一种对酒精性肝损伤具有辅助保护作用的中药制剂及制备方法 技术领域：
本发明涉及中药领域，具体涉及一种对酒精性肝损伤具有辅助保护作用的中药制剂及制备方法。
背景技术：
对酒精性肝损伤辅助保护的保健食品有着很大的适应人群，从《神农本草经》到《千金方》，从《本草纲目》到《名医别录》，均记载了许多解除酒精毒性、缓解生理反应的中草药。近代更出现了各种解酒的单方或复方。中国专利(申请号90105366，公开号1058907A)报道了一种解酒保肝的中药口服液，制作方法采用传统中药煎煮法，有效成分不清，作用机理不明，未提供足够的药理学及病理学解释。同时未进行相关的动物或人体实验，毒理危害性不明确。中国专利(申请号96103872，公开号1164397)，中国专利(申请号998100420，公开号1189368)所提供的保肝解酒制剂也存在类似的问题。美国专利5,559,152提供了服用两种化学酸性物-丁二酸与柠檬酸来降低酒精对人体的危害的方法，根据酸与醇反应生成酯的原理实现解酒的目的，但同时该专利提到这两种酸过量服用后均有损害胃黏膜的后患。美国专利5,798,371提供了服用另两种合成物-L-苏氨酸与VB6来抑制酒精对人体的危害的方法，美国专利5,888,532提供的口服化合物则是辅酶NAD和NADP，这后两个专利均提到相关的合成物可能会引发由镇静作用导致的头昏。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于采用现代提取分离技术，提取若干种中草药及纯天然植物中有效成分，提供一种作用机理明确、疗效显著的酒精性肝损伤保健功能地中药制剂。
本发明公开的对酒精性肝损伤具有辅助保护作用的中药制剂是以含葛根、枳椇子、陈皮、五味子、黄芪的有效成份提取物为活性成份制成的口服制剂。
所述的活性成份生药重量百分比组成为：葛根29％-34％，枳椇子19％-25％，五味子19％-25％，黄芪9％-15％，陈皮9％-15％。
所述的口服制剂为医学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液等。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述中药制剂的制备方法。
本发明公开的对酒精性肝损伤具有辅助保护作用的中药制剂的制备包括下列步骤：
(1)中药活性成份提取物制备
按处方量挑选葛根、枳椇子、陈皮、五味子、黄芪药材，洗净、粉碎后，用沸水提取3次，过滤得滤液，滤液浓缩后，用75％酒精沉淀过夜，离心，固体干燥；
(2)口服制剂的制备
将步骤步骤(1)制得的中药活性成份提取物混合，按常规方法与药用辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸或口服液。
本发明制剂活性成份定量标准按《中国药典2000版》一部葛根项下的有关规定进行，葛根素≥21mg/g。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述制剂在制备对酒精性肝损伤辅助保护作用的保健品中的应用。
本发明酒精性肝损伤中药制剂的口服剂量为0.5-1.5g(相当于，生药1.5g-4.55g)，30天为一疗程。
本发明处方中以有较强解毒功能的葛根、枳椇子为君药，辅以调肝固肾的五味子及甘温益气、舒肝解郁的黄芪为臣药，佐以理气健脾、生津养胃的陈皮，诸味配伍，共奏保肝护肝之功效，对酒精性肝损伤有辅助保护作用。
肝为将军之官，为藏血之脏。主疏泻、性喜条达而恶抑郁，尤易受外来邪毒侵淫。本方中，葛根味甘平，主消食，解诸毒，治天行上气，呕逆，开胃下食，主解酒毒，去烦渴(《神农本草经》)；枳椇子味甘平、无毒，止渴除烦，去膈上热，润五脏，利大小便，止呕逆，解酒毒(《本草纲目》)；五味子——味酸、温，主益气，补不足，强阴、益男子精(《神农本草经》)；黄芪性温，味甘，具有补气固表、利尿托毒作用(《神农本草经》)；陈皮——辛、甘、寒、无毒。下气调中，解酒毒及酒渴。(《本草纲目》)。
