海狗油软胶囊及其在制备祛除黄褐斑、青春痘、妊娠斑的保健品中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种海狗油软胶囊及其在制备祛除黄褐斑、青春痘、妊娠斑的保健品中的应用。
背景技术
海狗为海豹科动物竖琴海豹(Harp seal)的俗称，栖居于北极和大西洋的北部。由于加拿大政府采取的保护措施，海狗的数量以每年5％的速度稳定增长。为保持海狗与鱼群之间的生态平衡，经联合国和加拿大政府批准，每年可以少量地捕杀海狗。
本产品取材于新捕猎的北极海狗皮下脂肪，经过真空蒸馏等工艺，在低温条件下除去蛋白、碳水化合物等物质，得到呈微黄色、透明液体状的精炼海狗油。
海狗油中富含人体必需的Ω-3型多碳不饱合脂肪酸(Ω-3PUFA)，其营养价值要优于其它食用油类。在海狗油中除发现鱼油中通常含有的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)外，还有含量可观的二十二碳五烯酸(DPA)。理想条件下提炼加工的海狗油，其中EPA、DHA和DPA的含量可达25％左右。
由于北极海狗仅栖居于加拿大沿海区域，目前国内关于海狗油保健作用的研究工作开展不多，而有关海狗油祛除黄褐斑功能的报导则更为少见。黄褐斑发病机理复杂，真正发病原因目前尚不十分清楚。多数学者认为，黄褐斑是因机体内分泌功能失调、血液流变学异常和微循环障碍、体内氧化及抗氧化功能失衡、过度日光照射等原因引起的色素代谢紊乱而表现于面部地一种慢性功能性疾病。
除机体内分泌功能异常外，黄褐斑形成的重要原因之一是由于机体血液流变性改变、血液粘度增加、红细胞和血小板凝集增多，组织细胞间的微循环受阻造成局部缺血，细胞失去供血而出现代谢异常，从而引起黑色素增多和色斑沉着。祖国传统医学认为，黄褐斑系由气血不和、脉络瘀血、废浊内留所致。部分病例治疗前后的血液流变学对照观察证实，在黄褐斑消褪的同时，血液流变学亦随之改善。研究表明EPA和DHA具有抑制血小板凝集、改变血液粘滞性及红细胞可塑性、增加血管通透性和扩张血管的作用。
黄褐斑形成的另一个重要原因是机体内氧化及抗氧化调节系统可能存在障碍，致使氧化酶系统的活性不能随脂质过氧化物(LPO)增多而增强，从而导致过氧化脂质的蓄积。许多研究表明，自由基与皮肤黑色素的形成及色素沉着有关。当自由基增多时，可使脂类形成LPO引起脂质过氧化作用，而皮脂中这种不稳定的LPO又很容易继续转变并分解为丙二醛(MDA)，诱发产生色素沉着性皮肤疾病。体内酶类抗氧化剂如超氧化物歧化酶等可清除自由基，抑制黄褐斑的形成。研究发现，黄褐斑患者血中LPO和MDA含量明显增高，而超氧化物歧化酶的活性则显著降低。
日光照射是黄褐斑形成的又一重要原因。过度日晒后黄褐斑几乎均加重，而避免日晒则可使黄褐斑减轻乃至消褪。紫外线作为一种外源性刺激黑素细胞分裂因素使照射部位黑素细胞增殖，这可能是黄褐斑好发于面部的原因之一。有文献报导，Ω-3PUFA可明显减轻日晒反应，并能提高多形日光疹的刺激阈值。
综上所述，海狗油中的Ω-3PUFA可通过改善血液流变性和血液微循环、提高机体抗氧化能力以及减轻皮肤日晒反应等机制抑制黄褐斑的形成并具有消褪黄褐斑的作用。功能试验结果证实，长期服用本产品能显著降低黄褐斑色度，减少黄褐斑的面积，且无新的黄褐斑产生。
维生素E作为一种抗氧化剂，在清除自由基过程中起着重要的作用，能够有效地抑制脂质过氧化物的产生，防止产品中的不饱和脂肪酸氧化变质。
CN1378843A(公开日2002年11月13日)公开了一种海狗油胶丸及其生产方法，该对比文件中提及的生产方法与本发明完全不同，实质上该对比文件描述的是海狗油的精制方法，而且该对比文件只字未提该产品在制备祛除黄褐斑的保健品中的应用。
本发明目的是提供一种海狗油软胶囊，它由精制海狗油和维生素E组成。
本发明另一个目的是提供海狗油软胶囊在制备祛除黄褐斑、青春痘、妊娠斑的保健品中的应用。
【发明内容】
本发明提供的一种海狗油软胶囊，其特征在于含有以重量计的精制海狗油99.5％，维生素E0.5％。将精制海狗油和维生素E的混合液与加热熔化的食用明胶置于胶囊成型机中制成软胶囊，然后经干燥，用75％食用酒精洗粒消毒即得产品。
本发明还提供了含上述组份和配比的海狗油软胶囊的在制备祛除黄褐斑、青春痘、妊娠斑的保健品中的应用。
本发明的海狗油软胶囊，其主要原料为精制海狗油，它是由加拿大进口的，呈浅黄色油状物，具有海狗油固有香味，无异味，无肉眼可见外来杂质，理化指标应符合表1的规定。
表1 精制海狗油的理化指标 项 目 指标水分及挥发物，％ ≤ 0.2酸价，mg KOH/g ≤ 2.0过氧化值，meq/Kg ≤ 6.0杂质，％ ≤ 0.1
制备本发明海狗油软胶囊使用的维生素E原料应符合GB14756的规定，所用的明胶应符合GB6783的规定。
本发明的海狗油软胶囊色泽为微黄色，内容物为浅黄色至黄色油状物，胶囊表面光泽，具有海狗油固有香味，无异味，无肉眼可见外来杂质。
