛋白(human BIG)(Gelzleichter TR，Myers MA，MentonRG，et al.Protection against botulinum toxins provided by passive immunizationwith botulinum human immune globulin J Appl Toxicol.1999Dec；19Suppl1:S35-8)，主要用于婴儿肉毒中毒的治疗。然而人免疫球蛋白的应用仍存在很多问题，主要包括潜在血源感染疾病的传播、制品有效性和特异性差异，以及制品的献血者来源不足等，这些问题制约了它的应用。而人们常常忽视的潜在问题是，为满足生产人免疫球蛋白的需要而进行肉毒类毒素免疫的志愿者，将会失去用肉毒毒素治疗多种神经调节障碍疾病的机会和权利。因此，目前的研究重点转向了新型抗毒素的制备。Hc是肉毒毒素的受体结合区，含中和表位，该位点在不同血清型毒素中是高度特异的。因此成为抗体研究针对靶标。
鼠源单克隆抗体是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，其制备包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化以及单克隆抗体的大量生产。2001年Pless DD等制备了针对A型肉毒毒素Hc片段的鼠单克隆抗体，SPR分析抗体解离常数范围为0.06-0.9nM，表位绘图分析显示，这些鼠源单抗结合到Hc片段的至少两个不同区域。2004年Yang GH等用不含毒性成分的B型肉毒毒素类毒素免疫制备获得了一株针对Hc片段的具有毒素中和活性的鼠单抗BTBH-N1，报道称10μg可以有效中和20LD50的B型毒素；Bavari Sina等制备了针对A型肉毒毒素的鼠单克隆抗体，可潜在应用于毒素的检测及治疗，并对其申请了专利(UnitedStates Patent Application No.20060177881)；Marks，James D等通过噬菌体文库筛选获得了针对A型肉毒毒素的鼠源中和抗体，并对其申请了专利(UnitedStates Patent Application No.20040175385)。但是，研究相关报告显示，单一抗体克隆对肉毒毒素中毒的治疗作用有限，因此促使人们寻找更多更为有效的单克隆抗体，以发展单克隆抗体的鸡尾酒治疗策略。
近年来分子生物学的发展，特别是文库技术的成熟大大推动了抗体基因工程的发展，在特异单克隆抗体的通量筛选方面具有明显的技术优势，特别是从特异性免疫的抗体库中可以比较容易的得到高亲和力抗体。免疫库的抗体基因来自免疫后个体的免疫球蛋白mRNA，因此，在免疫库中，针对某种抗原的抗体基因可能是富集的或经亲和力成熟的，容易得到高亲和力特异抗体克隆。2002年Peter等从噬菌体天然抗体文库和BoNT/A噬菌体免疫文库中筛选抗BoNT/A-Hc抗体，结果显示免疫文库获得的抗体可识别并结合两个不同的表位I和II，结合I的ScFv具有毒素中和活性(Amersdorfer P，Wong C，Smith T，et al，Genetic and immunological comparison of anti-botulinum typeA antibodies from immune and non-immune human phage libraries.Vaccine.2002Feb22；20(11-12)：1640-1648.)。免疫抗体文库的抗体谱范围决定可筛选特异抗体的多样性和中和活性，因此抗体文库构建所选用的免疫抗原要具有很强的中和抗体诱导能力。前期研究和文献报道均显示，B型肉毒神经毒素的重链C片段蛋白是保护性抗原，可以诱导机体的完全的免疫保护(杨秀清等，B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究，生物技术通讯，2005，16:147-149)，是制备中和抗体的优选靶抗原，可以应用于抗体免疫文库的构建和单克隆抗体基因的筛选。
