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接骨木及其木脂素类化合物用于抗骨质疏松药物的用途
    一、技术领域

    本发明涉及一种民间草药接骨木(Sambucus Williamsii Hance)的提取物作为抗骨质疏松的用途，以及从中分离得到的木脂素类化合物、酚酸类化合物作为抗骨质疏松药物的应用。

    二、背景技术

    骨质疏松是一种代谢性的骨疾病，其特征为骨量下降、骨组织微环境退化，从而导致骨脆性增加，患者易发生骨折，近二十年来被公认为是很严重的公众健康问题。根据世界卫生组织统计，在美国，每年治疗骨质疏松引起的髋骨骨折就要花费100亿美元，与治疗心血管疾病和哮喘的费用相当[3]。而国际骨质疏松基金会(international osteoporosis foundation)的统计，在欧盟，每30秒就会发生一例因骨质疏松引起的骨折[2]。而且随着社会老龄化，预计到2050年全球骨质疏松引发髋骨骨折患者会将从1990年的180万上升到630万，而高发地区也将从现在的欧洲、美洲转移到发展中国家[1，2]。中国是世界人口大国，结合2000年我国第5次人口普查结果，预测我国原发性骨质疏松人数约为9千万[5]。如何有效的预防和治疗骨质疏松已成为全世界共同关注的问题。

    骨骼是一种不断重生的器官，它由功能不同的细胞、矿化和未矿化的连接组织基质、以及骨髓空穴、血管、微管、空隙组成。骨骼生长成熟后，骨形成与骨吸收形成动态平衡，称为骨重建。在骨内有一个虚拟的单位，被称为BMU(basic multicellular unit)，前部是破骨细胞(osteoclast)，后部是成骨细胞(osteoblast)，中部则是血管、神经和连接组织。BMU在特定地时间和部位形成之后，即向着骨内需要代谢的部位移动。破骨细胞即可附着在骨上，通过酸化和蛋白质消化作用将旧骨吸收。随着BMU向前推进，成骨细胞将代替破骨细胞附着在这个部位上，分泌骨基质，最终钙化形成新骨[6]。骨质疏松的发病机理比较复杂，且受到体内多种水平的调控。在正常的情况下，骨骼维持在健康的水平。一旦骨重建动态平衡被打破，骨吸收超过了骨形成，即形成了骨质疏松。

    传统的中医理论认为“五脏所主，肾主骨”；“肾者，其充在骨”，肾精充足，则骨髓生化有源，骨得髓的滋养而坚固有力。骨质疏松症，中年得病老年成疾。由于肾虚，肾精不足，精不生髓而日久骨失所养，则骨质稀疏，出现骨痹、骨萎。《内经》中明确提出以补肾法疗之。中医的肾涉及到人体内分泌、神经、免疫、代谢等多个体内功能系统，现代医学研究表明肾虚者下丘脑-垂体-性腺轴功能减退，因此性激素水平下降，进而引起骨功能下降，单位体积内骨组织含量减少，发生骨质疏松[4]。而补肾益气的中药提高了机体内分泌腺的机能，改善了下丘脑-垂体-性腺轴的功能，增加了体内性激素，调整了内环境，起到了延缓骨质疏松的发生和发展作用。虽然体内实验证明中药治疗骨质疏松的确有效，且副作用较少，但是由于中药成份复杂，指标成份、活性成份不明确，作用机制研究较少，治疗靶点难以确认，目前很难被国际社会接受。

    三、发明内容

    本发明的目的是提供一种中草药接骨木提取物，用科学的工艺做成制剂，使之可以有效治疗骨质疏松。通过检测中药提取物对各种生化指标、骨组织形态学指标、骨力学指标以及调控骨代谢和矿物质代谢的基因表达的影响，初步确定这种中药提取物治疗骨质疏松的机理和作用靶点。同时采用现代化学分离手段分离这种中药提取物，以体外成骨样UMR 106细胞和具有雌激素受体的MCF-7细胞检测化合物的抗骨质疏松活性，确定这种中药提取物治疗骨质疏松的物质基础。为预防和治疗骨质疏松提供了新的途径。