本发明海狗油软胶囊的理化指标如表2所示，微生物指标如表3所示，功效成份如表4所示。
表2 海狗油软胶囊的理化指标 项 目 指标净含量，g/粒 0.5净含量允许负偏差，％ ≤ 9.0水分及挥发物，％ ≤ 1.3崩解时限，min ≤ 60.0酸价，mg KOH/g ≤ 2.0过氧化值，meq/Kg ≥ 16.0维生素E，mg/100g ≥ 350砷(以As计)，mg/Kg ≤ 1.0铅(以pb计)，mg/Kg ≤ 1.5汞(以Hg计)，mg.Kg ≤ 0.3
表3 海狗油软胶囊的微生物指标 项 目 指标菌落总数，cfu/g 1000大肠菌群，MPN/100g 40霉菌计数，cfu/g 10酵母计数，cfu/g 10致病菌 不得检出注：致病菌系指沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌
表4 海狗油软胶囊的功效成份 项 目 指标二十二碳六烯酸(DHA)，g/100g ≥ 7.15二十碳五烯酸 (EPA)，g/100g ≥ 6.32二十二碳五烯酸(DPA)，g/100g ≥ 3.37
表4中二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)的检验按GB/T17376、GB/T17377的规定进行。
本发明海狗油软胶囊的毒理学安全性测试如下：
试验动物：昆明种小白鼠，由中国医科大学实验动物部提供，批准证号：辽实动质字[2000]015号。
Wistar大白鼠，由中国医科大学医学实验动物部提供，批准证号：辽实动质字[2000]015号。
1、小鼠急性毒性试验：选用健康昆明种小白鼠40只，雌雄各20只，进行试验。小鼠体重为18.1-22.0g。每个性别小鼠随机分成四个剂量组，分别为：21.50、10.00、4.64、2.15g/Kg.bw，各剂量组以植物油配制。小鼠灌胃后连续观察14天。记录中毒表现及死亡情况，试验结果如表5所示。
表5 小鼠急性毒性试验结果
剂量组 雄性 雌性
(g/kg.bw) 实验动物数 死亡动物数 实验动物数 死亡动物数
21.50 5 0 5 0
10.00 5 0 5 0
4.64 5 0 5 0
2.15 5 0 5 0
厂家推荐成人(体重以60kg计)日摄入定型产品最大量0.033g/kg.bw，最高剂量组给予受试物21.50g/kg.bw，换算相当于成人日摄入定型产品量的652倍。实验观察14天各剂量组未见中毒症状，死亡数为零。受试物对两种性别小鼠的急性毒性LD50均大于15.00g/kg.bw，根据毒性分级，属无毒级。LD50大于厂家推荐成人日摄入量10倍，可进入下一阶段毒理学实验。
2、遗传毒性试验：
①Ames试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四个试验菌株进行试验。采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统。试验设0.313、0.625、1.250、2.500、5.000mg/皿5个剂量，各剂量组以二甲基亚砜(DMSO)稀释，同时设空白对照、溶剂对照、阴性对照(蒸馏水)、和阳性对照(非活化系统TA97、TA98、TA102为敌克松50.0μg/皿，TA100为叠氮钠1.5μg/皿。活化系统采用二氨基芴10.0μg/皿)。在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液，代谢活化时加入0.5mL S9混合液，混匀后倒入底层培养基平板上。在37℃培养48小时，计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数2倍以上，并具有剂量--反应关系者则定为阳性。每个剂量做三个平行。整套试验在相同条件下重复做两次并分别统计，试验结果如表6、7所示。
表6 Ames试验结果(第一次)
剂量 TA97 TA98 TA100 TA102
(mg/皿) -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9
5.000 139.3±36.7 135.7±28.7 41.0±4.4 41.0±7.0 122.3±7.5 144.7±20.6 293.3±29.1 277.3±26.1
2.500 122.0±32.2 122.7±13.2 36.3±4.9 40.0±6.6 173.0±25.6 142.0±13.2 274.0±28.6 271.0±18.3
1.250 130.7±20.7 114.3±17.6 44.7±2.5 39.0±6.6 162.0±25.0 143.3±43.0 258.7±9.5 273.3±22.1
0.625 145.0±6.9 119.3±25.5 42.7±6.0 42.7±6.7 162.3±20.8 129.7±15.0 297.7±24.4 291.3±8.7
