甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法.pdf

本发明涉及一份甜瓜蔓枯病聚合抗源新种质及其选育的方法，属于植物生物技术育种领域。该聚合基因材料聚合了抗源PI420145和PI482398(Gsb-4)的抗蔓枯病基因，其抗性高于单一抗源，且农艺性状良好。选育方法是PI420145与PI482398杂交，所得F1连续自交三代，其中，每一代都采用表型鉴定和分子标记辅助选择相结合的方法进行筛选，选出同时聚合了两亲本抗性基因且抗性高于亲本的单株自交。并将与抗蔓枯病材料PI420145的抗性基因连锁的AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200转化为SCAR标记SGSB1800，能够迅速、简便的用于分子标记辅助选择。本发明获得的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料抗性高于单一抗源，且其鉴定方便，大大提高了甜瓜抗蔓枯病新品种的选择效率，提供了新抗源，也为进一步获得新的抗性品系奠定了基础。

权利要求书1.  甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，包括： 以甜瓜抗蔓枯病材料PI420145和PI482398为亲本进行杂交，利用表型鉴定 和分子标记辅助选择筛选技术获得较为稳定的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料 4598。 2.  根据权利要求1所述的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，其特征 在于： 1)PI482398要比PI420145提早15天进行催芽，定植，以使两者花期相遇； 2)以PI420145(雌花为两性花)作为母本，PI482398为父本，于开花前一 天套袋隔离，并对PI420145雌花去雄，4朵雄花授一朵雌花，授粉后32-36天， 采收发育成熟果实的种子； 3)杂交种子种植后，经表型鉴定和分子标记鉴定，筛选同时具有PI482398 和PI420145的抗病基因且表现为高抗的植株进行自交留种，并对自交种进一步 筛选鉴定，直至获得较为稳定的聚合材料。 3.  根据权利要求1或2所述的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，其 特征在于分子标记鉴定过程是同时利用与PI420145和PI482398抗蔓枯病基因分 别连锁的分子标记进行选择，其中将与PI420145连锁的AFLP标记转化成简单 易行的SCAR标记SGSB1800，其序列为： 正向引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’， 反向引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’。 4.  根据权利要求1-3之一所述方法育成的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料在甜瓜 育种中的应用。