    接骨木为中国民间用草药，忍冬科植物接骨木Sambucus williamsii Hance的茎枝，本植物的根及根皮(接骨木根)、叶(接骨木叶)、花朵(接骨木花)均供药用。主要功用有祛风、活血、治风湿筋骨疼痛。对接骨木的化学研究和抗骨质疏松活性少见报道，无专利申请。

    这一目的是这样实现的：接骨木Sambucus williamsii Hance的茎枝适当粉碎，用60％乙醇回流提取2次，减压蒸去溶剂，得到乙醇浸膏。或者也可用纯乙醇、纯甲醇代替60％乙醇提取，所得提取物成分相似。所得浸膏可以制成口服剂、片剂、胶囊剂等剂型。乙醇浸膏混悬于水中，用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到氯仿提取物，乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。其中乙酸甲酯、乙酸丁酯可以代替乙酸乙酯，异丙醇可以代替正丁醇。氯仿提取物和乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析、分子筛层析、反相柱层析和高效液相制备后，得到12个木脂素类化合物，4个酚酸类化合物(包括其衍生物)。其中化合物11、化合物20、化合物34和化合物35是这次发明中得到的新化合物，用于抗骨质疏松的用途。本发明对骨质疏松有很好的治疗效果，是副作用较小的天然药物。

    四、附图说明

    附图是本次发明从接骨木乙醇浸膏中分离得到的化合物的结构式。其中化合物11、化合物20、化合物34和化合物35是本次发明得到的新化合物。

    五、具体实施方式

    实施例1：

    接骨木(Sambucus Williamsii Hance)的茎枝30公斤，经粉碎后用8倍量60％乙醇加热回流提取2次，每次2小时。合并提取液，减压蒸去溶剂，得乙醇浸膏900克。此项提取也可用纯乙醇、纯甲醇代替60％乙醇。

    乙醇浸膏350克用于实施例2。乙醇浸膏550克混悬于4000毫升水中分别以等体积氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，减压蒸去溶剂，得氯仿提取物100克，乙酸乙酯提取物30克，正丁醇提取物70克，水提取物330克。乙酸甲酯、乙酸丁酯可以代替乙酸乙酯，异丙醇可以代替正丁醇。

    也可以直接用乙酸乙酯萃取乙醇浸膏水混悬液，再用正丁醇萃取。这种方法时氯仿萃取项可以省略。

    氯仿提取物和乙酸乙酯提取物经进一步化学分离，鉴定了其中主要的化学成分。这些化合物的结构和抗骨质疏松活性将在下面的实施例中阐述。

    实施例2：

    说明从实施例1得到的接骨木乙醇浸膏的体内生物活性实验结果。

    将3月龄的雌性SD大鼠随机分为5组，4组卵巢摘除组和1组假手术组。卵巢摘除组(OVX)的大鼠乙醚麻醉后摘除双侧卵巢，假手术组(Sham)的大鼠同样用乙醚麻醉，但不摘除卵巢，只剪去少许卵巢外侧的脂肪。手术后一个月，将接骨木乙醇浸膏溶解于蒸馏水中配成600mg/ml和300mg/ml两个浓度，将阳性对照药17β-雌二醇混悬于蒸馏水中，分别灌胃给药。模型对照组和假手术组给予同容量的蒸馏水。持续给药3个月，每周测定大鼠体重。在处死之前，将大鼠放入代谢笼中，收集24小时内的尿液，测定尿中钙、肌酐以及脱氧吡啶酚(DPD)的含量。腹主动脉取血后，摘除大鼠子宫，迅速称重。测定血清Ca含量，碱性磷酸酶活性(ALP)以及骨钙素含量，计算子宫脏器系数比。取出大鼠的左侧胫骨和股骨，剔除肌肉和软骨，采用周围骨定量CT(pQCT)技术测定胫骨骨密度，同时用三点弯曲试验考察股骨的强度。

    以下是实施例3的实验结果：

    1)

    实验组别                                      体重(g)

    模型对照组(OVX)                               333±8

    阳性对照组(OVX+E2)                            292±8

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)                338±11

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)                336±11

    假手术组(Sham)                                301±11

    实验组别                                      子宫系数比(mg/g)