0.313 152.7±13.0 125.0±18.7 45.3±2.3 38.7±7.6 137.3±18.1 131.0±27.2 290.7±22.9 292.3±21.9
空白对照 127.7±28.4 117.3±28.7 46.0±3.6 37.3±6.7 144.3±48.0 153.0±44.5 301.7±10.5 279.7±17.0
溶剂对照 141.7±28.9 140.0±27.2 47.0±3.6 35.7±1.5 170.0±34.8 141.3±32.1 285.7±26.1 279.7±30.0
阴性对照 122.7±15.8 148.0±30.3 38.0±7.2 36.7±7.6 159.7±32.3 169.0±20.0 255.3±7.1 287.0±40.1
阳性对照 2037.7±78.9 1162.7±162.1 909.0±60.8 2482.7±204.1 1763.3±40.3 2479.3±215.1 895.0±3.0 267.3±13.5
表7 Ames试验结果(第二次)
剂量 TA97 TA98 TA100 TA102
(mg/皿) -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9
5.000 138.0±19.7 136.7±17.6 39.3±4.9 37.7±8.1 128.0±10.1 131.0±45.9 282.3±26.6 270.0±28.9
2.500 154.7±17.6 147.9±15.5 41.7±6.7 37.3±3.8 152.3±41.9 147.7±36.3 258.0±25.2 258.0±17.4
1.250 152.7±25.0 150.9±39.2 43.3±5.0 37.3±4.5 150.7±28.3 129.3±19.7 293.3±6.5 292.3±23.9
0.625 121.7±18.8 144.0±6.5 38.3±2.1 40.7±4.7 159.3±27.6 139.7±42.2 282.3±27.3 283.3±35.4
0.313 136.3±8.7 145.8±12.7 36.0±5.3 38.0±7.0 161.3±31.6 152.0±23.6 278.3±28.7 284.3±27.8
空白对照 150.0±26.5 154.5±40.4 38.3±7.0 35.3±4.5 139.0±46.0 165.0±18.5 274.3±37.9 288.7±18.7
溶剂对照 114.3±27.7 134.2±27.1 44.7±5.9 41.0±7.0 128.3±1.2 107.7±3.2 267.7±22.0 272.3±25.8
阴性对照 133.7±37.2 141.3±40.5 38.3±2.3 44.0±4.4 153.7±20.8 162.0±13.7 281.3±16.5 272.0±24.1
阳性对照 2088.3±92.5 1414.3±168.3 913.3±29.2 2492.3±423.4 2071.3±122.8 2803.3±406.4 822.0±21.9 277.3±6.4
由表6、7可见，各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照组回变菌落数的二倍，亦无剂量--反应关系。说明该受试物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四菌株，加与不加S9，均未呈现遗传毒性。
②小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验，灌胃量0.2mL/10g体重。用体重25.6-30.0g小白鼠，按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。以40mg/kg.bw剂量的环磷酰胺(CP)为阳性对照，熟豆油为阴性对照，受试物剂量为0.94、1.88、3.75、7.50g/kg.bw，用熟豆油配至所需浓度。末次给药后6小时，颈椎脱臼处死动物，取股骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)，微核发生率以含微核的PCE千分率计，试验结果如表8所示。
表8 小鼠骨髓PCE微核试验结果
剂量组 动物数 检查PCE数 含微核PCE 微核数
性别
(g/kg.bw) (只) (个) 数(个) (‰)
7.50 5 5×1000 5 1.0
雄 3.75 5 5×1000 8 1.6
1.88 5 5×1000 7 1.4
0.94 5 5×1000 8 1.6
性 阴性组 5 5×1000 9 1.8
阳性组 5 5×1000 124 24.8
7.50 5 5×1000 7 1.4
