核酸脉冲杂交法 本发明属于核酸杂交方法领域，是一种核酸脉冲杂交法，特别适用于核酸的分析检测。
一般情况下，两条单链核酸(包括DNA双链变性后产生的两条单链DNA，单链RNA和人工合成的单链寡核苷酸，以及人工合成的PNA)的碱基序列具有同源性时，在适宜的条件(如pH，盐浓度，温度，单链核酸的终浓度等)下，同源碱基之间可以配对形成氢键而恢复成天然的双螺旋结构，这一过程称为核酸的杂交(当两单链DNA是由一DNA变性产生时，该过程又被称为核酸的复性)。目前，核酸的杂交反应被广泛用于检测某样品中是否含有以及含有多少特定序列核酸片段(常称为目的片段)。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组DNA、RNA或cDNA及其片段。
核酸杂交一般是按下述方法进行的：
1.制备一段与目的片段碱基序列互补的核酸片段(可以是RNA片段、寡和苷酸片段、cDNA片段、或DNA片段)，该片段被称为探针；
2.采用适当的标迹方法(如缺口平移法，随机引物标记法，末端标记法，PCR标记法以及RNA聚合酶促标记法等)将探针上标上放射性标记物(32P，125I，35S等)或非放射性标记物(地高辛，生物素，荧光素，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶等)；
3.使一定浓度的单链探针(若为双链需变性成为单链)和单链目的片段(若为双链需变性成为单链)在合适的pH值、盐浓度缓冲液中保持良好的接触，(二者可以处于同一物项中也可以处于不同物项中)。在恒定温度(通常选择低于探针与目的片段所形成双链杂交体的解链温度15-25℃范围内地某个温度，使二者进行一定时间(根据二者浓度情况，时间可长可短)的杂交反应；
4.根据标记物的不同，选用不同的方法(如放射自显影、化学发光法以及显色法等)来检测是否有杂交体生成或生成多少杂交体。由杂交体的有无或多少就可以间接推知待测样本中是否含有或含有多少目的片段。
在具体应用中，又派生出不同类型的许多方法。依据目的片段和探针是否处于同一物相中将这些方法分为固相杂交法和液相杂交法两类。
1.固相杂交法：该法又可以分为膜上印迹杂交法和原位杂交法两类。
膜上印迹杂交法：是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物(常用的有硝酸纤维素膜和尼龙膜等)上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法，其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段在恒定温度(通常在低于杂交体解链温度Tm15-25℃范围内)下进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影、化学发光、显色等检测方法显示标记的探针的位置，由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因序列及其量的大小。根据核酸品种不同，又可以分为Southern印迹法(Southern-blotting)和Northern印迹法(Northern-blotting)。前者是指将电泳分离的DNA片段从凝胶中转移到固相支持物上的过程；后者是指RNA的印迹过程。核酸从凝胶中转移到固相支持物上的转移方法主要有虹吸转移法、电转移法以及真空转移法等。核酸样品也可以不经电泳分离而直接点于固相支持物上(省去了转移过程)进行杂交，称为斑点印迹法(dot-blotting)或狭缝印迹法(slit-blotting)。