    模型对照组(OVX)                               0.32±0.03

    阳性对照组(OVX+E2)                            1.18±0.15

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)                0.34±0.09

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)                0.30±0.03

    假手术组(Sham)                                1.87±0.37

    结果表明去卵巢后模型组大鼠体重显著增加，子宫明显萎缩，给予雌二醇的大鼠体重增加被抑制，子宫重量显著增大，而灌胃给予接骨木乙醇浸膏3个月，并未引起子宫重量的增加，说明接骨木乙醇浸膏对子宫生长无刺激作用。

    2)

    实验组别                               血清钙(mg/L)

    模型对照组(OVX)                        10.4±0.1

    阳性对照组(OVX+E2)                     10.8±0.4

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)         11.6±0.1

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)         11.6±0.1

    假手术组(Sham)                         11.0±0.2

    实验组别                               尿Ca/尿肌酐(mg/mg)

    模型对照组(OVX)                        1.35±0.15

    阳性对照组(OVX+E2)                     0.44±0.14

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)         0.53±0.12

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)         0.65±0.11

    假手术组(Sham)                         0.81±0.13

    结果表明去卵巢后，模型组大鼠血钙浓度降低，同时尿钙浓度升高，显示体内钙平衡被打破，血钙浓度下降将会刺激甲状旁腺激素的分泌，动员骨钙入血，不利于骨钙的沉积；同时尿钙升高意味着排出钙量增加，同样不利于骨钙的保持。给予接骨木乙醇浸膏3个月，大鼠血钙浓度升高，且钙排出量降低，与阳性药雌二醇的作用类似。

    3)

    实验组别                               血清碱性磷酸酶(U/L)

    模型对照组(OVX)                        101.6±9.8

    阳性对照组(OVX+E2)                     48.8±2.7

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)         75.2±5.9

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)         76.8±5.3

    假手术组(Sham)                         74.0±10.5

    实验组别                               血清骨钙素(ng/L)

    模型对照组(OVX)                        93.0±7.3

    阳性对照组(OVX+E2)                     78.3±4.8

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)         74.2±4.4

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)         67.8±5.1

    假手术组(Sham)                         60.2±4.9

    实验组别                               尿DPD/尿肌酐(nmol/mg)

    模型对照组(OVX)                        8.7±0.8

    阳性对照组(OVX+E2)                     6.3±1.1

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)         6.8±0.6

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)         6.3±0.6

    假手术组(Sham)                         4.9±0.6

    结果表明去卵巢后，模型组大鼠血清碱性磷酸酶活性增加，血清骨钙素含量升高，尿中DPD/尿肌酐比值增加。去卵巢引起体内雌激素缺乏，导致骨转化率增加，与绝经后妇女的高转化型骨质疏松症一致。分别灌胃给予接骨木乙醇浸膏3个月后，碱性磷酸酶活性降低，血清骨钙素含量减少，尿中DPD：尿肌酐比值降低，可见接骨木乙醇浸膏能够显著抑制去卵巢造成的大鼠骨转化的增加，与阳性药雌二醇的作用类似。

    4)

    实验组别                                  胫骨近端骨密度(mg/)

    模型对照组(OVX)                           471.7±19.9

    阳性对照组(OVX+E2)                        590.1±41.8

    接骨木乙醇浸膏(OVX+300mg/kg/d)            467.4±13.9

    接骨木乙醇浸膏(OVX+600mg/kg/d)            529.3±13.1

    假手术组(Sham)                            629.6±30.0

    实验组别               吸收能量(J)           股骨刚度stiffness(N/mm)

    模型对照组(OVX)        58.1±4.7             412.8±22.4

    阳性对照组(OVX+E2)     73.8±5.8             532.2±32.2

    接骨木乙醇浸膏         62.6±5.4             502.6±28.2

    (OVX+300mg/kg/d)

    接骨木乙醇浸膏         74.5±8.0             465.8±21.5

    (OVX+600mg/kg/d)