雌 3.75 5 5×1000 5 1.0
1.88 5 5×1000 6 1.2
0.94 5 5×1000 7 1.4
阴性组 5 5×1000 6 1.2
性 阳性组 5 5×1000 111 22.2
经卡方检验，各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，阳性对照组与阴性对照组比较有高度显著性差异(P＜0.01)。该受试物小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验为阴性。
③小鼠精子畸形试验：用体重26.5-30.0g的性成熟雄性小鼠，按体重随机分组。受试物剂量为1.88、3.75、7.50g/kg.bw，用熟豆油配至所需浓度。以40mg/kg.bw环磷酰胺(CP)为阳性对照组，蒸馏水为阴性对照组，熟豆油为溶剂对照。以上各试验组每日灌胃一次，连续5天，灌胃量0.2mL/10g体重，末次灌胃后第30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，每组计数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率，试验结果如表9所示。
表9 小鼠精子畸形试验结果
剂量组 动物数 观察精 精子畸形类型 畸形精 畸形率
(g/kgbw) (只) 子数(个) 无定形 无钩 胖头 香蕉形 双头 双尾 尾折叠 其它 子数(个) (‰)
7.50 5 5×1000 52 20 17 29 0 0 2 0 120 24.0
3.75 5 5×1000 36 33 29 24 0 0 0 0 122 24.4
1.88 5 5×1000 62 25 15 23 0 0 0 0 125 25.0
阴性对照组 5 5×1000 54 31 21 18 0 0 1 0 125 25.0
溶剂对照组 5 5×1000 45 29 25 15 0 0 2 0 116 23.2
阳性对照组 5 5×1000 163 132 123 112 0 0 36 0 566 113.2
经Wilconson秩和检验，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，阳性对照组与阴性对照组比较有高度显著性差异(P＜0.01)。小鼠精子畸形试验为阴性。
3、30天喂养试验
试验动物：选用体重55.2-69.9g Wistar大白鼠。
试验方法：将大鼠随机分为对照组及三个受试物组，厂家推荐成人(体重以60kg计)每日摄入定型产品最大量为2.000g/60kg.bw(按内容物计算)。最高剂量组为B组以成人日最大摄入量的100倍计，即3.333g/kg.bw，以下中、低剂量组以1/5递减，即C组0.667g/kg.bw，相当于成人最大摄入量的20倍，D组0.133g/kg.bw，相当于成人最大摄入量的4倍，每组10只大鼠。将B、C、D三个试验组受试物均匀掺入基础饲料中，含量依此为3.333％、0.667％、0.133％。对照组(A组)喂饲正常基础饲料。大鼠饲料摄入量按体重10％计算，单笼喂养，自由饮食，记录大鼠进食量、体重，连续观察30天。
临床观察：动物的一般表现、行为、中毒症状、及死亡情况，每周称一次体重、摄入量，计算食物总利用率。
测血常规及生化指标：于试验第31天尾静脉取血，采用日本CA-300血球自动计数仪，测定血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)。股动脉取血，采用北京中生生物工程高技术公司提供的试剂盒、荷兰VITALAB-MICRO生化分析仪测定谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)、甘油三脂(TG)。
病理解剖：大体观察、脏器系数、病理组织检查(肝、肾、脾、胃及十二指肠)
试验结果如表10、11、12、13、14所示。
1、对大鼠体重的影响如表10所示：
表10 30天喂养试验大鼠体重测定结果
剂 动物
始重 第1周体重 第2周体重 第3周体重 第4周体重
量 数
(g) (g) (g) (g) (g)
组 (只)
A 10 64.6±4.0 95.3±6.8 128.9±10.7 174.7±16.8 209.6±22.9
B 10 62.4±5.3 91.7±7.4 135.6±8.8 182.6±13.4 220.4±14.3
雄
C 10 65.4±4.7 94.2±5.9 124.2±10.4 170.0±18.2 207.3±19.5
D 10 63.0±5.1 97.0±8.2 133.7±11.2 175.2±11.5 209.9±11.4
A 10 60.7±4.1 86.6±7.2 127.0±13.0 160.4±16.9 186.4±17.1