肉毒毒素中毒具有突发性，在中毒初期使用抗毒素有效，因此不会象肿瘤抗体治疗时反复使用抗体制剂，因此鼠源性单抗具有应用于肉毒毒素中毒治疗的可行性。但是，为了进一步减少使用鼠源抗体进行治疗所潜在的异种蛋白变态反应风险，提供人源化技术策略更为安全。目前，鼠单抗的人源化改造，可将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生CDR移植的人源化抗体，或者根据抗体蛋白结构解析进行抗原性氨基酸突变、表面重塑，以及构建鼠—人嵌合抗体等。
发明内容
针对现有肉毒毒素中毒治疗用抗毒素制品的缺陷，本发明提供了鼠源抗B型肉毒神经毒素中和性抗体MuBNbP8，该抗体的重链和轻链的可变区分别具有如序列表中序列2和序列4所示的氨基酸序列，其编码基因分别具有如序列表中序列1和序列3所示的核苷酸序列。
针对鼠源抗体的异源性问题，本发明还提供了上述抗体的人源化改构体，即人源化抗B型肉毒神经毒素中和性抗体HuBNbP8，该抗体重链和轻链的可变区具有如序列表中序列6和序列8所示的氨基酸序列，其编码基因具有如序列表中序列5和序列7所示的核苷酸序列。
本发明的抗B型肉毒神经毒素中和性抗体，还包括对上述鼠源和人源化抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成的，具有相同功能的抗体。
本发明的鼠源和人源化抗B型肉毒神经毒素中和性抗体具有特异中和活性强、亲和力高的特点，人源化抗体更具有低毒副作用的特点，可发展为B型肉毒神经毒素中毒的紧急治疗制剂，不仅可以消除抗抗毒素马血清易引起的过敏反应，而且可以克服人抗毒素免疫球蛋白存在的潜在病毒污染的问题，具有良好的应用前景。
本发明同时提供了抗B型肉毒神经毒素中和性抗体MuBNbP8和HuBNbP8的制备方法。首先是制备MuBNbP8和HuBNbP8编码基因(如CDR区或可变区或IgG部分或全基因)，可以采用化学合成或基因工程例如PCR方法，然后将该基因克隆入原核或真核表达载体，如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞表达载体等，制备重组表达载体，其中原核表达载体可以为pCANTAB-5E、pET系列等，酵母表达载体可以为pPIC系列，哺乳细胞表达载体可以为pEF1、pTriEx等。然后将制备的重组表达载体分别转入宿主细胞如大肠杆菌、酵母菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞等中进行表达，其中大肠杆菌可以为HB2151、BL21(DE3)等、酵母为GS115等、哺乳动物细胞为CHO等。将表达产物纯化获得抗B型肉毒神经毒素基因工程抗体。
本发明的抗B型肉毒神经毒素中和性抗体MuBNbP8基因是通过以下方法进行筛选的。首先重组制备B型肉毒受体结合区Hc蛋白(BHc)，制备福氏佐剂疫苗，免疫Balb/C小鼠，从外周血淋巴细胞中分离、克隆抗体重、轻链可变区基因(VH和VK)，构建鼠源噬菌体抗体免疫文库，比较容易地用B型肉毒毒素靶抗原，采用酶联板固相抗原捕获法，筛选噬菌体阳性克隆，进而获得具有特异中和活性、高亲和力的MuBNbP8基因。在实施本发明时，该基因或基因片段可以通过本领域已知的技术进行化学合成或通过PCR等生物学方法进行制备。
本发明的huBNbP8基因是通过以下方法获得的。人源化抗B型肉毒神经毒素中和性抗体HuBNbP8是在鼠源母本抗体MuBNbP8的基础上改构而成，通过生物信息学对鼠源抗体MuBNbP8进行分子模建，结合同源性结构分析，应用分子生物学技术对抗体可变区结构表面的抗原特征性氨基酸进行点突变，构建人源化抗体克隆huBNbP8。其中，突变位点均在抗体可变区的框架区(FWR)，不干扰CDR结构。人源化抗体HuBNbP8的抗原结合特异性没有改变，保持了母本抗体MuBNbP8的生物学活性。在此基础上，可以进一步利用人源化的可变区结构获得人源化全分子抗体或其他改型抗体或衍生物，更加适合于应用。在实施本发明时，该抗体基因或基因片段可以通过本领域已知的技术进行化学合成或基因突变、基因拼接等分子生物学方法进行制备。可以在大肠杆菌、酵母菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞等中进行表达，经过纯化获得均质的人源化抗体蛋白，这种产品免疫原性低和毒副作用小，具有更高的安全性。