原位杂交法：特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法称为原位杂交。核酸的原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可以分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论那种杂交都必须经过组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗等一系列步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。这些具体步骤中，组织切片或细胞涂片要经过多种有机或无机化合物处理，经历变性、复性等温度变化。
原位杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度、pH、以及杂交液中甲酰胺和盐离子的浓度。杂交温度在37℃-60℃范围内选取，但在整个杂交过程中温度是恒定不变的。
2.液相杂交：液相杂交是将待检测的核酸样品和已标记的探针同时溶于杂交缓冲液中进行杂交反应，然后用适当的手段分离杂交体双链和未杂交的标记探针，通过对杂交体上标记物的检测而完成对待检样品的定性、定量分析。在进行液相杂交时，要根据探针的种类(DNA或RNA)和欲检测的核酸样品的种类(DNA，RNA)浓度的不同，具体设计杂交反应的条件，采用不同的分离杂交体双链的方法。其中有效的分离杂交体双链和未杂交探针的方法是液相杂交的核心所在，目前采用的方法主要有：层析法，电泳法，酶联法等。结果的测定则根据探针的标记物的不同而采用不同的方法：放射自显影，液闪记数以及显色或化学发光等。
为了在尽可能短的时间内获得灵敏、专属、重现性好的杂交结果，人们在具体应用上述核酸杂交方法时，根据需要，又派生出了一系列方法，这些方法在原理上都基本相同，所不同之处只是采用不同的反应条件，这些条件的主要区别为：
*所用杂交缓冲液的组成不同(配置杂交缓冲液所用的缓冲对不同，盐离子来源不同，所含变性剂浓度不同)
*杂交温度不同(如在水溶液中68℃，在50％甲酰胺溶液中40℃，根据杂交严格性要求不同，温度还可作适当调整)。
*杂交体系的体积和杂交时间的长短不同(对较大的体积杂交时间可达3天，而较小的体积杂交时间则短至4小时)。
*杂交过程中搅动的方法和程度不同(连续震荡或静止)。
*标记探针的长度，浓度及其比活性不同。
*是否用其他化合物，如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等来提高核酸重新结合能力。
*杂交后的清洗是否严格。
上述这些条件的改变，对杂交结果有不同的影响，人们需要根据实验的具体情况，选用适当的方法。但是，迄今为止，人们所用杂交方法的一个共同点是：在一个杂交过程中，随着杂交过程的进行杂交体系的温度都是保持恒定不变的(我们将这类方法统称为恒温杂交方法)。由于核酸的杂交反应包含了碱基间氢键形成和氢键解离两类反应，而碱基间氢键形成反应的速度随温度升高而加快，氢键解离反应速度则相反(详见理论部分)，总的杂交反应速度取决于反应速度慢的一步反应。因此在恒温杂交法中有个最佳杂交温度(通常认为是在低于杂交体的解链温度Tm15℃至低于杂交体的解链温度Tm25℃的范围内的某个温度)，此时氢键解离反应和氢键形成反应的速度相等，总体杂交反应的速度最快。但此时上述氢键解离反应和氢键形成反应两步反应的速度都不够快，因此恒温杂交法的杂交时间长、灵敏度低，同时杂交的特异性也不理想。
鉴于上述存在的问题，本发明的目的在于提出一种利用温度脉冲变化的核酸杂交的核酸脉冲杂交法。该核酸脉冲杂交法具有杂交时间短、灵敏度高、杂交特异性好的效果。
本发明的目的是通过以下措施来实现的：该核酸脉冲杂交法是在核酸杂交方法的杂交过程中，杂交温度是脉冲变化的，其中，杂交温度的高温是指在低于杂交体解链温度15℃至杂交体解链温度范围之间的某个温度，而杂交温度的低温是指在0℃至低于杂交体解链温度15℃范围之间的某个温度。
