治疗炎症和自身 免疫性疾病的脂肪酸类似物 本发明涉及可用于治疗和/或预防炎症疾病的脂肪酸类似物。此外，本发明同样涉及在哺乳动物细胞或组织中增加内源性白细胞介素-10(IL-10)生成并抑制白细胞介素-2生成的方法。本发明还涉及抑制刺激的外周血单核细胞增殖的方法。
【发明背景】
一组称为细胞因子的各种多功能蛋白质，其例子有白细胞介素、干扰素、集落刺激因子以及TNFα。细胞因子是一类分泌型可溶性蛋白质，通常以极低浓度存在于各种细胞中。淋巴细胞、炎症细胞、造血细胞及其它细胞，例如结缔组织细胞(如成纤维细胞、成骨细胞)，分泌各种细胞因子，通过控制细胞增殖、分化和效应物功能而调节免疫、炎症、恢复和急性期应答。通过结合特定类型细胞上的高亲合力受体，介导细胞因子的效应。
IL-10是一种重要的细胞因子，其为35-40kDa的肽，由辅助T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞及其它类型细胞生成。体外已经证明IL-10能够抑制细胞因子生成，包括IL-1和TNFα，而具有免疫抑制特性。
IL-10还抑制其它炎症细胞因子的活化，因此具有有效的抗炎活性。
施用IL-10来治疗以IL-1和TNFα过度生成为特征的某些疾病，近来受到关注。这些疾病或不适包括假体关节植入物松脱、炎症、糖尿病、癌症、移植物抗宿主病、病毒、真菌和细菌感染、脂多糖内毒素休克、骨髓功能抑制性疾病、血小板减少症、骨质疏松症、脊椎关节病、畸形性骨炎(Paget′s disease)、炎症肠病、关节炎、骨关节炎、自身免疫疾病例如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮以及结缔组织疾病。
例如，已经表明纯化的IL-10体外抑制某些类型的病毒感染。美国专利号5,665,345公开了施用IL-10抑制人细胞中人类免疫缺陷性病毒、逆转录病毒和Kaposi肉瘤复制的方法。
也有人建议使用IL-10治疗某些癌症。美国专利号5,570,190公开了施用外源性IL-10，治疗罹患急性髓性白血病和急性淋巴性白血病的哺乳动物。据说施用了纯化或重组形式的IL-10，并认为抑制了急性成白血病细胞的增殖。
同样，在严重联合免疫缺陷小鼠中，IL-10显示抑制骨髓转移。
对于以IL-1和TNFα过度生成为特征疾病的治疗，上述常规方法已经局限于静脉内施用外源性纯化或重组的IL-10。IL-10是蛋白质，由于蛋白质常常从溶液中浸出并结合到静脉给药装置地塑料或玻璃上，而很难静脉输注给哺乳动物。再有，蛋白质与生理溶液(例如葡萄糖或盐溶液)混合时往往不相溶而沉淀。此外，IL-10无法口服或局部途径给药。由于蛋白质在胃肠道中降解而不能利用口服途径。
上述方法均未建议促进哺乳动物IL-10内源性生成增加，而预防和治疗疾病或不适。
此外，已知IL-10是巨噬细胞和T细胞的强失活剂，其产生不足与多种自身免疫和炎症疾病有关。
本研究表明，对于健康献血员的PBMC，TTA增强LPS和PHA刺激的IL-10生成，但抑制PHA刺激的IL-2生成。这也许具有几个含意。首先，这些发现提示，TTA通过增强抗炎细胞因子IL-10的释放，并抑制炎症细胞因子IL-2的释放，而具有显著的抗炎实际效应。其次，我们的发现提示，TTA可以调节单核细胞(即LPS刺激)和淋巴细胞(即PHA刺激)的活化。最后，TTA对来自健康献血员的活化的PBMC的体外效应，可以反映以体内炎性活化增强为特征的各种患者群体的情况。事实上，健康对照者离体活化的PBMC，可代表各种炎症疾病体内干预治疗的有关靶细胞。
