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1、(10)申请公布号 CN 102731398 A(43)申请公布日 2012.10.17CN102731398A*CN102731398A*(21)申请号 201110085389.0(22)申请日 2011.04.02C07D 221/18(2006.01)A61P 35/00(2006.01)(71)申请人中国科学院兰州化学物理研究所地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水中路18号(72)发明人柳军玺 邸多隆 魏小宁(74)专利代理机构兰州中科华西专利代理有限公司 62002代理人方晓佳(54) 发明名称一种具有抗癌活性异紫堇二酮的制备方法(57) 摘要本发明涉及一种具有抗癌活性化合物。
2、异紫堇二酮的提取分离制备方法，尤其指从秃疮花属植物中提取分离，属于天然产物分离提取制备技术领域，由原料采集加工、提取、分离纯化三个步骤完成。体外药理研究证明异紫堇二酮具有较好的抗癌活性，可以作为药物原料或药物开发。本发明扩大了异紫堇二酮分离提取制备的原料来源，有利于该化合物的药物开发，同时也有利于罂粟科植物天然产物化学的开发与应用研究。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页 附图1页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页1/1页21.一种具有抗癌活性异紫堇二酮的制备方法，其特征在于该方法有原料采集加工、提取、分离纯化三。
3、个步骤：A、原料采集加工：采集秃疮花属植物，干燥，粉碎；B、浸膏提取步骤：采用70-95V乙醇、5V的质子酸水对原料冷浸或回流热提得总浸膏；C、分离纯化步骤：总浸膏用硅胶拌样，以石油醚/丙酮/甲醇体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离；以石油醚丙酮三乙胺的体积比为1041作为展开体系，薄层色谱检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮相同组分，得含异紫堇二酮部位；异紫堇二酮部位，以石油醚、丙酮以及乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集石油醚丙酮乙酸体系极性范围的体积比为1621到821的部分溶液，溥层色谱检测，合并相同部分，重结晶得异紫堇二酮。2.。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于秃疮花属植物为秃疮花、宽果秃疮花或苣叶秃疮花。权 利 要 求 书CN 102731398 A1/5页3一种具有抗癌活性异紫堇二酮的制备方法技术领域0001 本发明涉及一种具有抗癌活性的化合物异紫堇二酮(Isocorydione)的制备方法，属天然产物提取分离技术领域。具体地讲，本发明涉及从罂粟科秃疮花属植物中提取分离异紫堇二酮(Isocorydione)的制备方法。背景技术0002 阿普菲类化合物为一大类重要的生物碱类天然产物化学成分，具有广泛的药理活性。异紫堇二酮(Isocorydione)由Ihsheng Chen于1995年首次从台湾产莲叶桐科莲叶桐属植。
5、物莲叶桐(Hernandia sonora)的茎杆中提取分离，该化合物为对醌类氧化阿普菲类生物碱，命名为Sonodione(Ihsheng Chen，Jijung Chen，Ianlih Tsai，Yaling Chang，Cheming Teng.New P-quinonoid aporphine alkaloids andantiplatelet aggregation constituents of Hernandia sonora.Planta Med.，1995，61，537-539.)，1996年Ihsheng Chen的研究小组在樟科莲桂属植物腰果楠(Dehaasiatriand。
6、ra Merr)的叶中发现相同的化合物，命名为Isocorydione(Shoeisheng Lee，Chienkuang Chen，Ihsheng Chen，Chunghsiung Chen.Chemical constituents fromDehaasia triandra 1.three new alkaloids，isocorydione，norisocorydione，anddehatriphine from the leaves.J.Nat.Prod.，1996，59，55-58.)。同时实验研究证明Sonodione对癌细胞具有一定的抗癌活性，(Jihjung Chen，Tsu。