本发明同时提供了抗B型肉毒神经毒素中和性抗体在B型肉毒神经毒素检测和肉毒中毒紧急预防和治疗中的用途。在实验中，MuBNbP8和HuBNbP的重组抗体蛋白均能与B型肉毒神经毒素抗原特异结合，而与A型、E型、F型等其它血清型肉毒毒素不发生结合，表现为靶抗原的特异选择性。本发明的抗体针对现有治疗性抗B型肉毒马抗，具有明显的竞争性的靶抗原结合活性。HuBNbP对靶抗原的亲和力高(1.34nM)，结合力强，具有很强的结合稳定性和靶向结合能力。基因工程技术制备的抗B型肉毒神经毒素中和性抗体，可以在体内有效中和毒素，抑制毒素所引起的神经毒效应，具有被动免疫保护作用，可以保护小鼠逃避致死量(5LD50)B型肉毒神经毒素的攻击，起到紧急预防和治疗的作用。本发明的抗体对机体无毒性，使用更为安全、有效，作用机理明确。本发明的抗体可以用于B型肉毒神经毒素中毒预防和治疗以及B型肉毒神经毒素检测。
本发明针对目前抗血清产品存在的缺陷，为满足研制新一代人源化抗体的需求，提供了一种全新的特异性、高亲和力抗B型肉毒神经毒素中和性抗体，还提供了该抗体的编码基因，并应用基因工程技术进一步设计构建了以Fv(可变区)为基础的人源化抗体改构体，并通过体内外生物学活性研究进行了证实。本发明还公开了上述抗体的制备方法。本发明的抗B型肉毒神经毒素中和抗体具有特异性强、亲和力高、稳定性好的特点，而其人源化抗体更具有免疫原性低的特点。作为血源性免疫球蛋白的替换品，有很多优点：其有效成分明确，为抗B型肉毒神经毒素中和性抗体；特异性高，针对B型肉毒神经毒素的受体结合区(BHc)；低免疫原性，人源化蛋白结构；能够不限量的生产，可基因工程化制备放大。本发明的抗B型肉毒神经毒素中和性抗体可以发展为肉毒中毒的紧急预防和治疗药物和B型肉毒神经毒素的特异检测抗体，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为提取鼠脾淋巴细胞总RNA产物的琼脂糖电泳图谱。
图2为鼠抗体VH和VL基因扩增图谱：A图为VH家族基因扩增产物的琼脂糖电泳；B图为VL家族基因扩增产物的琼脂糖电泳。其中M为DNA分子量标准DL2000；1-6泳道为VH家族基因或VL家族基因的PCR产物。
图3为组装的鼠单链抗体(ScFv)基因库，重链与轻链基因拼接产物的琼脂糖电泳图谱，其中M为DNA分子量标准DL2000；1-6泳道为组装ScFv的PCR产物。
图4为鼠源(MuBNbP8)和人源化抗B型肉毒毒素抗体(HuBNbP8)的重组构建与表达鉴定图谱，其中1泳道为MuBNbP8克隆诱导后；2泳道为HuBNbP8诱导后；M为低分子量蛋白标准；3泳道为MuBNbP8诱导前；4泳道为诱导前突变后。
图5为人源化抗B型肉毒毒素抗体(HuBNbP8)的单链抗体融合蛋白的纯化制备的Native-PAGE电泳及Western blot鉴定图谱，其中1泳道为纯化的HuBNbP8克隆的单链抗体融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；2泳道为相应蛋白的Western blot图谱；M为低分子量蛋白标准。
图6为鼠源(MuBNbP8)和人源化抗B型肉毒毒素抗体(HuBNbP8)的抗原结合特异性，其中A型、B型、E型、F型肉毒神经毒素分别表示为type A，type B，type E和type F。
图7为人源化抗B型肉毒毒素抗体(HuBNbP8)的抗原结合动力学曲线(Biacore测定)，其中从上到下曲线的浓度由高至低分别为58.8，29.4，14.7，7.35，3.6725nM。
图8为人源化抗B型肉毒毒素抗体(HuBNbP8)与抗B型肉毒神经毒素马抗竞争结合B型肉毒毒素曲线。