本发明处方中葛根的主要有效成分为以下几类：异黄酮类(包括葛根素)，葛根苷类，三萜皂苷类，生物碱及其他化合物。在葛根的有效成分中，最受关注的是葛根素、大豆苷元等异黄酮类成分。葛根可明显的扩张冠状血管，降低心肌氧耗量，可降低血压，对抗抗心律失常及改善脑循环，抑制血小板聚集，治疗偏头痛等，此外还具有抗癌作用。葛根能通过消除氧自由基和抗脂质过氧化使酒精致血清粘度异常变化恢复到正常状态。葛根异黄酮类可显著抑制氧化损伤引起的红细胞溶血，并提高体内SOD活性强度，葛根总黄酮可对抗东莨菪碱、亚硝酸钠、乙醇、氮气吸入及双侧颈总动脉阻断再灌流引起的小鼠记忆障碍；可显著改善D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的记忆功能。
历代医书均有葛根具有解酒醉不醒功能的记载，我国民间也有用葛根解酒的习惯.樊经建等报道了葛根解酒液体饮料的生产工艺过程；杨波等研制了固态的葛根解酒茶，并称其解酒机制为：激发肝脏P-450酶系统，加速酒精降解转化而解酒毒，为“治本之法”，葛根能有效地拮抗酒精引起的肝和睾丸组织脂质过氧化损害，有望作为可靠的解酒药物来开发。
枳椇子为鼠李科植物枳椇(Hoveniadulcis Thunb)的干燥成熟种子。文献记载其具有解酒，醒酒之功效，对小鼠急性酒精中毒有治疗作用，它能降低体内乙醇浓度，缩短醒酒时间，并能拮抗乙醇所致的小鼠肝脏脂质过氧化。枳椇子水提取液能阻止乙醇所致的小鼠肝脏丙二醛(MDA)升高和GSH下降，并能对抗乙醇所致的胆固醇、三油酸甘油酯增高，提示其对酒精致小鼠肝脏脂质过氧化具保护作用，且有可能延缓和防止乙醇所致的脂肪肝的形成。
五味子为木兰科植物北五味子(Schisandra chinensis Baill)和南五味子(华中五味子)S.sphenanathera Rehd.et Wils的成熟果实。六十年代末和七十年代初，我国临床首先发现五味子粉剂或蜜丸对病毒性肝炎病人有降血清谷丙转氨酶(SGPT)及改善某些症状的效果。国内外学者已从各种五味子植物中分离出90余种木脂素类及有机酸和一些挥发性成份。目前我国在五味子的临床疗效、有效成份、药理作用及植物资源方面作了大量研究，已发现五味子对肝脏的作用具有明显的保护作用。包天桐，刘耕陶等用四氯化碳、硫代乙酰胺和乙炔雌二醇环戊醚引起小鼠肝损伤为模型，发现五味子的醇提物和从五味子中分离出的上述五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲和酯乙均有不同程度的降低因化学物质引起的血清转氨酶升高作用，能明显减轻肝小叶的坏死，作者推测，五味子对四氯化碳损伤大鼠肝脏的保护作用可能是通过肝细胞内蛋白质合成代谢实现的。用五味子醇提物，预先24h给药能显著降低大剂量扑热息痛(400mg/kg)肝中毒所致的小鼠死亡率，并防止肝内谷胱甘肽的耗竭，增强肝微粒体代谢扑热息痛的速度，血中扑热息痛含量下降。睢大员，高普军等发现，北五味子多糖可显著减低四氯化碳中毒小鼠肝中丙二醛的含量，抑制小鼠肝脏脂质过氧化反应，促进正常小鼠的胆汁分泌和部分肝切除后肝的再生。
黄芪为临床常用中药，现代药理学研究表明其含有多种有效成分，具有强心利尿、保肝强肾、抗衰老及免疫促进等多种药理作用。黄芪多糖及黄芪总甙可对抗四氯化碳及醋氨酚引起的小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的升高，并对四氯化碳及醋氨酚引起的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，汪德清等也发现黄芪总黄酮对扑热息痛引起的小鼠肝损伤具有明显的保护作用，可明显降低小鼠的死亡率，降低血清转氨酶及肝脏坏死的面积。