7、tomuishlkawa，Changyih Duh，Lanlih Tsai，Ihsheng Chen.New dimeric aporphine alkaloids andcytotoxic constituents of Hernandia nymyphaeifolia.Planta Med.，1996，62，528-533.)。2008年，国内周俊院士所在课题组从云南白族药罂粟科紫金龙属植物紫金龙(Dactylicapnos scandens)中分离得到Isocorydione(吴颖瑞，赵友兴，刘玉清，周俊.紫金龙的生物碱成分研究.天然产物研究与开发，2008，20，622-626)。00。
8、03 罂粟科秃疮花属植物有三种，宽果秃疮花、苣叶秃疮花和秃疮花，三种秃疮花我国均产，前两种分布于我国西南部至热带以外的喜马拉雅地区，秃疮花分布于我国黄土高原地区，具有典型的西北地域特色。秃疮花(Dicranostigmaleptopodum)，又名红茂草、秃子花、勒马回(陕西)，二年生或多年生草本，产云南西北部、四川西部、西藏南部、青海东部、甘肃南部至东南部、陕西秦岭北坡、山西南部、河北西南部和河南西北部。生于海拔400-2900米的草坡和路旁，田埂、墙头、屋顶也常见。根及全草药用，全草有清热解毒、消肿止痛、杀虫等功效；治风火牙痛、咽喉炎、扁桃体炎、淋巴结核、秃疮、疮疖疥癣、痈疽。0004 天。
9、然产物化学成分研究表明秃疮花中主要含有阿扑菲类异喹啉生物碱(畅行若，王宏新，周光治.秃疮花化学成分及组织形态研究.药物分析杂志，1982，2，273-277.)，该类生物碱大都具有镇痛，镇静及肾上腺能受体样作用，部分化合物具有抗癌活性。发明内容0005 本发明的目的在于提供一种异紫堇二酮(Isocorydione)的提取分离制备方法，说 明 书CN 102731398 A2/5页4尤其指从秃疮花属植物中提取分离制备。0006 我们在对罂粟科秃疮花属植物秃疮花的化学成分研究中，从该植物中发现大量的异紫堇碱和含量极低的化合物Isocorydione，同时在体外细胞毒活性研究中发现该化合物具有较好的。
10、抗癌活性。0007 同过以上背景可看到同一化合物具有两个英文名称Sonodione和Isocorydione，我们在本发明中统一采用Isocorydione，翻译为异紫堇二酮。0008 一种具有抗癌活性异紫堇二酮的制备方法，其特征在于该方法有原料采集加工、提取、分离纯化三个步骤：0009 A、原料采集加工：采集秃疮花属植物，干燥，粉碎；0010 B、浸膏提取步骤：采用70-95V乙醇、5V的质子酸水对原料冷浸或回流热提得总浸膏；0011 C、分离纯化步骤：总浸膏用硅胶拌样，以石油醚/丙酮/甲醇体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离；以石油醚丙酮三乙胺的体积比为10。
11、41作为展开体系，薄层色谱(TLC)检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮(Isocorydione)相同组分，得含异紫堇二酮(Isocorydione)部位；异紫堇二酮(Isocorydione)部位，以石油醚、丙酮以及乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离，收集石油醚丙酮乙酸体系极性范围的体积比为1621到821的部分溶液，薄层色谱(TLC)检测，合并相同部分，重结晶得异紫堇二酮(Isocorydione)。0012 本发明的秃疮花属植物为秃疮花、宽果秃疮花或苣叶秃疮花。0013 本发明通过体外药理活性实验表明异紫堇二酮(Isocorydione)具有较强的抗。
12、癌活性。0014 本发明的优点在于：0015 1、本发明提出从秃疮花属植物中提取分离异紫堇二酮(Isocorydione)，扩大了该化合物分离提取制备的原料来源，有利于该化合物的药物开发，同时也有利于罂粟科植物天然产物化学的开发与应用研究；0016 2、按本发明提供的制备方法，提取分离制备异紫堇二酮(Isocorydione)，工艺简单，方法可靠，生产成本较低。0017 本发明制备的目标化合物异紫堇二酮(Isocorydione)，其特征在于该化合物为氧化阿扑菲类生物碱化合物，具有C20H19NO5的分子式，化学结构式如式I，其化学结构经过UV、IR、NMR、HRESI-MS数据与参考文献(P。
13、lanta Med.，1995，61，537-539.)的对比及单晶X衍射实验确定。0018 具有以下理化常数，谱学数据以及晶体参数：黑紫色结晶(乙醇)，mp 205-209；UV(MeOH)max(Log)225(3.55)，281(2.78)，328(3.01)，565(3.49)nm；IR(KBr)max2922，1640，1603，1564，1511，1087，1031，816cm-1；HRESI-MS m/z 354.1335M+H+(计算值C20H20NO5为354.1336)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)：6.94(1H，s，H-3)，3.16(2H，t，J6.4Hz。