具体实施方式
实施例1鼠源抗B型肉毒神经毒素噬菌体免疫文库的构建与筛选
一、材料：
1.菌株：辅助噬菌体M13K07购自Biolab公司；宿主菌E.coli TG1为Pharmacia公司产品。
2.试剂：NotI、SfiI等限制性内切酶均为Promega公司产品；FicollPlus Pague和anti M13-HRP为Pharmacia产品；总RNA提取试剂盒、RT逆转录试剂盒、PCR扩增试剂为TAKARA公司产品；BSA(牛血清白蛋白组分V)为GIBCO公司产品；DEPC、羧苄青霉素、四环素和硫酸卡那霉素购自SIGMA公司。
3.载体：噬菌体载体pCANTAB-5E为Pharmacia公司产品。
二、方法结果：
1.B型肉毒毒素受体结合区Hc蛋白(BHc)的重组制备及动物免疫
1.1B型肉毒毒素受体结合区Hc蛋白(BHc)的重组制备
以pET22b为表达载体，在大肠杆菌中重组表达(BHc)蛋白，表达产物经Ni柱亲和纯化至纯度为>90％，以此为免疫原蛋白。
1.2动物免疫
将免疫原蛋白与完全福氏佐剂混合制备后，对Balb/C小鼠进行首次免疫，然后每隔2周进行加强免疫(其中以不完全福氏佐剂替换完全福氏佐剂)，共免疫4次。
2.鼠源抗B型肉毒毒素噬菌体免疫文库的构建
2.1噬菌体免疫文库构建的引物设计，参见文献报道(Essono et al.，Ageneral method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify theviariable regeions from immunoglobulin cDNA，J Immuno Meth2003，279：251-266)等，设计的系列引物由上海博亚公司合成。
2.2淋巴细胞的分离和细胞总RNA的提取
收取抗凝血40ml，以20ml Ficoll离心分离乳白色淋巴细胞层，用PBS洗3次，2000rpm，5min，5.8×107细胞悬浮至终体积为1ml。参见试剂盒操作说明(Modified RNAgents Total RNA Isolation protocols)提取细胞总RNA20μg，结果见附图1。
2.3cDNA的合成
参见TAKARA试剂盒(BcaBESTTM RNA PCR KIT Ver1.1)操作说明。以纯化的总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，RT反应条件为：30℃ 10分钟、42℃ 30分钟、99℃ 5分钟、5℃ 5分钟。
2.4PCR扩增抗体可变区VH和VL基因
以2μl cDNA为模板，PCR反应系统中添加1.6mmol/L MgCl2，1mmol/L dNTP，加入2.5U的Tag酶，热启动，减少非特异性反应。PCR条件为：94℃ 30秒、57℃ 50秒、72℃ 60秒行25个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增目的产物Vh1-6和VL1-6进行纯化，大小为300-400bp，结果见附图2。
2.5ScFv单链抗体基因的组装(splicing overlap extension，SOE)
分别测定VH链、VL链及Linker DNA相对的量，进行等摩尔混合，通过PCR进行组装。首先无引物拼接，94℃ 5分钟后，加入0.5μl(2.5U)Tag聚合酶，进行20个循环反应，94℃ 1分钟，54℃ 2分钟，72℃ 3分钟，最后72℃延伸10分钟。然后进行有引物扩增，在ScFv的5’和3’端引入限制性内切酶位点Sfi I/Not I，进行30轮PCR循环：94℃ 1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟。最后72℃延伸10分钟。PCR产物大小约为750bp，结果见附图3。
2.6重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建