发明详述
本专利申请公开了本发明的优选化合物，即硫代脂肪酸四葵基硫代乙酸(TTA)在培养的细胞系PBMC中调节炎症细胞因子(即IL-2、IL-1β和TNF-α)以及抗炎症细胞因子(即IL-10)的释放。
更具体而言，本发明公开了TTA显著抑制中PHA刺激的IL-2释放，还增强由PHA刺激的IL-10释放。
这两种作用相加构成强大的抗炎症效应，因此期望本发明化合物有前景成为治疗和/或预防炎症相关疾病的重要化合物。
因此本发明涉及通式(I)的脂肪酸类似物的用途：
R1-[Xi-CH2]n-COOR2 (I)
-其中R1为
-具有一个或多个双键和/或一个或多个三键的C1-C24烯，或者
-C1-C24炔，或者
-C1-C24烷基，或在一个或几个位置由选自氟化物、氯化物、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、C2-C5酰氧基或C1-C4烷基的一个或多个化合物取代的C1-C24烷基，并且
-其中R2代表氢或C1-C4烷基，并且
-其中n为1-12的整数，并且
-其中i为奇数，显示相对于COOR2的位置，并且
-其中Xi各自独立选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，并且
-附带条件是至少一个Xi不是CH2，
-附带条件是如果R1是炔基，那么一个碳-碳三键位于
(ω-1)碳和(ω-2)碳之间，或者
(ω-2)碳和(ω-3)碳之间，或者
(ω-3)碳和(ω-4)碳之间，并且
-附带条件是如果R1是烯，那么一个碳-碳三键位于
(ω-1)碳和(ω-2)碳之间，或者
(ω-2)碳和(ω-3)碳之间，
或者其盐、前体药物或复合物，以制备用于治疗和/或预防炎症疾病的药物组合物。
更具体而言，本发明涉及在哺乳动物细胞或组织中增加内源性白细胞介素-10(IL-10)生成并抑制白细胞介素-2生成的方法。
本发明还涉及抑制受刺激的外周血单核细胞增殖的方法。
本发明当前优选的实施方案涉及化合物四葵基硫代乙酸(TTA)和四葵基硒代乙酸(TSA)。
【附图说明】
图1显示不同浓度TTA对PBMC增殖的作用。
图2显示不同浓度TTA对PBMC上清液中IL-10(A)、IL-2(B)、TNFα(C)和IL-1β(D)释放的作用。
图3显示的TNFα(10ng/mL)单独或与不同浓度TTA联合对PBMC上清液中IL-10(A)和IL-1β(B)释放的作用。
图4.IL-2(10ng/mL)和抗IL-10(5μg/mL)对于TTA介导的抑制由PHA刺激的PBMC增殖的作用。
施用本发明的化合物
可利用任何适用技术，包括肠道外、鼻内、口服或透皮吸收，将本发明的化合物作为药剂直接施用于哺乳动物。可以局部或全身给药。每种药剂的具体给药途径取决于例如该哺乳动物的病史。
另外，本发明的化合物适当地与其它疗法联合施用，以抗击或防止炎症和自身免疫疾病。
参照以下实施例可以更充分地理解本发明。但不应理解为限制本发明的范围。
实验部分
实施例1.化合物的制备和特性鉴定
3-取代的脂肪酸类似物的合成
按照以下一般程序，可以制备本发明使用的化合物，其中Xi＝3为硫原子或硒原子：
X为硫原子：
按照以下所示一般程序制备本发明使用的硫-取代化合物：
如EP-345.038所示，制备硫代化合物，即四葵基硫代乙酸(TTA)，(CH3-(CH2)13-S-CH2-COOH。
X为硒原子：
可以按以下一般程序制备本发明使用的硒-取代化合物
1.
2.
3.
通过从乙醇或甲醇中小心结晶而纯化该化合物。
4.
5.