其中：核酸杂交方法为核酸固相杂交法或核酸液相杂交法；或者核酸杂交方法为核酸固相杂交法中的薄膜印迹法或原位杂交法；或者核酸杂交方法为核酸薄膜印迹法中的斑点印迹法或狭缝印迹法或Southern印迹法或Northern印迹法；或者核酸杂交方法为核酸原位杂交法中的细胞涂片原位杂交法或组织切片原位杂交法；
杂交温度的脉冲时间包括温度下降时间、低温时间、温度上升时间和高温时间；杂交温度的每个脉冲时间经过温度下降时间、低温时间、温度上升时间到高温时间，如附图1所示；或者杂交温度的每个脉冲时间经过低温时间、温度上升时间、高温时间到温度下降时间，如附图2所示；或者杂交温度的每个脉冲时间经过温度上升时间、高温时间、温度下降时间到低温时间，如附图3所示；或者杂交温度的每个脉冲时间经过高温时间、温度下降时间、低温时间到温度上升时间，如附图4所示；其中，附图1、2、3和4分别为在每个脉冲中温度随时间的不同变化图。
从总体上说，温度脉冲的升降温速率太大太小都不利。速率太大，则升温降温速度太快，反应体系来不及达到所需温度，氢键的解离、形成反应都进行不彻底；而速率太小，则导致温度脉冲频率下降。但若脉冲频率固定时，升降温速率越小，核酸分子处于最佳杂交温度的时间越长，杂交效率也越高。高温时间和低温时间经历的时间与所选的温度、杂交缓冲液的组成、盐离子浓度、探针的类型与结构等有关。通常，高温时间经历的时间不应小于在选定的反应条件下全部ELdsDNA解链所需最小时间，低温时间经历的时间主要取决于在选定的反应条件下采用的低温温度，低温温度越小，低温时间经历的时间可越短，但最好不短于1秒。由于单位时间内，温度脉冲频率越大，杂交效率越高，因此每个脉冲所消耗的时间应尽可能小，以便在单位时间内获得最大脉冲频率。杂交时间越长，脉冲次数越多，杂交效率也越高。在具体的应用中，选择怎样的脉冲温度，多长的脉冲时间应视具体的情况而定；
在脉冲杂交法中，由于反应体系的温度经历了由低到高的迅速变化过程，组成总反应的两步反应的速度都有机会处于较高的速度，总的反应速度较恒温杂交大为增加，因此本方法所用杂交时间短，灵敏度高，杂交特异性大大增加。
脉冲杂交法的提出是得益于有关核酸杂交动力学理论的研究进展。核酸杂交动力学是研究核酸杂交反应的速率、反应条件(如浓度、压力、温度、辐射、介质、催化剂、结构等)对反应速率与方向的影响以及研究反应历程，即机理的一门科学。迄今为止，人们都是在用二级动力学过程表述核酸杂交动力学的，以卢圣东主编的《现代分子生物学实验技术》一书对核酸复性的描述为例(由于核酸的杂交与复性在本质上都是一样的，人们常常用核酸复性动力学研究代替核酸杂交动力学研究)：
“复性过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局部双链的过程(遵循二级反应动力学)。这种随机碰撞形成的局部双链是暂时的，如果此局部双链周围的碱基不能配对则会重新解离，继续碰撞。一旦找到了正确的互补区，则首先形成的局部双链就形成核，核两侧的顺序迅速配对，形成完整的双链分子。此后一步反应是一个自发过程，而第一步反应(即成核反应)是整个过程的限速步骤，因此核酸复性的动力学方程可以用单链核酸减少的二级反应速率方程式表示：-d[ssDNA]dt=k[ssDNA]2]]>”以上有关核酸杂交动力学理论存在矛盾之处：既然承认核酸复性反应是一个包含了许多步骤的复杂反应而非双分子基元反应，那么直接利用质量作用定律将其速率方程表述为二级动力学方程就不正确，因为只有基元反应才能直接利用质量作用定律建立其速率方程。实际上，核酸杂交的二级动力学理论不仅在理论上存在矛盾，而且在具体应用中对许多实验现象也难以做出合理解释。因此我们通过研究建立了一套新理论-“核酸杂交的复杂反应动力学理论”。