2.6.1 ScFv克隆入噬菌体载体
pCANTAB-5E是Pharmacia公司商业化载体，按常规方法从带有质粒DNA的TGl菌中提取和纯化载体DNA。用Sfi I和Not I双酶切消化ScFv的PCR产物和载体pCANTAB-5E并分别纯化。然后将ScFv单链基因通过连接反应克隆入pCANTAB-5E载体。
2.6.2 重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建
将连接产物电转化200μl事先制备的TGl电转致敏菌，电转设置为:2500V，电击30秒。电转后加入5-10ml 2×YT-G(含2％葡萄糖)，37℃振荡培养1小时。将重组转化菌10μl涂含2％葡萄糖的2×YT—氨苄平皿，30℃培养过夜。通过计算菌落检测库容量为1.6×108。
3.抗B型肉毒神经毒素噬菌体阳性克隆的筛选
3.1单链噬菌体抗体库的富集筛选
噬菌体文库经过M13KO7超感染后，产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中，用于噬菌体阳性克隆的筛选。噬菌体单链抗体库的富集筛选选择微量孔板筛选方法，将毒素抗原包被96孔板，然后进行吸附-洗脱-富集的四轮筛选过程，富集倍数达110倍。
3.2噬菌体阳性克隆的序列分析
对挑选的噬菌体阳性克隆MuBNbP8进行测序，获得其编码基因的核苷酸序列。与Kabat数据库中已知基因序列比较，确定家族定位；推导获得抗体基因编码的氨基酸序列，结果显示，抗B型肉毒神经毒素抗体克隆MuBNbP8的VH编码基因长363bp，如序列表中序列1所示，编码121个氨基酸，如序列表中序列2所示，属于鼠重链IgG VH族；VL编码基因长336bp，如序列表中序列3所示，编码112个氨基酸，如序列表中序列4所示，属于K chain家族。Kabat和Genbank数据库检索分析结果表明，它们均为首次发现的免疫球蛋白可变区基因，是一株新发现的抗B型肉毒神经毒素抗体基因。VL基因与VH基因之间由编码(Gly4Ser)3的DNA Linker正确连接而构成ScFv结构。抗体的VH与VL通过不同方式进行结构组合和重构，可构建获得一系列功能抗体变构体，如单链抗体(ScFv)、二硫键稳定型抗体(dsFv)、单链二硫键稳定型抗体(ScdsFv)、双体(diabody)、Fab抗体片段、多结构域抗体或是全分子抗体等等。
实施例2  人源化抗B型肉毒神经毒素抗体克隆的构建
一、材料：
1.菌株：宿主菌E.coli DH5a为Novagen公司产品。
2.试剂：PCR扩增试剂为TAKARA公司产品。
3.载体：pMD18-T载体为TaKaRa公司产品，
二、方法结果：
1.MuBNbP8基因突变
利用GenBank中的Blast检索数据库输入MuBNbP8抗体序列与人源抗体作同源比对，确定保守残基。同时利用计算机辅助设计确定鼠源抗体进行人源化改造的位点，其原则为改造的残基位于抗体分子的表面，且残基替换不影响抗体与抗原结合的空间部位。根据同源比对及计算机辅助设计确定突变位点为：重链的K4→Q4，Q6→V6，L12→V12，S77→A77和轻链的D17→E17。以MuBNbP8的Fv基因为模板，采用突变引物设计，扩增突变体基因，并连接T载体测序分析。
2.HuBNbP8基因的序列分析
突变体基因分析表明，分别在重链和轻链的框架区成功的定点引入了突变，突变氨基酸包括重链的AAA→CAA，CAG→GTG，CTG→GTG，TCC→GCC，如序列表中序列5所示，轻链的GAT→GAA，如序列表中序列7所示，其它基因序列保持不变，通过基因突变构建的人源化抗体克隆重链和轻链的可变区的编码序列如序列表中序列6和序列8所示。
实施例3  鼠源和人源化抗B型肉毒毒素基因工程抗体的重组制备
一、材料：
1.菌株：宿主菌E.coli ER2566，TB1，DH5a为New England Biolab(NEB)公司产品；E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品。
