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1、(10)申请公布号 CN 102827816 A(43)申请公布日 2012.12.19CN102827816A*CN102827816A*(21)申请号 201210281532.8(22)申请日 2012.08.08C12N 9/30(2006.01)C12N 15/56(2006.01)C12N 15/80(2006.01)C12N 1/15(2006.01)A21D 8/04(2006.01)C12R 1/80(2006.01)C12R 1/685(2006.01)(71)申请人天津工业生物技术研究所地址 300308 天津市东丽区天津空港经济区西七道32号(72)发明人王华明 林艳梅。
2、(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201代理人张中南 曾庆国(54) 发明名称一种-淀粉酶及其应用(57) 摘要本发明涉及一种-淀粉酶及其应用，所述的-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明筛选出的-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达-淀粉酶的重组菌。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明。
3、书4页序列表6页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 4 页序列表 6 页 附图 3 页1/1页21.一种-淀粉酶，其特征在于，所述的-淀粉酶包括有：a）序列为SEQ ID NO：1的酶；b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。2.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的-淀粉酶。3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO：2。4.一种用于表达权利要求1所述的-淀粉酶的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将序列为S。
4、EQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。5.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌携带有权利要求4所述的重组表达质粒。6.权利要求1所述的-淀粉酶作为面包添加剂的应用。权 利 要 求 书CN 102827816 A1/4页3一种 - 淀粉酶及其应用技术领域0001 本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种-淀粉酶及其应用。背景技术0002 真菌来源的-淀粉酶可以粗略的按酶学性质或作用条件分为3种类型：中性真菌-淀粉酶、耐酸或耐热性真菌-淀粉酶、具有生淀粉酶活力的真菌-淀粉酶。-淀粉酶是重要的工业用酶，其被用于生产产品诸如高麦芽糖浆、焙烤制品。在啤酒酿制行业（提高麦芽汁的可发。
5、酵性）、黄酒酿制行业（改善酒质，提高出酒率）以及低聚异麦芽糖生产等行业均有不同程度的应用。0003 已报道有多种真菌-淀粉酶基因在不同宿主中得到表达,其中真菌-淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统,尽管绝大多数报道中异源表达真菌-淀粉酶的表达水平不高,但异源表达是实现真菌-淀粉酶单一酶活的最好途径。0004 我国在真菌-淀粉酶的研究方面虽然开展较晚，但研究成果对提升我国酶制剂工业有积极意义。与其它淀粉水解酶系的研究水平相比，我国真菌-淀粉酶的研究水平不高，所有研究几乎没有涉及基因的克隆与表达，发酵生产方式也未从固态发酵向液体发酵转变，发酵生产水平与国际先进水平也存在较大差距。酶制剂产品为。
6、多种-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷酶的混合产品，往往无法有效的进行目的产物的生成。发明内容0005 本发明的目的是提供一种-淀粉酶及其应用，即一种具有工业应用价值的新型-淀粉酶，以弥补现有技术的不足。0006 本发明一个方面涉及一种-淀粉酶，包括有：0007 a）序列为SEQ ID NO：1的酶；0008 b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。0009 编码上述-淀粉酶的核苷酸，其一种序列为SEQ ID NO：2。0010 本发明还提供用于表达上述-淀粉酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构。
7、建的。0011 本发明还涉及携带有表达上述-淀粉酶的重组表达质粒的重组菌。0012 本发明筛选出的-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达-淀粉酶的重组菌。附图说明说 明 书CN 102827816 A2/4页40013 图1：用于表达本发明的-淀粉酶的pGm-Pamy质粒图谱，0014 图2：本发明的-淀粉酶的SDS-PAGE凝胶图；0015 图3：本发明的-淀粉。
8、酶在黑曲霉宿主中的pH稳定性；0016 图4：本发明的-淀粉酶在在黑曲霉宿主中的温度稳定性。具体实施方式0017 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。0018 1、-淀粉酶Pamy的合成0019 从绳状青霉（Penicillium Funiculosum）全基因组测序得到的蛋白序列中找到绳状青霉淀粉酶（Penicillium Funiculosum amylase）序列。将该序列在NCBI中blast。
9、,与已知序列alpha-amylase,putativePenicillium marneffei ATCC 18224的最高相似度为86%,将绳状青霉淀粉酶（Penicillium Funiculosum amylase）的蛋白序列进行密码子优化并翻译成相应的核酸序列Pamy，使Pamy不被Xho和Xba两个酶切位点切断，在Pamy核酸序列两端加Xho和Xba酶切位点，将文本序列送至生物公司（上海生工）合成，合成的Pamy被连接在载体PSG-TS上,插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5菌株。其中本发明的-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。。