我们认为核酸杂交反应包含了两类基元反应：一类是氢键形成反应，如单链核酸随机碰撞形成周围碱基不能配对的局部双链[我们将其称为错配的局部双链，用符号ELdsDNA(location double-stranded DNA)表示]反应k1；单链核酸随机碰撞形成周围碱基能够最终配对的局部双链[我们用符号LdsDNA(locationdouble-stranded DNA)表示]反应k2和局部双链周围碱基的配对反应(拉链反应)k3。另一类是氢键解离反应，主要是上述三类反应的逆反应k1′、k2′、k3′。
上述各基元反应存在着以下关系：式中ssDNA和dsDNA分别指单链核酸分子和双链核酸分子，LdsDNA(locationdouble-stranded DNA)和ELdsDNA(error location double-stranded DNA)都是指局部配对的双链核酸分子，但前者可以继续其碱基配对反应而最终形成完整的双链核酸分子，而后者却不能。k1、k2、k3都是指氢键形成的反应速度常数，k1′、k2′、k3′代表上述反应之逆反应(即氢键解离反应)的速度常数。实际上在上述模型中，由于k3和k3′反应在一定条件下都属定量完成的快速反应，因此可将反应的中间产物LdsDNA予以忽略，①式简化成②式：其中氢键形成的反应速率常数k1、k2随温度降低而迅速增大，氢键解离反应的速率常数k1′、k2′则相反。我们认为，当反应体系的温度小于解链温度Tm时，由于各反应速度常数之间存在k2＞＞k1＞＞k2′＞＞k1′的关系，变性的单链核酸分子在一个极短的时间内(t*0)绝大部分经错配反应k2生成ELdsDNA，极少部分经复性反应k1生成dsDNA，游离的单链核酸分子则几乎不存在了。随着反应时间的推移，每当有n个ELdsDNA经解离反应k2′生成2n个ssDNA时，就有2个ssDNA经复性反应k1生成了dsDNA，2(n-1)个ssDNA又经错配反应k2生成了新的ELdsDNA，从宏观上看就好象是一个ELdsDNA分子经解离反应k2″生成了两分子ssDNA，进而又经复性反应k1生成了一个dsDNA分子。因此，宏观上核酸的复性或杂交反应可以用如下的连续反应式表达： 式中k2″是一个综合了k2和k2′两个反应的“表观反应速率常数”。与式②相比，上式中略去了dsDNA解离的速率常数k1′。因为在低于Tm的复性或杂交温度下，双链DNA(dsDNA)解离反应几乎不能发生，为叙述方便将其忽略。显然，当温度升高时，氢键解离反应速率常数k2″增大，而氢键形成反应速率常数k1减小。当体系反应温度升高接近Tm时，k2″＞k1，此时k1反应是限速反应，当体系温度降低使k1＞k2″时，k2″反应是限速反应。当k2″＝k1时，总体复性或杂交反应最快，此时体系对应的温度就是最佳复性或杂交温度THY。但从理论上讲，此时的复性或杂交反应速度仍有可能大幅提高。最简单的办法就是在核酸的复性或杂交中采用一系列高、低交变的温度脉冲。道理很简单，可通过对②式的进一步分析加以阐明：当我们将核酸双链变性成单链以后，就将温度以一定斜率降至室温(T1)并保持一定时间，这期间将主要发生碱基配对反应k2和k1，得到ELdsDNA和dsDNA两种产物，但以前者为主。然后再将此复性或杂交体系的温度以一定斜率升高至接近dsDNA解链温度Tm的某一温度(T2)，并保持一定的时间，这个过程中将主要发生k2′反应，即ELdsDNA又重新解离为ssDNA，而dsDNA在此时还很稳定，不会解离。接着再将复性或杂交体系的温度由T2降至T1，则经k2′反应产生的ssDNA又将发生k2反应和k1反应而生成新的ELdsDNA和dsDNA两种产物。这样由于dsDNA的高稳定性，每次脉冲dsDNA的量都有新的增加，而ELdsDNA的量却不断减少。经过一系列由T1→T2→T1…的温度脉冲后，杂交体dsDNA的浓度将在短时间内不断累加而产生高效复性或杂交。