    假手术组(Sham)         88.0±5.9             453.7±33.8

    结果表明去卵巢后模型组大鼠近端胫骨骨密度、股骨吸收能量以及股骨刚度明显降低，雌激素缺乏导致大鼠骨量减少，骨强度降低，灌胃给予高低剂量接骨木总提取物3个月后，骨密度增加，骨吸收能量和骨刚度均明显增加，说明接骨木乙醇浸膏能够抑制去卵巢造成的骨量减少，并增强骨强度。

    小结：以上实验结果表明接骨木乙醇浸膏能够抑制去卵巢引起的骨转化增强，从而保护骨量丢失，增加骨强度，对由于雌激素缺乏导致的骨质疏松具有治疗作用，其作用与阳性药雌二醇相当，却无雌激素样副作用。

    实施例3：

    说明从实施例1得到的接骨木氯仿提取物、乙酸乙酯提取物经过硅胶柱层析、分子筛层析、ODS柱层析和高效液相的制备，得到并鉴定了12个木脂素类化合物，4个酚酸类化合物(包括其衍生物)，用于治疗骨质疏松新用途。emodin(大黄素，化合物1)，betulin(白桦醇，化合物2)，betulinic acid(白桦酸，化合物3)，vanillin(香草醛，化合物5)，coniferaldehyde(化合物7)，(-)-lirioresinol C(化合物10)，(-)-diapinoresinol(化合物11)，1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1，3-propanodiol(化合物12)，guaiacylglycerol-β-O-4′-coniferyl ether(化合物13)，(-)-erytheo-1-(4-hydroxy-3-methoxy--phenyl)-2-(4-hydroxypropyl-2-methoxyphenoxy)-1，3-propanodiol(化合物15)，(-)-threo-1-(4-hydroxy-3--methoxyphenyl)-2-(4-hydroxypropyl-2-methoxyphenoxy)-1，3-propanodiol(化合物16)，(-)-lariciresinol(化合物17)，dihydrodehydodiconiferyl alcohol(化合物18)，(-)-(2，3)-erytheo-2-{(3，5-dimethoxy)-4-[(1，2)--threo-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-hydroxy-1-hydromethyl-ethoxy]phenyl}-5-[3-(4-hydroxy-3-methoxy--cinnamoyloxy)propanyl]-3-hydromethyl-7-hydroxy-benzodihydrofuran(buddlenol G，化合物20)，vanillic acid(香草酸，化合物28)，(-)-(1S，2R)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[3-(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl--oxy-propanyl)]-2-hydroxyphenoxy}-3-(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyloxy)-1-propanol(carolignan L，化合物34)，(-)-(1，2-threo)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[3-(4-hydroxy-3-methoxy-cinnamoyloxypropanyl)]--2-hydroxyphenoxy}-3-(4-hydroxy-3-methoxycinnamoyloxy)-1-propanol(carolignan M，化合物35)，3H-indole-2-carboxylic acid(化合物38)，(-)-olivil(化合物39)。以上化合物均包括相应的不同立体构型者。

    结构见附图。

    其中化合物11、化合物20、化合物34和化合物35是这次发明中分离到的新化合物，用于治疗骨质疏松新用途。

    新化合物的性状：

    化合物11((-)-diapinoresinol)：[α]D23-256°(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax nm(logε)：231(3.22)，281(2.82)；ESIMS m/z 381.3[M+Na]+，357.3[M-H]-；1H NMR(in CD3OD)和13C NMR(in CD3OD)见表。

           δ(ppm)                 δ(ppm)，multiplicity，Jin Hz

    C-1      55.4           H-1        1H，3.13(m)

    C-2      87.5           H-2        1H，4.70(d)，J＝4.2

    C-4      72.6           H-4        1H，4.22(dd)，J＝8.9，6.8；1H，3.83(o)

    C-5      55.4           H-5        1H，3.13(m)

    C-6      87.5           H-6        1H，4.70(d)，J＝4.2

    C-8      72.6           H-8        1H，4.22(dd)，J＝8.9，6.8；1H，3.83(o)

    C-1′    2C，133.8

    C-2′    2C，111.0      H-2′      2H，6.94(d)，J＝1.6

    C-3′    2C，149.1

    C-4′    2C，147.3

    C-5′    2C，116.1      H-5′      2H，6.76(d)，J＝8.1

    C-6′    2C，120.1      H-6′      2H，6.80(dd)，J＝8.1，1.6

    C-7′    2C，56.4       H-7′      6H，3.85(s)