例如，如果烷基为十四烷基，可以通过从二乙醚和己烷结晶作用，纯化最终的化合物(CH3-(CH2)13-Se-CH2-COOH(四葵基硒代乙酸(TSA))。
如申请人的专利申请PCT/NO99/00135和NO 20001123所示，能够合成符合本发明的其它化合物。
实施例2
淋巴细胞增殖
在采血后1小时内，肝素化血液通过Isopaque-Ficoll(Lymphoprep，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度离心，获得献血员(n＝5)外周血单核细胞(PBMC)。PBMC重悬于补加10％热灭活混合人AB+血清、含2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES缓冲液(Gibco BRL，Paisley，UK)的RPMI 1640(培养基)。培养基、试剂和刺激剂的内毒素水平小于10pg/mL(定量显色鲎变形细胞溶解物试验，BioWhittaker，Inc.，Walkerswille，MD)。
在平底96孔微孔板(200μl/孔；Costar，Cambridge，MA)中，将PMNC(106细胞/mL)与单独培养基、或单独植物血球凝集素(PHA；Murex Diagnostics Ltd，Dartford，UK；终浓度1∶100)或连同不同浓度TTA温育。牛血清白蛋白(BSA，Calbiochem，La Jolla，CA)用作TTA的阴性对照(媒介物)。一些实验于刺激以前，在细胞培养物中加入起中和作用的单克隆抗人白细胞介素(IL)-10(终浓度5μg/mL；Endogen，，Cambridge，MA)或重组人IL-2(终浓度10ng/mL；R & D Systems，Minneapolis，MN)。48小时后，细胞用1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷(Amersham International plc.，Little Chalfont，UK)冲击，16小时后利用自动化多样品收集器(Skatron，Lier，Norway)将培养物收集到玻璃滤条上。利用液体闪烁计数，以每分钟计数(cpm)确定3H-胸腺嘧啶核苷掺入。
结果
单独施用TTA，对淋巴细胞增殖没有作用，TTA以剂量依赖方式显著抑制由PHA刺激的PBMC增殖(降低～60；图1)。全部五名献血员中都观察到这种抑制作用。相反，单独施用媒介物(BSA)对由PHA刺激的PBMC增殖没有作用(图1)。
实施例3
PBMC上清中细胞因子的释放
在平底96孔微孔板(200μl/孔；Costar)中，将PMNC(106细胞/mL)与单独培养基(参见上文)，或者与PHA(终浓度1∶100)、来自E.coliO26：B6的脂多糖(LPS)(终浓度10ng/mL；Sigma，St.Louis，MO)或肿瘤坏死因子(TNF)？(终浓度10ng/mL；R & D Systems)在有或无不同浓度TTA的情况下温育。BSA用作TTA的阴性对照(媒介物)。20小时后收集无细胞上清，-80℃保存。
酶免疫测定(EIAs)
按照厂家说明书，利用EIAs分析PBMC上清中细胞因子的浓度(IL-1β和IL-10：CLB，Amsterdam，Netherlands；IL-2：R & DSystems)。
统计分析
使用配对样品T检验评价TTA(或BSA)对不同参数的作用。P值(双侧)小于0.05则认为显著。
结果
TTA对PBMC上清中细胞因子水平的作用
如图2所示，单独的TTA对任何一个细胞因子IL-2、IL-1β、IL-10和TNFα的生成都没有影响。
然而，当TTA与PHA或LPS一起加到细胞培养物中时，揭示了几个重要发现。
首先，TTA以剂量依赖方式显著抑制由PHA刺激的IL-2释放(降低～75％)(图2)。
其次，与该抑制作用相反，TTA以剂量依赖方式显著增强由LPS(升高～3倍)以及特别是PHA(升高～11倍)刺激的抗炎症细胞因子IL-10的释放(图2)。