陈皮具有理气健脾、燥湿化痰功效。用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。
本发明制剂采用现代生化分离提取方法提取浓缩的有效成分所组成，同时进行了系统的动物实验和药理及病理分析，发现对酒精性肝损伤具有明显的保护作用，能明显降低甘油三酯，丙二醛的含量，升高还原性谷胱甘肽的含量，缓解病理症状。其保护酒精中毒性肝损伤的机理是：抑制乙醇在消化道的吸收、降低血液及肝脏中乙醇的浓度，促进已吸收乙醇的代谢并加速其代谢产物乙醛的排泄，从而达到解除酒毒、保肝护胃的作用。
动物实验表明，本方可提高动物对酒精等化学物质的耐受力，降低血液和组织中的酒精等化学物质的浓度；经组织形态学研究表明，对鼠肝损伤有很好的保护作用。
用本发明制剂进行有关功能和毒理试验：
一、本发明制剂(澳博牌九通胶囊)对酒精性肝损伤的保护功能研究
取澳博牌九通胶囊0.08g、0.17g、0.5g分别加蒸馏水至20ml，为高、中、低三个剂量组供试液。另设肝损伤模型组和阴性对照组(给予蒸馏水)。昆明种小白鼠，18-22克，雌性，50只，随机分5组，每组10只。各剂量组给以九通胶囊，阴性对照组和50％乙醇肝损伤模型组分别给予等量蒸馏水，连续30天，每周称体重，调整给样量。第30天各剂量组及50％乙醇肝损伤模型组给予50％乙醇染毒。禁食12小时后，各组动物取肝脏，制成10％肝匀浆，分别测定如下生化指标：甘油三酯、丙二醛、还原性谷光甘肽；并取肝脏进行病理组织学检查。
由表1样品对动物体重的影响可见，样品各剂量组体重与乙醇模型组相比，均无显著性差异。
由表2生化检测结果可见，正常对照组的：甘油三酯、丙二醛、还原性谷光甘肽与乙醇模型组相比，均存在显著性差异，说明模型成立。样品高剂量组的甘油三酯、丙二醛、还原性谷光甘肽与乙醇模型组相比，均存在显著性差异。由表3病理检查总积分可见，正常对照组的病理积分明显低于乙醇模型组，存在显著性差异，说明模型成立。样品高剂量组与乙醇模型对照组相比，病理积分明显下降，存在显著性差异。
上述结果提示经口喂养小鼠不同剂量澳博牌九通胶囊30天后，明显对酒精性肝损伤的具有保护作用。
表1样品对动物体重的影响组别动物数初始体重中期体重终期体重正常对照乙醇模型低剂量中剂量高剂量 10 10 10 10 10 22±0.7 22±1.0 23±1.0 21±0.7 22±1.0 33±0.5 32±0.7 33±0.6 32±0.6 32±0.7 38±0.7 38±0.5 38±1.0 38±0.8 38±0.7
表2生化检测结果组别动物数 甘油三酯 (μmol/g肝重)丙二醛、(nmol/10肝重) 还原性谷光甘肽 (μmol/g肝重)正常对照乙醇模型低剂量中剂量高剂量 10 10 10 10 10 15.86±0.98* 39.77±2.06 39.62±1.38 32.31±2.66 26.64±1.25* 3.89±0.65* 10.27±1.06 7.79±0.80 5.06±0.36* 4.96±0.25* 8.20±0.77* 3.82±0.36 4.03±0.29 4.01±0.66 5.34±0.77*
*P＜0.05 与乙醇模型组比较，经方差分析。
表3病理检查总积分组别动物号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10总分平均分病理积分对照乙醇模型低剂量中剂量高剂量 0 1 1 0 0 0 2 3 2 0 0 3 1 1 1 0 1 2 1 2 0 1 3 0 1 0 2 1 1 0 0 2 1 2 2 0 3 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 2 2 0 0 16 15 10 6 0±0* 1.6±1.0 1.5±1.0 1.0±0.8 0.6±0.8*