    化合物20(buddlenol G)：[α]D23-252°(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax nm(logε)：286(3.22)，324(3.24)；ESIMS m/z 771.2[M+Na]+，747.2[M-H]-；HREIMS m/z 771.2683[M+Na]+(calculated 771.2629 forC40H44O14Na)；1H NMR(in CD3OD)和13C NMR(in CD3OD)见表。

                δ(ppm)                                    δ(ppm)，multiplicity，J in Hz

    C-1      136.7    C-1″    127.4

    C-2      103.9    C-2″    111.7     H-2        1H，6.74(s)          H-2″    1H，7.17(bra，s)

    C-3      154.3    C-3″    149.6

    C-4      140.1    C-4″    151.2

    C-5      154.3    C-5″    116.6                                     H-5″    1H，6.78(d)，J＝8.2

    C-6      103.9    C-6″    124.2     H-6        1H，6.74(s)          H-6″    1H，7.05(br，d)，J＝8.2

    C-7      88.3     C-7″    146.8     H-7        1H，5.52(d)，J＝5.6  H-7″    1H，7.54(d)，J＝15.9

    C-8      56.0     C-8″    115.3     H-8        1H，3.43(m)          H-8″    1H，6.32(d)，J＝15.9

    C-9      65.2     C-9″    169.4     H-9        1H，3.74(o)

                                                    1H，3.70(o)

    C-10     56.7     C-10″   56.4      H-10       3H，3.82(s)          H-10″   3H，3.87(s)

    C-11     56.7     C-1    133.4     H-11       3H，3.82(s)

    C-1′    136.3    C-2    111.7                                     H-2    1H，6.98(br，s)

    C-2′    117.2    C-3    148.7     H-2′      1H，6.60(s)

    C-3′    142.1    C-4    147.2

    C-4′    146.6    C-5    115.8                                     H-5    1H，6.73(ob)

    C-5′    129.5    C-6    120.9                                     H-6    1H，6.84(br，d)，J＝7.9

    C-6′    116.7    C-7    74.5      H-6′      1H，6.60(s)          H-7    1H，4.96(d)，J＝6.9

    C-7′    32.9     C-8    89.0      H-7′      2H，2.63(m)          H-8    1H，4.05(m)

    C-8′    31.8     C-9    61.8      H-8′      2H，1.97(m)          H-9    1H，3.72(o)

                                                                                  1H，3.33(o)

    C-9′    64.9     C-10   56.5      H-9′      2H，4.16(t)，J＝6.3  H-10   3H，3.81(s)

    化合物34(carolignan L)：[α]D23-246°(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax nm(logε)：232(3.51)，288(3.39)，325(3.54)；ESIMS m/z 739.2[M+Na]+，715.2[M-H]-；HREIMS m/z 739.2340[M+Na]+(calculated 739.2367 forC39H40O13Na)；1H NMR(in CD3OD)和13C NMR(in CD3OD)见表。

    化合物35(carolignan M)：[α]D23-254°(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax nm(log ε)：231(3.51)，289(3.39)，325(3.54)；ESIMS m/z 739.2[M+Na]+，715.2[M-H]-；HREIMS m/z 739.2385[M+Na]+(calculated 739.2367 forC39H40O13Na)；1H NMR(in CD3OD)和13C NMR(in CD3OD)见表。

            δ(ppm)                         δ(ppm)，multiplicity，J in Hz

    化合物   34       35                  34                           35

    C-1      133.2    133.3

    C-2      111.6    111.5     H-2       1H，7.08(d)，J＝1.6          1H，7.01(d)，J＝1.7

    C-3      148.9    149.0

    C-4      147.2    147.6

    C-5      115.9    116.1     H-5       1H，6.77(d)，J＝8.0          1H，6.76(d)，J＝8.1

    C-6      120.7    120.8     H-6       1H，6.88(dd)，J＝8.0，1.6    1H，6.85(dd)，J＝8.1，1.7

    C-7      74.3     74.9      H-7       1H，4.92(d)，J＝4.4          1H，4.89(d)，J＝6.1

    C-8      83.9     84.7      H-8       1H，4.55(m)                  1H，4.39(m)