14、，H-4)，3.50(2H，t，J6.4Hz，H-5)，6.96(1H，s，H-7)，5.91(1H，s，H-9)，3.19(3H，s，N-CH3)，3.98(3H，s，1-OCH3)，3.88(3H，s，2-OCH3)，3.95(3H，s，10-OCH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3).：144.0(C-1)，119.4(C-1b)，152.2(C-2)，112.9(C-3)，128.3(C-3a)，说 明 书CN 102731398 A3/5页5116.3(C-3b)29.3(C-4)，50.3(C-5)，150.3(C-6a)，98.3(C-7)，136.5(C-7a)，1。
15、86.5(C-8)，105.2(C-9)，163.9(C-10)，178.4(C-11)，118.1(C-11a)，126.9(C-11b)，60.7(1-OCH3)，56.5(2-OCH3)，56.4(11-OCH3)，40.2(N-CH3)。异紫堇二酮(isocorydione)的晶体数据：分子式：C20H19NO5，分子量：Mr353.36，晶系：Monoclinic，空间群：P2(1)/c，晶胞参数：a7.412(2) b17.678(5) c13.253(3)90，.107.956(13) .90，V1652.0(7)晶胞内分子数：Z4，晶体密度：Dx1.421Mg m-3，衍射光源。
16、：MoKa radiaion，入射角：0.71073衍射点：Cell parameters from 1898reflections，扫描角度：2.45-21.92，0.102mm-1，温度：T294K，晶胞体积：0.250.200.19mm，R(reflections)0.0468(1966)，wR2(reflections)0.0958(2891)。0019 0020 式I附图说明0021 图1为异紫堇二酮(isocorydione)的X-Ray晶体结构。具体实施方式0022 为了更清楚的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。0023 实施例1：秃疮花。
17、属植物中异紫堇二酮(Isocorydione)的提取分离制备0024 A、原料采集加工步骤：采集秃疮花适量，阴干，适当粉碎。0025 B、浸膏提取步骤：取秃疮花5Kg，加入8倍量95乙醇，冷浸(7d3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏180g。0026 C、分离纯化步骤：将180g总浸膏用200g硅胶硅胶拌样，1800g硅胶填充色谱柱，以石油醚/丙酮/甲醇体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离，500mL为一流份，回收溶剂，以石油醚/丙酮/三乙胺(1041，VVV)为展开体系，薄层色谱(TLC)检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮(Isocorydione)相同组分，得。
18、含异紫堇二酮(Isocorydione)部位20g。异紫堇二酮(Isocorydione)部位用20g硅胶拌样，200g硅胶重新上色谱柱，以石油醚/丙酮/乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行CC分离，500mL为一流份，收集石油醚/丙酮/乙酸体系极性范围在(1621，VVV)到(821，VVV)的部分溶液，TLC检测，合并相同部分，回收溶剂得30mg，重结晶得异紫堇二酮(Isocorydione)25mg。0027 实施例2：秃疮花属植物中异紫堇二酮(Isocorydione)的提取分离制备0028 A、原料采集加工步骤：采集秃疮花适量，阴干，适当粉碎。说 明 书CN 1027313。
19、98 A4/5页60029 B、浸膏提取步骤：取秃疮花5Kg，加入8倍量5硫酸水溶液，加热回流(1.5h3)，过滤，碱水碱化提取液，氯仿萃取，减压回收溶剂得总浸膏300g。0030 C、分离纯化步骤：将300g总浸膏用400g硅胶硅胶拌样，3000g硅胶填充色谱柱，以石油醚/丙酮/甲醇体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离，500mL为一流份，回收溶剂，以石油醚/丙酮/三乙胺(1041，VVV)为展开体系，薄层色谱(TLC)检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮(Isocorydione)相同组分，得含异紫堇二酮(Isocorydione)部位25g。异紫堇二酮(Is。
20、ocorydione)部位用25g硅胶拌样，300g硅胶重新上色谱柱，以石油醚/丙酮/乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行CC分离，500mL为一流份，收集石油醚/丙酮/乙酸体系极性范围在(1621，VVV)到(821，VVV)的部分溶液，TLC检测，合并相同部分，回收溶剂得35mg，重结晶得异紫堇二酮(Isocorydione)27mg。0031 实施例3：秃疮花属植物中异紫堇二酮(Isocorydione)的提取分离制备0032 A、原料采集加工步骤：采集宽果秃疮花适量，阴干，适当粉碎。0033 B、浸膏提取步骤：取宽果秃疮花5Kg，加入10倍量95乙醇，回流热提(2h3)，过滤。