B 10 62.9±4.1 87.4±6.6 128.7±11.4 160.1±14.9 186.5±15.8
雌
C 10 65.9±4.3 91.7±6.6 129.8±12.4 166.0±15.5 194.2±17.4
D 10 61.2±4.6 86.1±7.4 126.6±9.7 155.8±12.6 181.5±13.8
由表10可见，各组动物生长活动正常。各剂量组动物体重与对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)。
2、对大鼠总食物利用率的影响如表11所示：
表11 30天喂养试验总食物利用率测定结果
剂量 动物数 体重增重 进食量 食物利用率
性别
组 (只) (g) (g) (％)
A 10 145.0±22.3 517.2±58.0 28.0
B 10 158.0±15.1 547.0±46.0 28.9
雄
C 10 141.9±16.7 514.1±54.4 27.6
D 10 146.9±12.1 534.2±39.1 27.6
A 10 125.7±17.7 479.0±50.1 26.2
B 10 123.6±16.0 484.2±46.0 25.5
雌
C 10 128.3±16.3 504.9±45.6 25.4
D 10 120.3±13.0 475.6±33.9 25.2
由表11可见，受试物掺入饲料中喂饲大鼠30天，动物未出现拒食现象，各剂量组动物食物利用率与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
3、血液学检查结果如表12所示：
表12 30天喂养试验血液学检查结果
动物数 血红蛋白 红细胞计数 白细胞计数
性别 剂量组
(只) (g/dL) (×1012/L) (×109/L)
雄 A 10 15±3 10.37±1.29 9.7±2.0
B 10 14±2 10.59±1.42 9.7±1.5
C 10 13±4 10.02±1.31 9.2±1.7
D 10 14±4 9.88±0.95 9.4±2.0
A 10 14±4 9.67±1.34 9.1±1.5
B 10 15±3 9.92±1.47 9.8±1.5
雌
C 10 14±4 9.39±1.45 8.9±2.1
D 10 13±3 9.49±1.26 9.9±1.5
由表12可见，各剂量组的血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
4、30天喂养试验生化检验结果如表13所示：
表13 30天喂养试验生化检验结果
剂 动物
性 GPT BUN GOT CR GLU TP AIB CHO TG
量 数
别 (U/L) (mmol/L) (U/L) (μmol/L) (mmol/L) (g/dL) (g/L) (mmol/L) (mmol/L)
组 (只)
A 10 86±15 6.336±0.704 180±45 110.0±6.3 9.80±1.06 10.4±0.7 44.9±4.1 2.89±0.64 1.19±0.34
B 10 77±26 6.756±0.885 223±136 115.2±7.2 9.31±0.86 10.9±0.5 44.0±2.1 2.69±0.57 1.19±0.39
雄
C 10 90±23 6.439±0.869 185±43 108.7±12.1 9.65±1.17 10.4±0.5 44.4±2.4 2.47±0.58 1.36±0.45
A 10 73±14 6.565±0.690 202±39 101.4±8.3 9.39±1.34 10.4±0.7 44.4±3.8 2.91±0.58 1.45±0.53
B 10 71±21 6.436±0.666 221±134 107.8±12.5 9.12±1.17 10.9±0.7 45.1±2.8 2.91±0.45 1.22±0.54
雌
C 10 85±19 6.740±0.596 196±35 102.7±13.2 10.12±1.09 10.5±0.7 46.2±3.7 2.75±0.47 1.38±0.50
D 10 77±20 6.069±0.485 176±30 106.6±12.7 9.09±0.51 10.1±0.5 46.1±3.1 2.88±0.79 1.48±0.54
由表13可见，各剂量组的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)、甘油三脂(TG)与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
5、受试物对大鼠脏体比的影响：
表14 30天喂养试验大鼠脏体比的测定结果
性别 剂量组 动物数(只) 肝/体(％) 脾/体(％) 肾/体(％)
A 10 3.74 0.24 0.78
B 10 3.47 0.25 0.75
雄