第三，与这些对IL-2和IL-10水平的显著作用相反，TTA对由LPS刺激的TNFα和IL-1β的释放没有或只有适量效用(图2)。媒介物(BSA)对由PHA或LPS刺激的细胞因子释放均没有作用(图2)。
总之，TTA对由LPS以及特别是由PHA刺激的PBMC释放细胞因子具有若干作用，有利于抗炎的实际效果。
TTA对PBMC上清中由TNFα刺激的细胞因子释放的作用
已经报道脂肪酸可调节多种TNFα介导的作用。TNFα可以诱导其它细胞因子，例如IL-10和IL-1β的生成(11，12)，因此我们在5名健康献血员中，研究TTA是否可以调节由TNFα诱导PBMC释放这些细胞因子。值得注意的是，TTA对由LPS刺激的TNF？的释放没有影响(图2)，但TTA显著增强由TNFα刺激的IL-1β(增加～5倍)以及特别是IL-10(增加～11倍)的释放(图3)。这些发现提示，TTA能够显著增强由TNFα刺激PBMC释放细胞因子，尤其增强其释放IL-10的作用。
实施例4
IL-2和抗IL-10对TTA介导的淋巴细胞增殖抑制的作用
已知IL-2和IL-10分别增强和抑制淋巴细胞增殖。因此，我们研究TTA对由PHA刺激的PBMC增殖的抗增殖作用是否与TTA介导的对这些细胞因子的作用有关(参见上文)。但是，向细胞培养物中加入抗IL-10没有影响，而IL-2对TTA介导的淋巴细胞增殖抑制只有少量反作用(图4)。因此，似乎TTA的抗增殖和抗炎症作用至少部分代表了截然不同的生物学机制。
结论
如实验部分所示，TTA对于活化的PBMC释放细胞因子具有若干作用，IL-10水平显著升高，而伴有IL-2水平下降。这有利于抗炎症的实际效果，因此期望本发明化合物可用于调节炎性过程，因而能够用作治疗和/或预防炎症疾病的药物。
此外，我们表明TTA支配TNFα对这些细胞的细胞因子刺激作用，尤其增强其对IL-10水平的作用。
最后，TTA还显著抑制PBMC增殖，这种抗增殖作用不涉及凋亡增强，并且似乎至少部分不同于TTA的抗炎症作用。
我们的发现提示，TTA对活化的人PBMC具有有效的抗炎症和抗增殖作用。
增加IL-10并降低IL-2水平，可能对于若干疾病的治疗具有重要性。其中包括各类免疫调节性疾病，例如风湿性关节炎、全身性脉管炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、皮肌炎、多肌炎、各种自身免疫内分泌紊乱(例如甲状腺炎和肾上腺炎)、各种免疫调节性神经紊乱(例如多发性硬化症和重症肌无力)、各种心血管异常(例如心肌炎、充血性心力衰竭、动脉硬化症以及经常性和非经常性绞痛、以及韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis))、炎症肠病和克罗恩结肠炎(Chron′s colitis)、肾炎、各种炎症皮肤病(例如牛皮癣、过敏性皮炎和食物过敏)以及器官移植后急、慢性同种异体移植物排斥。
已知IL-10是巨噬细胞和T细胞的强失活剂，IL-10的生成不足与多种自身免疫和炎症疾病有关。因此期望本发明的化合物能够用于预防和/或治疗自身免疫和炎症疾病。
风湿性关节炎、甲状腺炎、胶原诱发关节炎以及实验过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis)的自身免疫模型均提示，IL-10在限制炎症及免疫病理中具有负调节作用。此外，定向破坏IL-10基因的小鼠自发产生一般性小肠结肠炎。人类克罗恩结肠炎和牛皮癣甚至对于全身性施用IL-10治疗可能更为敏感。最后，新近还发现IL-10对小鼠产生动脉硬化症和病毒性心肌炎具有保护效应。因此，增强IL-10水平的疗法可能对于处理上述及其它自身免疫和炎症疾病大有益处，可以预期本发明的化合物具有此种特性。
另外，我们表明TTA显著增强由TNFα诱导的IL-10水平，若用于治疗，此种抗炎症特性有可能防止TNFα的有害作用。