10、0020 2、-淀粉酶Pamy基因重组载体的构建0021 将连在PSG-TS载体上的Pamy基因用Xho和Xba双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段。与同样用Xho和Xba双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4ml LB液体培养基中进行培养（含Amp），培养14-6小时后，提取质粒，将重组质粒pGm-Pamy转入表达宿主黑曲霉G1，含有该重组质粒的重组菌株命名为G1-pGm-Pamy。0022 其中的酶切及连接反应均参照表1。0023 。
11、表1酶切体系及连接体系0024 0025 3、转化黑曲霉及重组子筛选鉴定0026 （1）将装有100ml CMA的250ml4-挡板摇瓶用新鲜的黑曲霉G1菌株孢子接种，在说 明 书CN 102827816 A3/4页530、200rpm条件下使培养物生长12小时。0027 （2）将（1）中获得的菌体用4层无菌纱布过滤，先用无菌水冲洗3次，再用溶液A冲洗3次。0028 （3）在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到原生质体溶液中并在30、200rpm温育2小时，显微镜观察监测原生质体化进展。0029 （4）用无菌Micra-Cloth将原生质体化反应滤入至两个50ml无菌的一次性离心管中，并将每管的体。
12、积用溶液B定容至45ml，4000rpm离心10min。弃上清；向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；再向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清。0030 （5）加100l溶液B重悬原生质体，原生质体的浓度应达到1107个/100l。在冰上，将100l原生质体溶液转移到预冷的15ml管中，每个转化反应一管。以不超过10l的体积向管中加入10g DNA，并加入12.5l溶液C，温和混匀并在冰上温育20分钟。0031 （6）将MMSA上层培养基（每管8ml）熔化并保持在55。从冰中移出原生质体，向原生质体中加入1ml溶液C和2ml溶液B，并与一管。
13、MMSA上层培养基温和混匀，将混合液分别倒入三个amds下层培养基平板中30恒温培养4-7天。0032 （7）将长出的转化子转接至adms二次验证培养基平板，30恒温培养，并进行菌落PCR验证，获得的阳性菌株经测序鉴定正确，-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。0033 溶液A（每500ml）2.5ml 1M K2HPO4;2.5ml 1M KH2PO4;48.156g无水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至终体积500ml，pH5.5。将溶液过滤灭菌并在室温下保存。0034 原生质体化溶液将0.6g的-D-葡聚糖酶（Inter。
14、Spex Products，Inc,CA）或者450mg-D-葡聚糖酶和150mg Driselase（InterSpex Products，Inc.）溶解于40ml溶液A中，并将溶液过滤灭菌，0.2微米。0035 溶液B（每500ml）5ml 1M Tris，pH7.5；2.77g CaCl2（FW 110.99）；109.32g山梨醇（FW 182.2；1.2M）；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌并在室温下保存。0036 溶液C(每500ml)250g PEG4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过。
15、滤灭菌。0037 MMSA琼脂将0.59g/L乙酰胺；3.4g/L CsCl；0.52g/L KCl；1.52g/L KH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素；10g/L琼脂（顶层琼脂中的低熔点琼脂糖）溶解于1L dlH2O，高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下加入10ml50%葡萄糖和1.25ml 20% MgSO47H2O。0038 CMA（1升）=20g无水葡萄糖；20g麦芽膏（Difco Brand Malt Extract），1g蛋白胨（Bacto Peptone）；20g琼脂（Bacto Agar）0039 4、淀粉酶的活性测定0040 将获得的阳性菌株接种于液体发。
16、酵培养基中，于30、200rpm摇床培养。淀粉酶酶活用Megazyme Alpha-amylase Ceralpha method（Megazyme International Ireland）试剂盒测定。转入了pGm-Pamy质粒的黑曲霉G1在pH5.4、40条件下测定的淀粉酶酶活可达到135.64CU/ml。0041 4.1、测定本发明淀粉酶在不同pH下的酶活：说 明 书CN 102827816 A4/4页60042 将测酶活的反应缓冲液pH分别设定为pH2.4、pH3.0、pH3.6、pH4.2、pH4.8、pH5.4、pH6.0、pH6.6、pH7.2、pH7.8，测定在这些pH条件下。
17、淀粉酶的酶活，测定结果参见图三。从该图中可以看出，淀粉酶的最适反应pH为6.6。0043 4.2、测定本发明淀粉酶在pH6.6、不同温度下的酶活：0044 将反应pH设定为6.6，测反应温度分别设定为30、40、50、60、70、80、。测定结果参见图四。从该图中可以看出，淀粉酶的最适反应温度为40。0045 5、-淀粉酶的应用实例0046 通过研究面包硬度的变化与-淀粉酶添加量之间的关系，发现-淀粉酶有一定的抗老化效果。结果表明，在适当的添加范围内(0.51.5ml/100g面粉)，-淀粉酶可以明显地增加面包的比容，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质。-淀粉酶能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，对提高面包的品质有着重要的意义。本发明为-淀粉酶作为面包添加剂应用到面包工业中提供了一定的理论依据。说 明 书CN 102827816 A1/6页70001 0002 序 列 表CN 102827816 A2/6页80003 序 列 表CN 102827816 A3/6页90004 序 列 表CN 102827816 A4/6页100005 序 列 表CN 102827816 A10。