λ-放线紫素及其制备方法 技术领域
本发明涉及天然色素λ-放线紫素及其制备方法。
背景技术
本发明涉及用微生物发酵法来制备天然色素及制得的天然色素λ-放线紫素。本发明所用的生产菌是天蓝色链霉菌100(Streptomyces Coelilolor 100)。本发明的方法包括斜面种子培养，摇瓶种子液体培养，摇瓶液体培养或发酵罐深层培养，发酵液预处理和提取等步骤。本发明所用的天蓝色链霉菌100已于1999年公开发表在国内期刊上，(详见《无锡轻工大学学报》，18(3)：23～28))。该菌是从无锡轻工大学校园下水道污泥中分离得到的产蓝色素的链霉菌新种。该菌株的持有人华东理工大学保证自本发明申请专利之日起20年内向公众发放给菌株。
本发明的发酵产品可作为天然色素应用于食品、化妆品行业，具有非常好的应用前景，还可作为天然pH指示剂加以开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的天然色素λ-放线紫素。
本发明的目的还在于提供一种制备λ-放线紫素的方法。
为实现以上技术目的，本发明采用了以下基于微生物发酵的方法：
(1)将保存的天蓝色链霉菌100孢子接种到斜面培养基上进行活化，所述的斜面培养基包含(g/L)：
甘露醇 15～30
黄豆粉 17～28
NaCl 0.15～0.6
K2HPO4 0.4～0.7
MgSO4·7H2O 0.1～0.6
琼脂 17～22
pH7.0～7.5；
(2)将步骤(1)得到的活化菌种接入种子培养基中进行摇瓶培养，所述种子培养基包含(g/L)：
可溶性淀粉 15～25
牛肉膏 1.5～3
NaCl 0.2～0.6
K2HPO4 0.15～0.6
MgSO4·7H2O 0.07～0.6
MnSO4 0.05～0.18
ZnCl2 0.05～0.23
FeSO4·7H2O 0.005～0.012
pH 7.0～7.5；
(3)将步骤(2)得到的菌种接入发酵培养基中进行摇瓶发酵或罐发酵，所述发酵培养基选自摇瓶发酵培养基或罐发酵培养基，所述摇瓶发酵培养基包含(g/L)：
葡萄糖 10～25
KNO3 1～3
NaCl 0.12～0.6
K2HPO4 0.2～0.6
MgSO4·7H2O 0.2～0.6
MnSO4 0.2～0.4
FeSO4·7H2O 0.005～0.012
pH 7.0～7.5；
所述罐发酵培养基包含(g/L)：
甘薯粉 15～40
豆饼粉 4～10
K2HPO4 0.2～0.6
MgSO4·7H2O 0.1～0.6
FeSO4·7H2O 0.005～0.012
pH 6.9～7.2。
(4)通过固—液分离获得上清液和菌丝体；
(5)对菌丝体进行pH 12的碱处理，并通过固—液分离获取上清液；
(6)将步骤(4)和(5)所得上清液合并，进行pH 2地酸处理，并通过固—液分离收集沉淀。
总的说来，本发明的方法包括两大阶段，即发酵培养阶段和分离提取阶段。其中，发酵阶段又分为种子制备阶段和生产性发酵阶段(见图1)。
本发明的种子制备阶段采用一步斜面培养加一步液体摇瓶培养。其中，所述斜面培养的条件和液体摇瓶培养的条件均参考了本领域通用的放线菌种子培养条件。例如，本发明实施方式中本发明所用的天蓝色链霉菌100菌株在使用前采取砂土管保存，当然，也可以采用冷冻干燥管或牛奶管等其他常用方法保存；本发明的种子斜面培养可以是28～32℃下培养1～3周；本发明的种子摇瓶培养可以是28～32℃下培养1天。所不同的是本发明采用了如前所述独特的斜面培养基和摇瓶种子培养基。
本发明的生产性发酵可以选用摇瓶发酵或罐发酵。其中摇瓶发酵和罐发酵的条件参考了本领域通用的放线菌发酵条件。例如，本发明实施方式中，如果采用摇瓶发酵，则可以在28～32℃的摇床上培养6～9天。如果采用罐发酵，则其条件可以是：接种量6～12％(v/v)，温度28～32℃，通气量1～4L/min，搅拌转速250～750r/min，发酵周期6～9天，pH7.0～7.5。所不同的是本发明采用了如前所述独特的摇瓶发酵培养基和罐发酵培养基。
