马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法 本发明属于马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法。
马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)没有蛋白质外壳<瞿峰，田波：病毒学报，9：288，1993>，它的检测，不能用检测一般病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法<郑光宇，Wichai等：病毒学报，4：150，1988>。目前普遍采用往复电泳(Return-PAGE)方法检测<陈炜，田波：微生物通报，1(3)：132，1985>，其灵敏度和简便性都略显不足。多聚酶链反应(PCR)技术在病毒检测方面具有廉价、快速、灵敏、特异性强等优点<陈枝楠等：植物病理学报，27(3)：198，1997>。PSTVd是一种RNA病毒，RNA不能直接通过PCR扩增，首先要反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增<A.M.Shamloul，et al.Canadian Journal of Plant Pathology，1997，19：89-96>。用传统方法检测，全部过程由两部分构成：在反转录酶催化下，将RNA反转录为cDNA，再在Taq聚合酶催化下完成cDNA的扩增，通过检测cDNA，判断PSTVd的存在<何小源等：中国病毒学，7：362，1992，何小源，周广和：病毒学报，8：337，1992>。既使如此，两步法在PSTVd的检测中也尚未得到应用。
马铃薯生产是我国仅次于小麦、水稻和玉米的第四大作物。由于马铃薯的优良品质，今后在我国还会有更大的发展。脱毒种薯是马铃薯生产的重要环节，其中PSTVd的检测是检验马铃薯脱毒效果的重要指标。目前的检测方法已不能满足未来生产的需要，迫切需要快速、灵敏的方法取代现有技术。
本发明目的是提供一种马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法，本发明是利用Taq酶在PCR扩增体系内将类病毒RNA反转录为cDNA，同时完成cDNA扩增，用琼脂糖电泳检测扩增产物，判断病毒的有无，具有特异性强、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay)等特点。
本发明包括病毒RNA的提取、PCR引物的设计、应用Taq酶将病毒RNA反转录为cDNA同时完成PCR扩增和cDNA的检测。
本发明具体步骤详细描述如下：
1、病毒RNA的提取：a.组织破碎：取染毒马铃薯组织(包括植株体及果实)，加RNA抽提缓冲液(Tris 0.1M，NaCl 0.1M，HCl 0.075M，EDTA 0.01M，pH7.0，3-5ml/每克马铃薯组织)，加入石英砂(0.01-0.05g/每克马铃薯组织)，在液氮中研磨碎；b.抽提蛋白：用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提，冰浴10-15min；10,000-15,000rpm，4℃，离心15-20min；吸取上清液；c.沉淀并收集病毒核酸：用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M)，-20℃沉淀20-30min。10,000-15,000rpm，4℃，离心15-20min，弃掉上清液；重复此述步骤1次；d漂洗并溶解病毒核酸：用乙醇溶液漂洗沉淀1-2次，气干乙醇，用ddH2O溶解。
2、PCR引物设计：根据GenBank上PSTVd的全序列，在计算机辅助下，利用通用软件Oligo和Primer，根据内稳定性、变性温度及错配情况设计出引物P1、P2；P1：5’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’，P2：5’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。
3、PCR扩增：取第一步粗提马铃薯核酸液，引物P1(0.5Pmol/每微升反应体系)，P2(0.5Pmol/每微升反应体系)，10×缓冲溶液(100mM Tris-HCl[pH8.8]，500mMKCl，0.8％Nonidet P40[购于Sangon公司])，MgCl2(1.2-1.5mM)，dNTP mix(0.2mM)，Taq酶(0.25U/每微升反应体系)；在下述条件下进行PCR：72℃ 6min 40sec→94℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，10-20个循环→72℃ 5min→94℃ 1min，59℃ 30sec，72℃ 1min，35-40个循环。
4、检测：产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
本发明与传统的RT-PCR反应相比，该方法具有特异性强(只能特异性地扩增病毒cDNA)、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(检测速度快，可同时检测数十个样品，4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay，Taq的价格远远低于反转录酶)等特点。
本发明突出地实质性特点和显著效果可以从下述的实施例得以体现，但它们不是对本发明作任何限制。
实施例：
取新鲜染毒马铃薯叶子(津引薯9号)1g，加RNA抽提缓冲液5ml，加入少许石英砂，在液氮中研磨成粉状。用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提，冰浴15min。10,000rpm，4℃，离心20min，吸取上清液。用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M)，-20℃沉淀30min。12,000rpm，4℃，离心20min。重复上述步骤1次。用70％乙醇漂洗2次。气干乙醇，用适量ddH2O溶解。
PCR引物设计：根据GenBank上PSTVd的全序列，在计算机辅助下设计出引物P1、P2：P1：5’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’，P2：5’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。
PCR扩增：(反应体系20μl)取粗提马铃薯核酸液1μl，引物P1 10Pmol，P2 10Pmol，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTP mix(10mM)0.4μl，Taq酶5U，ddH2O11.75μl；如下条件做PCR：72℃ 6min 40sec→94℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，10个循环→72℃ 5min→94℃ 1min，59℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环。检测：产物在2％Agrose中进行电泳检测，见图一。图中第一条泳道显示的是分子量marker，第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物。
通过与正对照和负对照比较，判断有病毒PSTVd。
对比实施例一：
通过比较传统的RT-PCR和本技术的电泳照片可以发现，一步法RT-PCR扩增产物的大小与传统的RT-PCR扩增产物是一致的，且电泳带的亮度相近。
对比实施例二：利用PSTVd序列中HaeIII的单酶切位点酶切和嵌套式PCR验证，均表明一步法RT-PCR所检测到的正是PSTVd病毒。此结果见图二，其中第一条泳道显示的是分子量marker，第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物，第三条泳道显示的是嵌套式PCR反应结果，第四条泳道显示的是嵌套式PCR产物酶切反应结果。
另外，用RNase(无DNase)处理过的染毒马铃薯RNA样品做RT-PCR，所得到的结果呈阴性。表明本方法扩增得到的产物是来自病毒RNA，而不是马铃薯DNA。