与经典的恒温杂交相比，在单位时间内，这种人为的高低温交变的杂交方式获得的杂交效率将明显高于前者，同时由于每个脉冲的高温都较恒温杂交的温度高许多，因而其非特异杂交也比经典的恒温杂交显著降低。该方法不仅适用于液相杂交，对于固相杂交也同样适用。对薄膜杂交和原位杂交二者而言，虽然变性后的目的片段被固定在固相支持物上，但探针与目的片段的杂交历程与液相杂交是相似的。所不同的是此时的杂交反应发生在二相的界面处。当探针与目的片段形成不正确配对时，这些与界面上目的片段结合的探针并不能马上解离，由于空间位阻的原因，这将会阻碍其他探针与其邻近目的片段的结合复性。同时由于杂交液中只存在较高浓度探针，在杂交温度下，其自身的错配、扭曲也会减少有效探针浓度。因此，脉冲杂交法对提高薄膜杂交、原位杂交效率也将是明显有效的。
由于在各类核酸杂交法中，薄膜印迹法和原位杂交法以及液相杂交法三者之间彼此差别较大，下面结合实施例分别对本发明作进一步详细描述：
1.薄膜杂交法：
在涉及杂交反应部分，斑点，Southern，Northern等杂交方法具有极大相似性。由于斑点杂交法影响因素少，应用普遍，故选取斑点杂交作为实施例更具代表性。我们采用30bp的寡核苷酸探针(5′-pTTG GGT AAC GCC AGG GTT TTC CCAGTC ACG-3′)，用脉冲杂交法和恒温杂交法对点在尼龙膜上的相同浓度系列的目的片段(超螺旋PUC180 DNA)，用相同的杂交缓冲液和探针浓度进行了对比斑点杂交实验，具体方法如下：
探针的标记：
按照地高辛-3’末端标记试剂盒(DIG-3′end Oligonucleotide LabledKit)说明书提供的标准方法对30bp寡核苷酸的3’末端进行了地高辛标记，获得地高辛标记的寡核苷酸探针。
点样：
1.吸取目的片段溶液1微升置0.5毫升微量离心管中，加入0.4摩尔浓度NaOH，10毫摩尔浓度EDTA溶液至终体积为100微升，(含目的片段5纳克/毫升)，96℃充分变性10分钟。
2.将变性液用含10毫摩尔浓度EDTA的0.4摩尔浓度NaOH溶液按比例稀释成如下浓度系列(单位：皮克/微升)：125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9。
3.将Zeta-probe GT膜在双蒸水中浸湿。
4.将湿的Zeta Probe GT膜置于真空点样器上，拧紧紧固螺丝，确保各样品孔间不会产生交叉渗漏。
5.在每一点样孔中加入0.5毫升TE缓冲液，真空抽尽溶液后关闭真空泵。
6.将样品溶液各取1微升加至0.5毫升0.4摩尔浓度NaOH，10毫摩尔浓度EDTA溶液中混匀，然后分别将溶液全部加入相应的点样孔，打开真空泵至溶液刚好抽干关闭泵。
7.每孔再加0.5毫升0.4摩尔浓度NaOH，10毫摩尔浓度EDTA溶液，抽真空使完全干后关闭泵。
8.使系统连通大气后，拆下点样器，取出膜在2×SSC缓冲液中浸泡一下，在空气中凉干，然后置80℃烘烤1小时，备用。
9.接同样方法再点数张含如下梯度量目的片段的膜：500皮克，100皮克，50皮克，10皮克，5皮克，1皮克，用于方法比较。
预杂交：
1.将固定有相同含量单链目的片段的两张膜A和B分别置于大小适当的A和B两个塑料袋中。
2.分别向每个袋中加入5毫升预杂交缓冲液，然后68℃水浴保温5分钟。
杂交：
1.将两袋分别剪去一角，倾出预杂交液，再换加1毫升新的预杂交液。
2.分别向两袋中加入50微升探针溶液(杂交液中探针终浓度为：50皮摩尔/毫升)，混匀。
3.将A袋实施脉冲杂交法：先在70℃水浴中保温一定时间(5-10分钟)，然后取出，置20℃水浴中保温一定时间(5-10分钟)，再取出置70℃水浴中保温，如此反复n次(n个脉冲)。
4.将B袋实施恒温杂交法：置55℃水浴中保温3小时。
5.取出两袋，分别剪去一角，倾出探针溶液。
洗膜：
1.分别向两袋中加入等量适量的洗膜缓冲液I，洗膜30分钟。
2.倾出洗膜缓冲液I，分别再向两袋中加入等量适量的洗膜缓冲液II，洗膜30分钟。