本发明分离提纯过程中，用于分离菌丝体的固—液分离，出于效率和操作成本考虑，优选离心法，例如优选高速离心机。同样，本发明用于分离产物沉淀的固—液分离也可优选离心法，例如优选高速离心机。
本发明采用常用的碱处理来破碎细胞壁以提取胞内色素。所不同的是，本发明碱处理的pH约为12，优选用碱金属氢氧化物，例如KOH或NaOH来调定。较好的是，本发明碱处理可辅以强烈搅拌，例如400-600rpm，50-65℃，30-60min。
本发明采用酸处理来沉淀色素，其中，pH约为2，优选用HCl来调定。
经HPLC鉴定，用本发明方法所得的沉淀即为本发明含有λ-放线紫素等10种类似物的粗品。
进一步以HPLC纯化以上粗品，可以获得本发明λ-放线紫素的纯品，为紫红色粉末。其溶液在pH＜7时为红色；pH7～8时为红紫色；pH≥8时为蓝色。经质谱、碳谱、二维谱、红外、紫外及元素分析鉴定，本发明的λ-放线紫素分子式为C44H46O22，具有如下结构式：
熔点大于300℃；分子量为926，元素组成为C 57.06％，H 5.00％，O 37.94％，；甲醇中最大吸收波长分别为260、532nm。易溶于碱性溶液，溶于丙酮、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、甲醇、氯仿及酸性溶液等，不溶于石油醚。
附图说明
图1是本发明发酵工艺的流程图。
图2是本发明一次发酵过程中菌体浓度(▲)、葡萄糖(■)和色素产物(◆)变化曲线。
图3为本发明粗品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
实施例1
利用天蓝色链霉菌100发酵生产含λ-放线紫素的发酵液。
(1)将斜面保存的天蓝色链霉菌100孢子接种到斜面培养基上，在30℃下培养2周，所用斜面培养基包含(g/L)：
甘露醇 15
黄豆粉 17
NaCl 0.15
K2HPO4 0.4
MgSO4·7H2O 0.1
琼脂 17
pH 7.0；
(2)取天蓝色链霉菌100斜面一支，用接种针或接种铲挑生长良好的孢子接种到种子培养液中，30℃下摇瓶培养1天，所用种子培养基包含(g/L)：
可溶性淀粉 15
牛肉膏 1.5
NaCl 0.2
K2HPO4 0.15
MgSO4·7H2O 0.07
MnSO4 0.05
ZnCl2 0.05
FeSO4·7H2O 0.005
pH 7.0；
(3)将天蓝色链霉菌100菌丝接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在30℃下培养7天，摇床转速控制在200r/min，所用发酵培养基包含(g/L)：
葡萄糖 10
KNO3 1
NaCl 0.12
K2HPO4 0.2
MgSO4·7H2O 0.2
MnSO4 0.2
FeSO4·7H2O 0.005
pH 7.0；
经过7天发酵，得到含λ-放线紫素的发酵液。
实施例2
利用天蓝色链霉菌100发酵生产含λ-放线紫素的发酵液。
(1)将斜面保存的天蓝色链霉菌100孢子接种到斜面培养基上，在30℃下培养2周，所用斜面培养基包含(g/L)：
甘露醇 30
黄豆粉 28
NaCl 0.6
K2HPO4 0.7
MgSO4·7H2O 0.6
琼脂 22
pH 7.5；
(2)取天蓝色链霉菌100斜面一支，用接种针或接种铲挑生长良好的孢子接种到种子培养液中，30℃下摇瓶培养1天，所用种子培养基包含(g/L)：
可溶性淀粉 25
牛肉膏 3
NaCl 0.6
K2HPO4 0.6
MgSO4·7H2O 0.6
MnSO4 0.18
ZnCl2 0.23
FeSO4·7H2O 0.012
pH 7.5；
(3)将天蓝色链霉菌100菌丝接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在30℃下培养7天，摇床转速控制在200r/min，所用发酵培养基包含(g/L)：