21、，减压回收溶剂得总浸膏250g。0034 C、分离纯化步骤：将250g总浸膏用300g硅胶硅胶拌杆，2000g硅胶填充色普柱，以石油醚/丙酮/甲醇体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离，500mL为一流份，回收溶剂，以石油醚/丙酮/三乙胺(1041，VVV)为展开体系，薄层色谱(TLC)检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮(Isocorydione)相同组分，得含异紫堇二酮(Isocorydione)部位20g。异紫堇二酮(Isocorydione)部位用21g硅胶拌样，200g硅胶重新上色谱柱，以石油醚/丙酮/乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行CC分离。
22、，500mL为一流份，收集石油醚/丙酮/乙酸体系极性范围在(1621，VVV)到(821，VVV)的部分溶液，TLC检测，合并相同部分，回收溶剂得25mg，重结晶得异紫堇二酮(Isocorydione)20mg。0035 实施例4：秃疮花属植物中异紫堇二酮(Isocorydione)的提取分离制备0036 A、原料采集加工步骤：采集苣叶秃疮花适量，阴干，适当粉碎。0037 B、浸膏提取步骤：取苣叶秃疮花5Kg，加入8倍量95乙醇，冷浸(7d3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏200g。0038 C、分离纯化步骤：将200g总浸膏用200g硅胶硅胶拌样，1800g硅胶填充色谱柱，以石油醚/丙酮/甲醇。
23、体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱(CC)分离，500mL为一流份，回收溶剂，以石油醚/丙酮/三乙胺(1041，VVV)为展开体系，薄层色谱(TLC)检测显紫红色斑点，合并含异紫堇二酮(Isocorydione)相同组分，得含异紫堇二酮(Isocorydione)部位25g。异紫堇二酮(Isocorydione)部位用25g硅胶拌样，200g硅胶重新上色谱柱，以石油醚/丙酮/乙酸体系为流动相按极性从小到大，梯度洗脱，进行CC分离，500mL为一流份，收集石油醚/丙酮/乙酸体系极性范围在(1621，VVV)到(821，VVV)的部分溶液，TLC检测，合并相同部分，回收溶剂得。
24、26mg，重结晶得异紫堇二酮(Isocorydione)20mg。0039 实施例5：异紫堇二酮(Isocorydione)对癌细胞的体外细胞毒作用0040 5.1制备人癌细胞株786-0(肾癌细胞)、HELA(人子宫颈癌细胞)、LANCAP(人前列说 明 书CN 102731398 A5/5页7腺癌细胞)、BEL-7402(人肝癌细胞)、BGCR3(胃癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、MKN28(胃癌细胞)和M059K(人脑胶质瘤细胞)的悬液：0.25胰蛋白酶消化，用培养液配成8104个细胞/mL细胞悬液；接种细胞：每孔100L接种于96孔板中；0041 5.2预培养：37，5CO2及饱和湿。
25、度下培养24h；0042 5.3将异紫堇二酮(Isocorydione)：按一定浓度加药，每孔100L，每个浓度设三个复孔。37，5CO2及饱和湿度下继续培养24h；0043 5.424h后，取出培养板，每孔加入50(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)50L固定细胞，TCA的终浓度为10，加在每孔液面上，在4冰箱中放置1h；培养板各孔用去离子水洗涤5次，去除TCA，在空气中干燥后，每孔加0.4的SRB100L，室温下放置1030min，弃去各孔内液体后用1乙酸洗涤5次，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5，10mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪490nm波长下测定OD值，用空白对照调零，将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率，测定异紫堇二酮(Isocorydione)的IC50，结果见表1。0044 表1 SRB法测定异紫堇二酮(Isocorydione)对于癌细胞的IC50值(g/mL)0045 说 明 书CN 102731398 A1/1页8图1说 明 书 附 图CN 102731398 A。