显色：
将两个袋均剪开，将两膜取出作上标记，按以下步骤显色：
1.在适量显色缓冲液II中洗膜1分钟。
2.在适量显色缓冲液III中室温放置30分钟。
3.用显色缓冲液III以1∶5000比例稀释抗DIG-AP复合物溶液(取0.5微升抗-DIG-AP复合物+2.5毫升显色缓冲液III)。
4.将膜置上述溶液中室温放置30分钟。
5.将膜置适量显色缓冲液I中洗2次，每次15分钟。
6.将膜置适量显色缓冲液IV中平衡2分钟。
7.取20微升NBT/BCIP贮备液加至1毫升显色缓冲液4中，混匀。
8.将膜置于上述新鲜配制的1毫升显色液中暗处放置12小时，勿振摇。
9.将膜取出，置适量显色缓冲液V中1分钟以终止反应。
10.将膜拍照，凉干保存。
附图5是采用脉冲杂交法进行斑点杂交的结果。图中1-6数字表示点在杂交膜上的目的片段的量分别为125pg，62.5pg，31.2pg，15.6pg，7.8pg，3.9pg。所用温度脉冲杂交法是使杂交膜在2小时内经历6个温度脉冲，每个温度脉冲是在20℃经历9分钟低温时间，然后经历3分钟的升温时间，使温度由20℃上升至70℃，接着是在70℃经历7分钟高温时间，然后又经历1分钟的降温时间，使温度从70℃重新回到20℃。附图6是采用恒温杂交法进行斑点杂交的结果。图中1-6数字表示的意义与附图5相同。所用恒温杂交法是使杂交膜在55℃保温3小时。二者杂交的其他条件都一样：用5ml预杂交液(7％SDS，0.5MNa2HPO4，pH7.2)在68℃预杂交5分钟；使用1ml杂交缓冲液(50pmol/ml探针，7％SDS，0.5MNa2HPO4，pH7.2)；杂交后用5％SDS，40mMNa2HPO4，pH7.2的洗膜缓冲液洗膜30分钟，用1％SDS，40mMNa2HPO4，pH7.2的洗膜缓冲液洗膜30分钟，然后采用抗DIG-AP，NBT/BCIP显色法显色。附图5和附图6显示的实验结果表明，采用脉冲杂交法杂交2小时共6个脉冲的信噪比及检测灵敏度明显高于采用恒定温度杂交3小时的结果，而且杂交背景也低于后者。前者对于低至3.9皮克目的片段可以检出，而后者的最低检出限为31.2皮克。因此，与恒温杂交法相比，脉冲杂交法在提高斑点杂交的杂交效率、降低杂交背景方面具有十分显著的效果，可以在较短的杂交时间内获得更高的检出灵敏度。附图7A是采用较高温度脉冲频率(6个脉冲/小时)时进行2小时的温度脉冲斑点杂交实验结果，附图7B是采用较低温度脉冲频率(3个脉冲/小时)时进行2小时的温度脉冲斑点杂交实验结果。两者杂交的其他条件完全一样。附图7C是采用较高升降温速率(升温1.11℃/秒，降温1.83℃/秒)时进行2小时6个脉冲的温度脉冲斑点杂交实验结果，附图7D是采用较低升降温速率(升温0.67℃/秒，降温0.91℃/秒)时进行2小时6个脉冲的温度脉冲斑点杂交实验结果。两者杂交的其他条件完全一样。从图7A与7B的比较中可以看出，在进行温度脉冲杂交法时，在一定条件下，高频率脉冲可获得较高杂交灵敏度。从图7C与7D的比较中可以看出，在进行温度脉冲杂交法时，在一定条件下，较低的升降温速率(较长的升降温时间)可获得较高杂交灵敏度。
2.原位杂交法：
我们选择4微米的小鼠脊椎石蜡包埋切片，用DIG标记的166bp的RNA探针分别采用脉冲杂交法和恒温杂交法进行了RNA-RNA原位杂交以检测其中的脂质蛋白(PLP：proteolipid protein)mRNA。具体步骤如下；
探针的标记：
将克隆有PLPmRNA的cDNA片段的SP6表达载体按照DIG-RNA标记试剂盒说明书中提供的标准方法制备PLP mRNA的DIG标记的RNA探针。
切片的预处理：
1.用二甲苯和不同浓度系列乙醇溶液对切片进行脱蜡处理。
2.用4％多聚甲醛(溶于100毫摩尔浓度磷酸缓冲液中)固定20分钟。