2.试剂：Amylose亲和层析柱、抗MBP酶标单抗购自NEB公司；PCR扩增试剂为TAKARA公司产品；质粒小量提取试剂盒购自天根公司，T4连接酶，限制性内切酶为NEB公司产品；DL2000，DNA分子量标准及中低分子量蛋白标准为天根公司产品；羧苄青霉素购自SIGMA公司。
3.载体：重组表达载体pMAL-C2X为NEB公司产品。
二、方法结果：
1.MuBNbP8和HuBNbP8的重组制备
1.1 重组表达质粒的构建
提取质粒pMAL-C2X，用EcoR I及HindIII双酶切并回收载体片段。分别以MuBNbP8和HuBNbP8克隆的Fv基因为模板，通过引物设计和PCR扩增获得引入EcoR I及HindIII酶切位点的目的基因Fv产物，双酶切消化后连接入已处理的载体片段，测序验证已成功构建表达质粒pMAL-MuFv和pMAL-HuFv。
1.1MuBNbP8和HuBNbP8在大肠杆菌中的可溶表达
以pMal-C2X为载体构建的重组表达质粒pMAL-MuFv、pMAL-HuFv及空载体分别转化大肠杆菌ER2566，PCR鉴定挑选重组工程菌株。进行诱导表达：过夜活化的工程菌转接于LB+葡萄糖-Amp培养基中，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.3mmol/L诱导4小时可达到表达水平的平台期，随后离心(4℃，6000rpm/min，6min)收集菌体。SDS-PAGE分析Fv的表达产物分子量约为66KDa，附图4显示与预期结果一致。薄层扫描分析显示，重组表达水平约为15％。表达蛋白定位分析表明，表达蛋白以可溶形式存在于胞内。
SDS-PAGE分析：取1ml诱导后的菌液，12000rpm离心2min，弃上清，菌体加入100μl上样缓冲液(10％蔗糖，2％SDS，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10％巯基乙醇，0.002％溴酚蓝)悬起沉淀，沸水中煮5分钟，12000rpm离心，取上清10μl电泳。对比空载体和重组质粒转化工程菌的蛋白条带，观察有无外源基因表达。
1.2 Fv抗体融合蛋白的纯化
利用表达产物N末端的MBP-tag，进行亲和层析纯化(纯化介质购自NEB公司)，将收集的洗脱蛋白进行NATIVE-PAGE和Western blot分析，见附图5，并进行蛋白定量。
具体纯化步骤为：
细胞粗提液的制备:将离心收集的菌体加入10ml过柱缓冲液悬浮菌体。在冰浴上超声破碎细胞(脉冲为15秒)，然后4℃ 12000rpm/min离心30分钟，收集上清。
融合抗体的亲和纯化:
1 预装柱用8-12倍柱床体积的双蒸水冲洗。
2 预装柱用9倍柱床体积过柱缓冲液平衡。
3 将超声上清液加入到柱床内，控制流速0.5-1ml/min。
4 用12倍柱床体积的洗脱缓冲液淋洗未结合蛋白，每次6ml，共4次。
5 用4倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱与Amylose树脂结合的MBP融合抗体蛋白，控制流速约0.5-1ml/min。收集3-5管样品洗脱液，收集体积为1ml/管。
6 SDS-PAGE 检测洗脱样品。
其中，Amylose亲和柱过柱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.4，200mM NaCl，1mM EDTA(添加剂：1mM sodium azide；10mM β-mercaotoethanol或1mMDTT)；洗脱缓冲液：过柱缓冲液+10mM麦芽糖
实施例4  抗B型肉毒毒素基因工程抗体的生物学活性分析
一、材料：
1.试剂：anti His-HRP为Pierce公司产品；BSA(牛血清白蛋白组分V)为GIBCO公司产品；硫氰酸氨购自北京生化试剂公司；抗B型肉毒神经毒素马抗购自中国药品生物制品鉴定所；亲和力测定用试剂如HBS溶液、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、N羟基琥珀亚胺(NHS)、乙醇胺均为Pharmacia公司产品。