    C-9      64.5     64.8      H-9       2H，4.40(m)                  1H，4.35(m)and 1H，4.15(m)

    C-10     56.4     56.4      H-10      3H，3.82(s)                  3H，3.80(s)

    C-1′    137.7    138.0

    C-2′    117.2    117.3     H-2′     1H，6.69(d)，J＝1.8          1H，6.71(d)，J＝1.8

    C-3′    149.2    149.3

    C-4′    145.7    146.0

    C-5′    119.0    119.3     H-5′     1H，6.87(d)，J＝8.2          1H，6.92(d)，J＝8.2

    C-6′    120.7    120.6     H-6′     1H，6.57(dd)，J＝8.2，1.8    1H，6.57(dd)，J＝8.2，1.8

    C-7′    32.7     32.7      H-7′     2H，2.58(t)，J＝7.3          2H，2.59(t)，J＝7.3

    C-8′    31.5     31.5      H-8′     2H，1.92(m)                  2H，1.91(m)

    C-9′    64.9     64.9      H-9′     2H，4.11(t)，J＝6.4          2H，4.11(t)，J＝6.7

    C-1″    127.7    127.7

    C-2″    111.7    111.7     H-2″     1H，7.09(d)，J＝1.6          1H，7.14(d)，J＝1.5

    C-3″    149.3    149.4

    C-4″    150.7    150.7

    C-5″    116.4    116.5     H-5″     1H，6.79(d)，J＝8.0          1H，6.79(d)，J＝8.2

    C-6″    124.2    124.3     H-6″     1H，6.97(dd)，J＝8.0，1.6    1H，7.00(o)

    C-7″    147.1    147.2     H-7″     1H，7.37(d)，J＝15.9         1H，7.46(d)，J＝15.9

    C-8″    115.1    115.0     H-8″     1H，6.16(d)，J＝15.9         1H，6.25(d)，J＝15.9

    C-9″    168.9    168.8

    C-10″   56.5     56.5      H-10″    3H，3.87(s)                  3H，3.88(s)

    C-1    127.8    127.8

    C-2    111.8    111.8     H-2     1H，7.17(d)，J＝1.6          1H，7.18(d)，J＝1.6

    C-3    149.4    149.4

    C-4    150.6    150.6

    C-5    116.5    116.5     H-5     1H，6.79(d)，J＝8.0          1H，6.79(d)，J＝8.2

    C-6    124.1    124.1     H-6     1H，7.05(dd)，J＝8.0，1.6    1H，7.05(dd)，J＝8.2，1.6

    C-7    146.7    146.7     H-7     1H，7.55(d)，J＝15.8         1H，7.57(d)，J＝15.9

    C-8    115.6    115.6     H-8     1H，6.32(d)，J＝15.8         1H，6.34(d)，J＝15.9

    C-9    169.3    169.3

    C-10   56.5     56.5      H-10    3H，3.88(s)                  3H，3.88(s)

    实施例4

    从大鼠成骨样UMR106细胞的增殖和ALP活性，以及人乳腺癌细胞MCF-7的增殖评价从实施例3中得到的化合物的体外抗骨质疏松活性。

    大鼠成骨样UMR106细胞的增殖：UMR106细胞以7,500细胞/孔的密度接种于96孔板。在5％FBS(胎牛血清)-DMEM培养液中培养1天后，培养液去血清再培养一天。将实施例3中所述的化合物以DMEM稀释成不同浓度，加入到96孔板中，每个浓度3个复孔。IGF-I(胰岛素样生长因子，10ng/ml)为阳性对照组，无样品加入的细胞为正常组。作用一天后，加入MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium)培养4小时。以100μl DMSO溶解形成的甲鐕，于570nm处测定吸光度值，以吸光度值来评价细胞的增殖情况。