*P＜0.05 与乙醇模型组比较，经方差分析。
二、急性毒性(经口LD50)试验：
取本发明制剂胶囊剂(九通胶囊)内容物10000mg，加蒸馏水至20ml，充分混匀后作为受试样品。清洁昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重：18-22g，禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选雌、雄小鼠各10只，同性别小鼠之间体重之差不超过3g。将受试样品采用一次经口灌胃给样，灌胃容量按0.4ml/20g体重计(24小时内共进行二次灌胃)。给样后，观察小鼠的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等，观察期为一周。实验末再次对小鼠称重。对死亡小鼠及到期处死小鼠进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。
结果显示：雌性小鼠的LD50＞10000mg/kg，雄性小鼠的LD50＞10000mg/kg，试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何症状和死亡，根据急性毒性半致死剂量分级，本发明制剂属实际无毒级物质。
附：小鼠的乙醇致死剂量约为10g/kg，该剂量及更大剂量下小鼠出现100％死亡(如图1)。
三、微核试验：
取九通胶囊内容物5000、2500、1250mg，分别加蒸馏水至20ml，作为样品供试。将昆明种小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半，体重25-30克，分别作为样品三个剂量组及蒸馏水阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组。采用30小时两次灌胃法，将的不同浓度样品按0.4ml/20g体重，分别对各组小鼠灌胃。于第二次灌胃后6小时，颈椎脱臼处死小鼠，取股骨骨髓加小牛血清混匀，常规涂片、固定、Giemsa染色制片。镜检观察，每鼠计数1000个嗜多染红细胞微核数，计算微核放生率，并进行统计分析。
结果见表4，九通胶囊各剂量组的微核细胞数和微核率与阴性对照组无显著性差异(P＞0.05)，说明九通胶囊不会诱发小鼠骨髓染色体畸变。
表4 动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率 剂量 (g/kg) 性别 动物数 (只) 受检细胞数 (只)微核细胞数 (个) 微核率 (％) 统计学 检验* 10 (九通胶囊) 雄性 5 5000 4 0.8 ＞0.05 10 (九通胶囊) 雌性 5 5000 4 0.8 ＞0.05 5 (九通胶囊) 雄性 5 5000 5 1.0 ＞0.05 5 雌性 5 5000 5 1.0 ＞0.05 2.5 (九通胶囊) 雄性 5 5000 4 0.8 ＞0.05 2.5 (九通胶囊) 雌性 5 5000 5 1.0 ＞0.05 阴性对照 雄性 5 5000 4 0.8 (蒸馏水20ml/kg) 雌性 5 5000 5 1.0 阳性对照 (环磷酰胺40mg/kg) 雄性 5 5000 126 25.2 ＜0.01 雌性 5 5000 128 25.6 ＜0.01
*与阴性对照组比较(经卡方检验)
四、精子畸形试验：
取九通胶囊内容物5000、2500、1250g，分别加蒸馏水至20ml，作为样品供试。将昆明种小鼠，雄性，体重25-30克，随机分为5组，每组5只，分别作为样品三个剂量组及蒸馏水阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组。小鼠称体重后，将的不同浓度样品按0.4ml/20g体重，分别对各组小鼠灌胃。每日一次，连续5天。于首次给样后第35天，劲椎脱臼处死小鼠，取二侧副睾放入生理盐水中，剪碎，过滤，取滤液涂片，固定，2％伊红染色制片。镜检观察，每鼠计数1000个精子畸形数，计算精子畸形发生率，并进行统计分析。