C 10 3.71 0.25 0.73
D 10 3.76 0.25 0.78
A 10 3.69 0.25 0.78
B 10 3.72 0.26 0.78
雌
C 10 3.75 0.24 0.76
D 10 3.65 0.22 0.75
由表14可见，各剂量组与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
6、病理组织学检查：
各组动物大体观察未发现异常，解剖时亦未发现膀胱、肝总管结石，镜下观察动物的肝、脾、肾、胃、十二指肠均未见有意义的病理改变。
试验结果表明该受试物掺入饲料中喂饲大鼠30天，对各剂量组动物体重增长、食物利用率、血常规、血生化指标、脏器系数等各项指标均未见不良影响。病理组织学观察，肝、脾、肾、胃、十二指肠均未见有意义的病理改变。
本发明海狗油软胶囊具有祛除黄褐斑的作用，具体测试如下：
1、详细询问病史，主要观察：黄褐斑面积、颜色深浅、有无新的黄褐斑出现，色度测定采用实用色谱卡中的棕色卡Bn(C+M+Y)(中国科学院地理研究所研制，测绘出版社出版)。用标尺测量量受试者试食前后同一黄褐斑的长径和宽径，计算面积(mm2)。
2、进行安全性观察：
①血液及尿常规检查：血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、尿常规。
②血生化指标测定：总胆固醇、甘油三脂、谷丙转氨酶、总胆色素、尿素氮、肌酐、血糖。
③胸透、心电图、腹部B超。
3、功效判定：
试食前后记录面部黄褐斑情况，在黄褐斑的面积及颜色深浅等方面有显著性差异，且不增加新的黄褐斑，即可判定受试物有祛黄褐斑的作用。
4、试验结果：
35例黄褐斑受试者面部均有大小不等、形状各异的点面状黄褐斑，受试者均为女性，年龄在28-50岁之间，受试者试食“海狗油软胶囊”每日2次，每次2粒，连续服用30天后，在饮食、睡眠、大小便、精神状态等方面无明显改变。
①黄褐斑面积的变化
表15 海狗油软胶囊对黄褐斑面积(mm2)的影响
例数 试食前 试食后 P值
35 2333.43±859.91 2200.86±826.11 ＜0.01
由表15可见，服用海狗油软胶囊30天后，可明显减小黄褐斑的面积(P＜0.01)。
②黄褐斑色度的变化
表16 海狗油软胶囊对黄褐斑色度的影响
例数 试食前 试食后 P值
35 1.66±0.29 1.29±0.28 ＜0.01
由表16可见，服用海狗油软胶囊30天后，可明显降低黄褐斑的色度(P＜0.01)。
③症状改善情况
表17 主要症状改善情况
主要症状 例数 有效 无效 有效率(％)
失眠 4 1 3 25.00
疲劳感 3 0 3 0.00
烦躁 2 2 0 100.00
胸胁胀痛 2 2 0 100.00
便秘 4 1 3 25.00
④安全性指标检测
表18 安全性指标检测结果
观察项目 例数 服用前 服用后
总胆固醇(mg/dl) 35 175.97±19.35 177.89±19.73
甘油三脂(mg/dl) 35 117.23±42.51 116.04±39.08
谷丙转氨酶(U/L) 35 17.56±6.08 17.74±5.35
总胆红素(mg/dl) 35 0.54±0.16 0.54±0.14
肌酐(mg/dl) 35 0.62±0.14 0.64±0.13
尿素氮(mg/dl) 35 14.50±4.09 15.50±4.67
血糖(mg/dl) 35 91.06±11.53 90.74±10.43
血红蛋白(g/dl) 35 13.28±0.64 13.35±0.73
红细胞(×1012/l) 35 4.20±0.30 4.21±0.31
白细胞(×109/l) 35 5.91±1.14 6.06±1.14
表18显示所有受试者服用海狗油软胶囊30天后，血常规、尿常规、血生化指标均在正常范围内。
⑤胸透、心电图、腹部B超均属正常。
结论：
35例经体检合格的黄褐斑自愿受试者，按要求服用海狗油软胶囊，每日2次，每次2粒，连续30天。结果表明：海狗油软胶囊能显著降低黄褐斑色度(P＜0.01)，减少黄褐斑的面积(P＜0.01)，并且未观察到新的黄褐斑产生。受试者试食后血常规和血生化指标均无明显改变，而且无过敏及不良反应。
本发明海狗油软胶囊稳定性检测结果如表19所示：
表19 海狗油软胶囊稳定性检测结果
批号 20010520 20010601 20010610
第0个月稳定性试验
菌落总数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
大肠菌群，MPN/100g ＜30 ＜30 ＜30
致病菌 未检出 未检出 未检出
霉菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
酵母菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