    大鼠成骨样UMR106细胞的ALP活性：ALP，alkaline phosphatase，碱性磷酸酶，是成骨细胞分化时分泌的一种酶，可以说明成骨细胞分化的情况。UMR106细胞以37,500细胞/孔的密度接种于24孔板，以5％FBS-DMEM培养3天。再将实施例3中所述化合物以1％FBS-DMEM稀释成不同浓度，加入到24孔板中培养一天。细胞以冰PBS缓冲液清洗一次后，每孔加入200μl裂解液，冻融三次，使细胞充分裂解。取40μl细胞裂解液与1000μl ALP反应试剂在37℃、黑暗环境中反应30分钟，然后加入500μl 0.1N氢氧化钠溶液终止反应。在405nm处测定吸光度，以双蒸水测出的值为起始对照值。另取40μl细胞裂解液以800μl双蒸水稀释，以考马斯亮兰法测定蛋白含量。ALP活性以单位蛋白碱性磷酸酶活性的变化率来表示。

    人乳腺癌MCF-7细胞的增殖：MCF-7细胞以5,000细胞/孔的密度接种于96孔板，以5％ FBS-DMEM培养两天后，换为5％ charcoal-stripped FBS(活性炭吸附FBS)-phenol red-free DMEM(去酚红DMEM)再培养两天。将实施例3中所述化合物以1％ charcoal-stripped FBS-phenol red-free DMEM稀释成不同浓度，加入到96孔板培养两天，每个浓度3个复孔。雌激素(10nM)为阳性对照。实验结束前，加入MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium)培养4小时。以100μl DMSO溶解形成的甲鐕，于570nm处测定吸光度值，以吸光度值来评价细胞的增殖情况。

    以下为实施例4的实验结果

    化合物    UMR106的增殖：                UMR106的ALP活性：      MCF-7的增殖：

              ％正常组，作用有效浓度        ％正常组，             ％正常组，作用有效浓度

              (阳性对照组)                  作用有效浓度           (阳性对照组)

    正常组    100％                         100％                  100％

    1         116.8％，3.7nM(110.7％)       -                      -

    2         123.8％，21.5nM(112.5％)      171.5％，21.5nM        -

    3         108.5％，2.15μM(112.5％)     -                      -

    5         146.0％，73.5nM(116.1％)      -                      -

    7         122.3％，0.56μM(116.1％)     -                      -

    10        135.0％，0.24μM(105.2％)     -                      -

    11        113.8％，0.28μM(105.2％)     171.6％，27.9μM       -

    12        142.0％，31.3nM(122.2％)      -                      -

    13        118.1％，26.6nM(105.2％)      144.1％，26.6μM       -

    15        -                             167.7％，26.5μM       -

    16        -                             133.5％，26.5μM       -

    17        119.9％，27.8nM(117.7％)      -                      -

    18        124.8％，0.28μM(116.1％)     150.9％，27.8μM       -

    20        128.8％，1.34μM(117.7％)     151.5％，1.34μM       -

    28        -                             140.0％，59.5μM       -

    34        122.4％，1.40μM(122.2％)     162.4％，1.40μM       -

    35        127.3％，1.40μM(122.2％)     -                      -

    38        128.5％，6.21μM(117.1％)     130.5％，62.1μM       128.6％，0.62μM(129.6％)

    39        -                             123.7％，26.6μM       -

    “-”表示该化合物没有促进作用。

    结果清楚表明，实施例3中所述的化合物对成骨样UMR106细胞的增殖或ALP活性都有较强的促进作用，而绝大多数化合物并不促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖(化合物38除外)。说明这些化合物专一性的作用于骨，没有雌激素样的副作用。

    参考文献

    1 Ageing and osteoporosis，1999，http//www.who.int

    2 Osteoporosis：both organizations and individuals must act now to avoid an impending epidemic，1999，http//www.who.int.

    3 Exercise interventions：defusing the world’s osteoporosis time bomb，Kai Ming Chan，Mary Anderson and EdithM.C.Lau，Bulletin of the World Health Organization 2003，81：827-830.

    4现代中医对骨质疏松症的认识，黄崇博，甘肃中医，2003，16(11)；47-48。

    5骨质疏松症的药物治疗进展，陈容清，谭礼蓉，中国药业，2003，12(11)：79-80。

    6 Birth and death of bone cells：basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatmentof osteoporosis，Stavros C.Manolagas，Endocrine Reviews，2000，21(2)：115-137.