结果见表5，九通胶囊各剂量组的精子畸变数与畸形发生率与阴性对照组无显著性差异(P＞0.05)，说明九通胶囊对精子生成发育无影响，及在体内对生殖细胞无遗传毒性。
表5动物精子畸形发生率 剂量 (mg/kg)动物数 (只)受检精子个数 (个) 畸形类型数(个) 无 香 胖 无 尾 双 双 钩 蕉 头 定 折 头 尾 形 形 叠 畸变 精子数 量(个) 畸变率 (‰) 统计 学检 验* 10 (九通胶囊) 5 5000 3 1 23 45 1 1 0 74 14.8 ＞0.05 5 (九通胶囊) 5 5000 2 2 24 54 0 1 1 84 16.8 ＞0.05 2.5 (九通胶囊) 5 5000 2 3 21 45 1 1 1 75 15.0 ＞0.05 阴性对照 (蒸馏水20ml/kg) 5 5000 2 3 27 43 2 1 1 79 15.8 阳性对照 (环磷酰胺 40mg/kg) 5 5000 14 24 37 257 6 4 2 344 68.8 ＜0.01
*与阴性对照组比较(经卡方检验)
五、Ames试验：
大鼠肝S9的诱导和制备：选健康成年SD大鼠150g左右，将多氯联苯溶于玉米油中，浓度为200mg/ml，按500mg/kg(体重)无菌操作一次腹腔注射，5d后断头处死动物，取出肝脏称重后，用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，每克肝(湿重)加0.15mol/L氯化钾溶液3ml，冰浴，用消毒剪刀剪碎肝脏，用组织匀浆机(20000r/min，1min)制成肝匀浆，随后将制成的肝匀浆在低温(0-4℃)高速离心机以9000g离心10min，吸取上清液即为S9组分。将S9组分分装于无菌冻存管，液氮保存。
取九通胶囊内容物用无菌蒸馏水配制成0.1mg/皿、0.5mg/皿、2.5mg/皿、5.0mg/皿供试。将测试菌株TA97、TA98、TA100、TA102稀释到1-2×109/ml。溶剂对照：无菌蒸馏水。阳性对照：-S9:TA97阿的平(500μl/皿)、TA98对硝基喹啉(200μg/皿)，TA100、TA102 MMS(1μl/皿)。+S9：TA97、TA98、TA100 2-氨基芴(10μg/皿)，TA102 1.8-二羟基蒽醌(50μg/皿)。
阳性对照组除阿的平用无菌蒸馏水作溶剂外，其余均用二甲基亚砜(DMSO)作溶剂。按GB15193-94标准平板掺入法：45℃顶层琼脂2ml，依次加入菌液0.1ml、受试物0.1ml、活化需加S9混合液0.5ml，充分混匀后迅速倾入底层培养基上，37℃培养48小时，观察结果。每次试验重复一次。
结果见表6、表7，两次试验结果均表明，在本实验条件下，沙蚕胶囊各剂量组Ames试验结果为阴性，说明九通胶囊不具有遗传危害和潜在致癌作用。
表6 第一次试验测试结果 剂量 mg/皿 回复菌落数(个/皿)X±SD TA97 TA98 TA100 TA102 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 0.1 (九通胶囊) 154±17 157±14 30±2 30±4 137±4 141±6 262±16 273±12 0.5 (九通胶囊) 152±17 156±14 30±6 31±5 135±6 149±8 266±9 274±5 1.0 (九通胶囊) 150±18 156±6 29±3 30±5 136±9 147±8 261±8 271±7 2.5 (九通胶囊) 155±15 165±10 30±3 31±5 134±12 137±7 264±10 266±11 5.0 (九通胶囊) 151±19 159±19 31±3 32±3 136±7 144±8 256±9 270±6 空白对照 157±14 166±12 29±3 31±3 134±7 137±10 254±6 265±15 溶剂对照 (无菌蒸馏水) 154±7 158±11 30±3 32±2 137±6 140±11 254±12 269±5 阿的平 (500μg/皿) 1105±71 对硝基喹啉 (200μg/皿) 670±33 甲基甲烷磺酸酯 (1μl/皿) 1237±43 3230±75 2-氨基芴 (10μg/皿) 1233±91 1873±26 1258±23 1，8-二羟基蒽醌 (50μg/皿) 754±40
表7 第二次试验测试结果 剂量 mg/皿 回复菌落数(个/皿)X±SD TA97 TA98 TA 100 TA102 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 0.1 (九通胶囊) 154±14 165±11 30±2 31±5 132±11 139±10 258±9 263±14 0.5 (九通胶囊) 152±8 161±9 30±6 31±5 136±11 141±18 261±16 269±5 1.0 (九通胶囊) 153±11 156±13 28±2 33±2 135±8 139±10 256±9 265±16 2.5 (九通胶囊) 151±16 155±10 29±4 31±3 136±9 142±15 253±8 262±11 5.0 (九通胶囊) 152±8 159±10 31±2 32±2 133±6 140±5 260±9 262±12 空白对照 152±11 158±18 30±5 33±2 132±7 143±8 255±8 263±8 溶剂对照 151±19 156±15 29±4 31±3 137±9 146±5 251±10 264±12 阿的平 (500μg/皿) 1112±52 对硝基喹啉 (200μg/皿) 624±6 甲基甲烷磺酸酯 (1μl/皿) 1217±24 3216±28 2-氨基芴 (10μg/皿) 1348±64 1844±6 1233±17 1，8-二羟基蒽醌 (50μg/皿) 733±43
上述试验结果证明，本发明含纯天然植物的制剂是一种安全、有效，对酒精性肝损伤具有辅助保护作用功能性保健品。
附图说明：
图1、乙醇对小鼠的急性酒精中毒实验结果
具体实施方式：
实施例1
配方：葛根30g，枳椇子22g，五味子20g，陈皮14g，黄芪14g。
葛根、枳椇子、五味子、黄芪、陈皮药材挑选。洗净，粉碎后， 按比例混合。用沸水提取3次，过滤得滤液，滤液浓缩后，用75％酒精沉淀过夜(75％酒精同时起到杀菌作用)，7000rpm离心30min得沉淀(一)。将沉淀(一)在70℃烘箱内烤干，即为提取物。
将沉淀(一)烘干品，研碎成细粉过筛，装入胶囊，即得。
实施例2
配方：葛根31.4g，枳椇子21.8g，五味子21.8g，陈皮10.8g，黄芪10.8g，淀粉3.4g。
葛根、枳椇子、五味子、黄芪、陈皮药材挑选。洗净，粉碎后，按比例混合。用沸水提取3次，过滤得滤液，滤液浓缩后，冷沉过液，取上清浓缩得浸膏，在70℃烘箱内烤干，即为提取物。
将沉淀(一)烘干品，研碎成细粉过筛，装入胶囊，即得。
实施例3
配方：葛根33.4g，枳椇子24.4g，五味子19.8g，陈皮9.8g，黄芪9.2g，淀粉3.4g。
中药提取物制备同实施例1，加入淀粉，压片，制得片剂。
实施例4
配方：葛根34g，枳椇子24g，五味子20g，陈皮10g，黄芪10g，淀粉2g。
中药提取物制备同实施例1，加入淀粉，制粒，即得冲剂。
实施例5
配方：葛根33g，枳椇子25g，五味子23g，陈皮10g，黄芪9g。
中药提取物制备同实施例1，研磨，加适量水，制得口服液。