二十碳五烯酸，％ 6.47 6.75 6.32
二十二碳六烯酸，％ 7.49 7.66 7.15
二十二碳五烯酸，％ 3.62 3.43 3.37
酸价 1.25 1.24 1.22
过氧化值，meq/kg 15.62 15.57 15.31
维生素E，mg/100g 398 392 402
铅，mg/kg ＜0.12 ＜0.12 ＜0.12
砷，mg/kg ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
汞，mg/kg ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003
水分及挥发物，％ 1.11 1.16 1.09
第1个月稳定性试验 保存条件：相对湿度75％ 温度37℃
菌落总数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
大肠菌群，MPN/100g ＜30 ＜30 ＜30
致病菌 未检出 未检出 未检出
霉菌计数cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
酵母菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
二十碳五烯酸，％ 6.48 6.85 6.44
二十二碳六烯酸，％ 7.52 7.73 7.26
二十二碳五烯酸，％ 3.68 3.57 3.49
酸价 1.23 1.21 1.24
过氧化值，meq/kg 15.67 15.53 15.38
维生素E，mg/100g 420 390 397
铅，mg/kg ＜0.12 ＜0.12 ＜0.12
砷，mg/kg ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
汞，mg/kg ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003
水分及挥发物，％ 1.13 1.16 1.10
第2个月稳定性试验 保存条件：相对湿度75％ 温度37℃
菌落总数，cfu/g 10 30 10
大肠菌群，MPN/100g ＜30 ＜30 ＜30
致病菌 未检出 未检出 未检出
霉菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
酵母菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
二十碳五烯酸，％ 6.52 6.43 6.66
二十二碳六烯酸，％ 7.49 7.27 7.48
二十二碳五烯酸，％ 3.52 3.72 3.75
酸价 1.26 1.24 1.25
过氧化值，meq/kg 15.68 15.43 15.40
维生素E，mg/100g 389 389 398
铅，mg/kg ＜0.12 ＜0.12 ＜0.12
砷，mg/kg ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
汞，mg/kg ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003
水分及挥发物，％ 1.16 1.19 1.11
第3个月稳定性试验 保存条件：相对湿度75％ 温度37℃
菌落总数，cfu/g 20 50 20
大肠菌群，MPN/100g ＜30 ＜30 ＜30
致病菌 未检出 未检出 未检出
霉菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
酵母菌计数，cfu/g ＜10 ＜10 ＜10
二十碳五烯酸，％ 6.74 6.80 6.79
二十二碳六烯酸，％ 7.81 7.64 7.39
二十二碳五烯酸，％ 3.64 3.47 3.65
酸价 1.27 1.26 1.25
过氧化值，meq/kg 15.74 15.52 15.48
维生素E，mg/100g 395 396 396
铅，mg/kg ＜0.12 ＜0.12 ＜0.12
砷，mg/kg ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
汞，mg/kg ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003
水分及挥发物，％ 1.16 1.22 1.15
具体实施方式：
下面实施例是为了进一步说明本发明.
实施例1
取加拿大进口精制海狗油99.5kg、维生素E0.5kg，制成每粒0.5g的胶囊200000粒，其中每100g含有效成分为：二十二碳六烯酸(DHA)7.15g、二十碳五烯酸(EPA)6.32g、二十二碳五烯酸(DPA)3.37g，对有黄褐斑者口服每日2次，每次2粒，服用30天，具有明显祛除黄褐斑、青春痘、妊娠斑功效。