3.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
4.用200毫摩尔浓度HCl处理切片10分钟以使蛋白变性。
5.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
6.为减小非特异背景，将切片浸入0.5％的乙酸酐的100毫摩尔浓度Tris(pH8.0)溶液中在磁力搅拌器上彻底搅拌10分钟。
7.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
8.将切片用蛋白酶K 100微克/毫升的含2毫摩尔浓度氯化钙的TBS溶液在37℃处理20分钟。
9.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
10.将切片浸入4℃的TBS(pH7.5)中5分钟，以终止蛋白酶K的消化反应。
11.将切片在50％、70％、95％乙醇中梯度脱水。
12.将切片在氯仿中清洗一下。
杂交：
1.将切片置温盒中55℃保温30分钟。
2.制备如下的杂交缓冲液：2×SSC
10％硫酸葡聚糖
0.01％鲑鱼精DNA
0.02％SDS
50％甲酰胺
3.将标记好的反义RNA探针用适量杂交缓冲液按1∶4比例稀释。将稀释好的探针溶液按10微升/平方厘米的量加到切片上，盖上盖玻片，然后用橡皮泥密封。
4.将切片加热到95℃保温4分钟。
5.恒温杂交：将玻片置温盒中72℃保温6小时。
脉冲杂交：将玻片置温盒中80℃，15分钟，40℃，15分钟，共8个脉冲，4小时。
显色：
1.将切片在2×SSC中浸泡过夜。
2.用50％的去离子甲酰胺的1×SSC溶液55℃洗切片3次。
3.用1×SSC室温洗切片2次，每次15分钟。
4.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
5.将切片在含10％小牛血清的封闭液中浸15分钟。
6.将切片在用抗DIG-AP复合物的封闭液中浸60分钟。
7.将切片在TBS缓冲液中清洗3-5次。
8.将切片浸入NBT/BCIP显色剂中，4℃暗处放置至显出合适颜色。
9.将切片在水中清洗数次终止反应。
10.显微镜下观察并拍照。
附图8是采用恒温杂交法进行小鼠脊椎组织切片原位杂交的结果。图中S表示杂交信号。所用恒温杂交法是使切片在72℃保温6小时。附图9是采用脉冲杂交法进行小鼠脊椎组织切片原位杂交的结果。图中S表示杂交信号。所用温度脉冲杂交法是使切片在4小时内经历8个温度脉冲，每个温度脉冲是先经历5分钟的降温时间，使温度从高温回到37℃。然后在37℃经历10分钟低温时间，然后经历6分钟的升温时间，使温度由37℃上升至80℃，接着是在80℃经历9分钟高温时间。二者杂交的其他条件都一样。由附图8和附图9的比较可知，用脉冲杂交法进行原位杂交，可以较恒温杂交法明显缩短杂交时间，提高杂交效率。从采用脉冲杂交法的切片上可以观察到更多、更清晰的杂交信号。
3.液相杂交：
液相杂交的关键在于选用怎样的分离方法将杂交体与未杂交探针分离开。本实施例采用硝酸纤维素薄膜层析方法来分离杂交体与未杂交的探针。与纸色谱相似，硝酸纤维素薄膜层析是以硝酸纤维素作为载体，以硝酸纤维素上吸附的水分作为固定相，流动相可以是不与水相混溶的有机溶剂，也可以用与水相混溶的溶剂为流动相。因为硝酸纤维素吸附的水分中的一部分通过氢键与纤维素上的羟基结合成复合物，这部分水同与水相混溶的试剂仍能形成类似不相混溶的两相。本研究中是将膜先在4×SSC缓冲液中浸泡5分钟。然后凉干，因此固定相实际上是与水混溶的4×SSC缓冲液，流动相是水∶异丙醇(1.5∶1)系统。由于单链核酸分子的极性略大于双链分子，前者更倾向于留在固定相中，而后者则相反。这种表现在分配系数上的微小差别，随着色谱过程的进行，二者在固定相和流动相中不断地重新分配，原本微小的差别经过反复多次的重复，微小的差异累积起来就变成了大的差异，其结果就是双链核酸的斑点比单链核酸的斑点移动更快。具体方法如下：