葡萄糖 25
KNO3 3
NaCl 0.6
K2HPO4 0.6
MgSO4·7H2O 0.6
MnSO4 0.4
FeSO4·7H2O 0.012
pH 7.5；
经过7天发酵，得到含λ-放线紫素的发酵液。
实施例3
根据实施例1中所述的(1)和(2)步骤获得天蓝色链霉菌100菌丝，将其接种到装有3L罐发酵培养基的5-L发酵罐中，其培养条件为：接种量10％(v/v)，温度30℃，通气量3L/min，搅拌转速300r/min，发酵周期7天，pH6.9。所用发酵培养基包含(g/L)：
甘薯粉 15
豆饼粉 4
K2HPO4 0.2
MgSO4·7H2O 0.1
FeSO4·7H2O 0.005
pH 6.9；
经过7天发酵，得到含λ-放线紫素的发酵液。
实施例4
根据实施例1中所述的(1)和(2)步骤步骤获得天蓝色链霉菌100菌丝，将其接种到装有3L发酵培养基的5-L发酵罐中，其培养条件为接种量10％，温度30℃，通气量3L/min，搅拌转速300r/min，发酵周期7天，pH7.2。所用发酵培养基包含(g/L)：
甘薯粉 40
豆饼粉 10
K2HPO4 0.6
MgSO4·7H2O 0.6
FeSO4·7H2O 0.012
pH 7.2；
经过7天发酵，得到含λ-放线紫素的发酵液。
实施例5
如实施例4所述进行发酵后，放罐得到发酵液2L，离心(6000rpm，室温)，得到上清液1和菌丝体。菌丝体以去离子水稀释至1L，以2mol/L的KOH调pH至12，用磁力搅拌机搅拌，400rpm，50℃，30min。然后用高速离心机，6000rpm，室温下离心，得上清液2。将上清液1和上清液2合并，以2mol/L HCl调pH至2。然后用高速离心机，6000rpm，室温下离心，得沉淀，即本发明含λ-放线紫素的粗品。该产品可真空冷冻干燥以待后续处理或直接使用。
实施例6
如实施例4所述进行发酵后，放罐得到发酵液2L，离心(6000rpm，室温)，得到上清液1和菌丝体。菌丝体以去离子水稀释至1L，以2mol/L的KOH调pH至12，用磁力搅拌机搅拌，600rpm，65℃，60min。然后用高速离心机，6000rpm，室温下离心，得上清液2。将上清液1和上清液2合并，以2mol/L HCl调pH至2。然后用高速离心机，6000rpm，室温下离心，得沉淀，即本发明含λ-放线紫素的粗品。该产品可真空冷冻干燥以待后续处理或直接使用。
实施例7
以乙腈溶解以上所得粗品，进行HPLC(HP1100型)分析。柱子为ODS-C18柱(Kromasil，4.6×250mm，5μm)，进样体积25μl，温度30℃，检测波长260、530nm，流速1ml/min，用A相(水+1％HAc)和B相(乙腈)进行梯度洗脱：0～6min，B相从50％～50％；6～25min，B相从50％～75％。HPLC检测图谱见附图3。经HPLC分析，本发明粗品含有10个组分，其中组分10为λ-放线紫素，其它九个组分为λ-放线紫素的结构类似物。
实施例8
以乙腈溶解以上所得粗品，进行HPLC(HP1100型)纯化。柱子为ODS-C18柱(Kromasil，10×250mm，10μm)，进样体积400μl，温度30℃，检测波长260、530nm，流速2ml/min，用A相(水+1％HAc)和B相(乙腈)进行梯度洗脱：0～25min，B相从60％～80％；25～30min，B相从50％～75％。收集组分10，即λ-放线紫素洗脱液，冷冻干燥后得到本发明λ-放线紫素纯品。
经质谱、碳谱、二维谱、红外、紫外及元素分析鉴定，本发明的λ-放线紫素分子式为C44H46O22，具有如下结构式：
熔点大于300℃；分子量为926，元素组成为C 57.06％，H 5.00％，O 37.94％，；甲醇中最大吸收波长分别为260、532nm。易溶于碱性溶液，溶于丙酮、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、甲醇、氯仿及酸性溶液等，不溶于石油醚。