一种南高丛越组培快繁方法.pdf

本发明公开了一种南高丛越组培快繁方法，南高丛越橘（Vaccinium australe）具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点。因此，很有必要建立南高丛越橘离体再生体系，为高品质、高产量、适应性强的南高丛越橘的培育奠定基础。本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，以期为越橘大量繁殖提供新的快速有效途径。

权利要求书1.  一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤： （1）外植体消毒：采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒3～8min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用； （2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养10～20天，然后置于每天光照10～16小时，光照强度为2000～4000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽,培养2周后统计污染率、启动率和死亡率； （3）增殖培养：将步骤（2）生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养5～7天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽； （4）生根培养：将步骤（3）获得的生长至1.5～2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根,接种后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至生根； （5）炼苗移栽：根长至1～2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2～4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷＝3：1:1组成基质中并定植于大田中，移栽1个月内保持空气湿度80%以上。 2.      根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：WPM+0.1～2.0mg/L ZT+1.0～4.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。 3.  根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：WPM+0.1～2.0mg/L ZT+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。 4.      根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～3.0mg/L NAA+1.0～2.0mg/L ABT1+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

说明书一种南高丛越组培快繁方法
技术领域
    本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种南高丛越组培快繁方法。
背景技术
越橘属于杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木，果实为蓝色或红色，原产北美。果实为蓝色或红色，果实大小因种类不同而异，果肉柔软多汁，风味醇美，含有丰富的维生素和及其他果品中少有的特殊营养成分,具有较高的保健药用价值，因此国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一。我国的越橘属植物资源非常丰富,但集中栽培面积还较少，主要集中分布于大、小兴安岭和长白山等地。越橘苗木繁殖方法因品种而异,高丛越橘主要釆用硬枝扦插,兔眼越橘采用绿枝扦插,矮丛越橘硬枝扦插和绿枝扦插均可,其他方法如种子育苗、根状茎扦插、分株等也有应用，但这些繁殖方式均存在周期长、繁殖系数低、成本高等质点，限制了快速繁殖及新品种选育等工作。而离体培养可弥补传统繁殖方法的不足,在较短时期内扩大繁殖优良品种,并能利用遗传转化技术在短期内培育新品种。
越橘是一种新兴栽培果树,蕴藏着巨大的发展潜力,由于越橘鲜果的总量很少,所以在国际市场上售价昂贵。而南高丛越橘（Vaccinium australe）具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点，具有巨大的市场潜力。因此,加速南高丛越橘的发展有着广阔的前景。但南高丛越橘作为一种木本观赏果树的植物,在传统的种子繁殖受到产量低、难度高、所需时间长、生长环境受限等条件的限制下，因此，急需建立了系统的南高丛越橘组织培养植株再生体系，以提高其繁殖速度和规模,从而实现南高丛越橘种苗的工厂化生产。
发明内容
    本发明的目的在于提供出一种南高丛越组培快繁方法，本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，从而实现了本发明的目的。
 本发明的一种南高丛越组培快繁方法，包括以下的步骤：
（1）外植体消毒：采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒3～8min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在25～28℃条件下全暗培养10～20天，然后置于每天光照10～16小时，光照强度为2000～4000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽。培养2周后统计污染率、启动率和死亡率。
（3）增殖培养：将步骤（2）生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25～28℃条件下全暗培养5～7天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽。
（4）生根培养：将步骤（3）获得的生长至1.5～2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14～16小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至生根。
（5）炼苗移栽：根长至1～2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2～4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷＝3：1:1组成基质中并定植于大田中，移栽1个月内保持空气湿度80%以上。
上述诱导培养基为：WPM+0.1～2.0mg/L ZT+1.0～4.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的增殖培养基为：：WPM+0.1～2.0mg/L ZT+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
    上步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～3.0mg/L NAA+1.0～2.0mg/L ABT1+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
与现有技术相比本发明的优点是：南高丛越橘（Vaccinium australe）具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点。越橘在自然状态下以二倍体、四倍体或六倍体形式存在,但由于越橘的杂种杂合性,使得采用传统育种手段进行越橘育种既费吋又费力。因此，很有必要建立南高丛越橘离体再生体系，为高品质、高产量、适应性强的南高丛越橘的培育奠定基础。本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，以期为越橘大量繁殖提供新的快速有效途径。
具体实施方式
    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
    实施例1
（1）外植体消毒：采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒20s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒9min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在27℃条件下全暗培养12天，然后置于每天光照14小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为27℃的条件下培养，诱导率为78.56%。所述的诱导培养基为：WPM+1.5mg/L ZT+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.6g/L琼脂，pH为5.4。
（3）增殖培养：将步骤（2）生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在27℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为4000lx，培养温度为27℃的条件下培养，每20天继代一次，增殖系数为4.6。所述的增殖培养基为：：WPM+2.0mg/L ZT+20g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.4。
（4）生根培养：将步骤（3）获得的生长至1.5～2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为4000lx，培养温度为27℃的条件下培养直至生根，生根率为76.93%。所述的生根培养基为：1/2MS+2.8mg/L NAA+1.0mg/L ABT1+2.8g/L蔗糖+4.9g/L琼脂，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：根长至1～2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷＝3：1:1组成基质中并定植于大田中，移栽1个月内保持空气湿度80%以上，移栽成活率为90.37%。      
    实施例2
（1）外植体消毒：采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒15s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在25℃条件下全暗培养10天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃的条件下培养，诱导率为83.47%。所述的诱导培养基为：WPM+1.2mg/L ZT+2.4mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.6g/L琼脂，pH为5.8。
（3）增殖培养：将步骤（2）生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照13小时，光照强度为3000lx，培养温度为25℃的条件下培养，每20天继代一次，增殖系数为4.3。所述的增殖培养基为：：WPM+1.8mg/L ZT+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）获得的生长至1.5～2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照13小时，光照强度为5000lx，培养温度为25℃的条件下培养直至生根，生根率为79.27%。所述的生根培养基为：1/2MS+3.0mg/L NAA+1.5mg/L ABT1+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：根长至1～2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷＝3：1:1组成基质中并定植于大田中，移栽1个月内保持空气湿度80%以上，移栽成活率为88.49%。