2.材料：CM5芯片为Pharmacia公司产品；Balb/C小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
3.仪器：Biacore3000为GE公司产品。
三、方法结果：
1.抗B型肉毒神经毒素基因工程抗体的抗原结合活性
1.1 抗原结合活性的ELISA检测
用ELISA检测验证了MuBNbP8和HuBNbP8重组抗体只与B型毒素抗原特异结合，而与其它血清型肉毒毒素抗原如A型、E型、F型毒素抗原不结合，如附图6显示。利用高亲和力MuBNbP8和HuBNbP8的型特异性可以应用于B型肉毒神经毒素的分型检测。
1.2结合亲和力的Biacore检测
Biacore(Biomolecular Interaction Analysis)的工作原理是基于表面等离子共振传感(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术来实时追踪生物分子间的相互作用。实验时先将抗原固定在传感器芯片表面，再将待分析的抗体蛋白注射到传感器芯片表面，可检测抗体与抗原结合和解离的全过程，附图7就显示了HuBNbP8的基因重组表达产物(3.675nmol/L-58.8nmol/L)的动态结合曲线，测定的亲和力值可反应抗体的结合强度，是评价抗体应用性的重要指标。分析结果显示，HuBNbP8的亲和力为1.34×10-9M，属于高亲和力抗体。
抗B型肉毒神经毒素抗体的高亲和力和敏感性结合特点，更适合于B型肉毒神经毒素的特异的高敏感性检测。
2.人源化抗B型肉毒神经毒素基因工程抗体的竞争结合活性
ELISA：B型肉毒神经毒素抗原包被96孔，用3％BSA—PBS(含0.02％NaN3)封闭，分别将梯度浓度的HuBNbP8抗体(MBP融合蛋白)与同量抗B型肉毒神经毒素马抗混合后加入，以MBP蛋白为对照，37℃温育1小时，0.05％Tween20-PBS(PBST)和PBS分别洗板三次，加HRP标记的抗MBP抗体，37℃温育1h后，对TMB底物显色(5mg TMB，0.05mol/L NaHCO3，0.5mmol/L MgCl2)，酶标仪上读取A450。
结果表明，重组人源化抗体HuBNbP8蛋白在体外具有良好的特异结合活性，可有效竞争抗B型肉毒神经毒素马抗，与B型肉毒神经毒素发生特异结合效应，见附图8。
3.人源化抗B型肉毒神经毒素基因工程抗体的中和活性(动物保护实验)
攻毒组10只，以5LD50剂量的B型肉毒神经毒素注射的小鼠，48小时内全部死亡；抗体药物治疗组10只，以5LD50剂量的B型肉毒神经毒素与200μg抗体融合蛋白4℃温育过夜，腹腔注射动物，48小时内小鼠存活9只，96小时内存活6只，死亡小鼠的平均死亡时间也长于攻毒组动物5倍多，表明抗B型肉毒神经毒素单克隆抗体可以有效中和肉毒神经毒素，明显延迟毒素神经毒性的发生，对小鼠起到被动免疫保护作用；对照组MBP蛋白不具有毒素中和活性，小鼠全部死亡，死亡时间上与单独攻毒组无明显差别；抗体药物对照组5只，每只注射1mg抗体蛋白，动物全部存活并无异常，说明大剂量重组抗体蛋白无毒性，结果见附表1。
表1.HuBNbP8克隆的重组表达产物对BoNTb(5LD50)的体内中和活性

<110>  中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>  抗B型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体、其制备方法及用途
<130>
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<170>  PatentIn version 3.2
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