杂交：
1.选取线性化的PBR 328 DNA为目的片段，以目的片段为模板，经标准的随机引物标记法制备DIG标记DNA探针。
2.吸取适量的目的片段溶液和探针溶液加至10×SSC缓冲液中，加适量水调整各组分终浓度为：40皮克/微升目的片段，10皮克/微升探针，2×SSC杂交缓冲液。
3.将上管震荡混匀，3000转/分钟离心3秒，置于PCR仪中，先96℃变性10分钟，然后60℃保温80分钟(恒温杂交法)或70℃，5分钟(37℃，5分钟，共4个或8个脉冲(脉冲杂交法)。
层析：
1.吸取杂交溶液1微升分别在一经4×SSC浸泡15分钟凉干后的大小适中的硝酸纤维素膜的距底边1厘米的地方点样，自然凉干。
2.将点好样的硝酸纤维素膜挂在装有适量展开剂(H2O∶异丙醇∶丁醇＝60∶1∶4)的层析缸中，密闭放置2小时，使膜被展开剂的蒸汽充分饱和，达到平衡后，将膜的底边小心浸入展开剂中，注意勿使点样原点直接接触展开剂。
3.然后密闭展开30分钟，当展开剂前沿接近膜上端时，将膜取出，标记前沿，凉干。
4.将膜置干燥箱中80℃保温1小时，使展开的斑点固定在膜上。
显色：
1.在适量显色缓冲液II中洗膜1分钟。
2.在适量显色缓冲液III中室温放置30分钟。
3.用显色缓冲液III以1∶5000比例稀释抗DIG-AP复合物溶液(0.5微升抗-DIG-AP复合物+2.5毫升显色缓冲液III)
4.将膜置上述溶液中室温放置30分钟。
5.将膜置适量显色缓冲液I中洗2次，每次15分钟。
6.将膜置适量显色缓冲液IV中平衡2分钟。
7.取20微升NBT/BCIP贮备液加至1毫升显色缓冲液IV中，混匀。
8.将膜置于上述新鲜配制的1毫升显色液中暗处放置12小时，勿振摇。
9.将膜取出，置适量显色缓冲液V中终止反应1分钟。
10.将膜拍照，凉干保存。
附图10是采用恒温杂交法和脉冲杂交法进行液相杂交效果的比较。通道1所点样品为40pg/ul目的片段与10pg/ul探针在2×SSC杂交缓冲液中液相60℃恒温杂交80分钟后的产物；通道2所点样品为不含目的片段的阴性对照；通道3所点样品为同等浓度目的片段和探针在同样的杂交缓冲液中采用温度脉冲杂交法在40分钟内进行4个脉冲杂交的产物，每个温度脉冲是先经历35秒钟的降温时间，使温度从高温回到37℃，然后在37℃经历4.4分钟低温时间，然后经历20秒钟的升温时间，使温度由37℃上升至76℃，接着是在76℃经历4.6分钟高温时间。通道4所点样品为同等条件下进行8脉冲杂交的产物。各样品进行液相杂交以及检测的其他条件(包括层析、显色等条件)都相同。采用脉冲杂交法的样品杂交效率较高而产生更多的杂交体(图中用D表示的杂交体斑点颜色更深，图中的S表示未杂交的单链探针产生的斑点)。因此，用脉冲杂交法进行液相杂交，同样可以较恒温杂交法明显缩短杂交时间，提高杂交效率。
其中，上述实施例所用部分溶液的组成如下：
1.预杂交缓冲液：7％SDS
0.5M Na2HPO4，pH7.2(20℃)
2.洗膜缓冲液I： 5％SDS
40mM Na2HPO4，pH7.2(20℃)3.洗膜缓冲液II：1％SDS
40mM Na2HPO4，pH7.2(20℃)4.20×SSC： 88.2g/L枸橼酸钠
175.3g/L氯化钠，pH7.0(20℃)5.显色缓冲液I： 0.1M顺丁烯二酸
1M NaCl，pH7.5(20℃)6.显色缓冲液II：含0.3％(w/v)Tween-20的显色缓冲液I。7.显色缓冲液III：含1％封闭剂的显色缓冲液I。8.显色缓冲液IV：100mM Tris-HCl
100mMNaCl
50mmMgCl2，pH9.5(20℃)9.显色缓冲液V：10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0(20℃)