说明书甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法
一、技术领域
本发明属于植物生物技术育种领域，涉及一份甜瓜蔓枯病聚合抗源新种质及其选育 的方法，可用于甜瓜抗蔓枯病新品种的选育及聚合抗源材料的筛选。
二、技术背景
甜瓜蔓枯病是严重危害甜瓜生产的全球性病害之一，发生后常会导致毁灭性的后 果，而防治该病害最安全、有效且节约成本的方法是培育抗蔓枯病品种。国际上常用的 抗蔓枯病材料为PI140471、PI157082、PI511890、PI482398和PI482399(其抗性基因分 别命名为Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4和gsb-5)，PI420145则是本课题组新筛选的1 份甜瓜抗蔓枯病材料(Wolukan，2007)，而相关研究表明，除gsb-5为隐性单基因外，其 他相关抗性基因均为显性单基因。蔓枯病菌会受环境影响而发生变化，若品种仅携带单 个抗蔓枯病基因，则会因病原菌产生新的生理小种或转化型而导致其抗性降低甚至失去 抗性，若含有多个抗病基因，则能克服这一不足，提供更加持久稳定的抗性。所以，如 果几份抗蔓枯病基因是不同的，则可以考虑将不同抗蔓枯病材料中的抗蔓枯病基因聚合 到一份材料中。2011年，本课题组刘文睿经等位性测验证明，PI420145所含抗病基因 与Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3及Gsb-4基因均为非等位基因，这为甜瓜抗蔓枯病聚合育种的 可行性提供了理论依据(刘文睿，2011)。
传统选育抗病材料的方法是根据接种后植株的表型，筛选不发病或者发病轻的植株 作为抗病材料。但是，受接种技术和发病条件的影响，选择效率和准确度不高。利用分 子标记进行辅助筛选，则可在早代进行选择，缩小育种群体，并且不受环境、生长季节 的限制，大大缩短育种年限、提高育种效率。CMTA170a是本课题组申请的专利《甜瓜 抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记》(申请号2011100810734)中筛选到的与PI482398的 抗性基因Gsb-4连锁的SSR分子标记，可用于相关抗性基因的筛选； EcoRI-TG/MseI-CTC200是本课题组申请的专利《甜瓜抗蔓枯病基因位点的分子标记方 法》(申请号200710025531.6)中的与PI420145抗蔓枯病基因连锁的AFLP标记，可用 于含PI420145抗蔓枯病基因的检测。然而，到目前为止仍未见有甜瓜抗蔓枯病聚合基 因材料的报道，这在一定程度上限制了甜瓜抗蔓枯病聚合育种研究。
三、发明内容
技术问题
本发明涉及一份甜瓜蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，主要针对单一抗源抗性基 因抗性不稳定及AFLP标记辅助选择技术要求高，费用昂贵等问题，采用传统的接种鉴 定法结合分子标记辅助选择，筛选得到一份甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料，为进一步发掘 出新的稳定的甜瓜抗蔓枯病基因资源提供基础，进而大大提高选择效率，减少成本消耗， 加快培育优良抗蔓枯病甜瓜品系。
技术方案
本发明甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，其实施方案如下：
1.甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，包括：
以甜瓜抗蔓枯病材料PI420145和PI482398为亲本进行杂交，并连续自交，利用表 型鉴定和分子标记辅助选择筛选技术获得较为稳定的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料4598；
2.上述的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，其特征在于：
1)PI482398要比PI420145提早15天进行催芽，定植，以使两者花期相遇；
2)以PI420145(雌花为两性花)作为母本，PI482398为父本，于开花前一天套袋 隔离，并对PI420145雌花去雄，4朵雄花授一朵雌花，授粉后32-36天，采收发育成熟 果实的种子；
3)杂交种子种植后，经表型鉴定和分子标记鉴定，筛选同时具有PI482398和 PI420145的抗病基因且表现为高抗的植株进行自交留种，并对自交种进一步筛选鉴定， 直至获得较为稳定的聚合材料。
3.上述的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法，其特征在于分子标记鉴定过程 是同时利用与PI420145和PI482398抗蔓枯病基因分别连锁的分子标记进行选择，其中 将与PI420145连锁的AFLP标记转化成简单易行的SCAR标记SGSB1800，其序列为：
正向引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’，
反向引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’。
4.上述方法育成的甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料在甜瓜抗蔓枯病育种中的应用。
有益效果
1)本发明利用甜瓜抗蔓枯病材料PI420145与PI482398创建了含有两者抗病基因的 聚合材料，命名为4598。这是迄今为止，国内外首次创制成功的甜瓜抗蔓枯病聚合材料， 为甜瓜抗蔓枯病育种提供了新抗源，也为进一步获得新的抗性品系奠定了基础。
2)本发明获得的聚合材料含有2种抗蔓枯病基因，抗性明显高于含有单一抗性基 因的双亲。
3)本发明将AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200转化为SCAR标记，操作更为简单 方便，成本更加低廉，适宜用于大量样品分析。
四、附图说明
图1：SSR引物CMTA170a在抗源PI482398、白皮脆和聚合抗源F4上扩增的结果： 表明聚合抗源后代F4中含有抗源PI482398的抗蔓枯病基因。
图中，M：Marker，1：感蔓枯病单株白皮脆，2：抗蔓枯病单株PI482398，3-32：聚合 抗源F4(即4598)。箭头示为出现的特异带。
图2：SCAR引物SGSB1800在抗源PI420145、感病材料白皮脆、聚合抗源F4上的 扩增结果。
图中，M：Marker，1：抗蔓枯病单株PI420145，2：感蔓枯病单株白皮脆，3-17：聚合 抗源F4。箭头示为出现的特异带。
五、具体实施方式
本发明甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料及其选育方法的实施程序包括：
(1)育苗。选用PI420145与PI482398为亲本(选用的抗病材料见参考文献： Wolukau et al.，2007，Resistance to gummy stem blight in melon(Cucumis melo L.)germplas  m and inheritance of resistance from plant introductions157076，420145，and323498.Hort  Science42(2)：215-221；Frantz JD，and Jahn MM.2004，Five independent loci each control mo  nogenic resistance to gummy stem blight in melon(Cucumis melo L.).Theor Appl Genet，109： 1261-1266.)，PI420145比PI482398提前15天催芽，定植，定植后采用正常的栽培管理 措施。
(2)授粉及采收。授粉前一天下午，选取PI420145第二天开放的完全花去雄，套 袋；选取PI482398第二天开放的雄花套袋，每套一朵雌花则套4朵雄花。第二天上午 8-10点进行授粉，4朵雄花授一朵雌花，授粉后套袋隔离，32-36天后采收。
(3)表型鉴定与分子标记辅助筛选。表型鉴定于幼苗长至4-5片真叶时进行，并利 用分子标记SGSB1800和CMTA170a进行进一步筛选确认。其中，表型鉴定表现高抗且 含有双亲抗病基因的植株为聚合抗源材料，用于自交留种，进行进一步筛选。
具体技术过程如下：
(1)群体构建及聚合材料鉴定：PI420145(♀)和PI482398()杂交后得到F1， 经表型和分子标记鉴定后，F1聚合了两抗蔓枯病基因且表型高抗，F1自交，得到F2，220 株构建F2群体，对F2群体进行表型和分子标记鉴定后，筛选表现为高抗且含有双亲抗 病基因的植株，得到23株聚合单株，单株自交后，最终有15个种瓜获得种子；每个瓜 选出30粒种子构建F3群体，于苗期4-5真叶时进行表型和分子标记鉴定，得到47株聚 合单株；47株聚合植株单株自交留种，得到38个种瓜的种子，即为本文的聚合材料。 F4每个瓜中随机挑选40粒种子进行聚合鉴定，结果表明F4种子含有双亲抗病基因且表 现高抗(表1)。
(2)蔓枯病菌接种鉴定：抗源PI420145、PI482398、感病材料白皮脆和聚合抗源 F4人工接种鉴定，待幼苗长到4-5片真叶时进行接种，将分生孢子配置为浓度为5×105个/ml的孢子悬浮液，用喷壶喷洒孢子悬浮液，植株的叶的正反面以及茎部都要喷，直 到植株的叶片开始滴水为止。接种后小拱棚保湿，外加遮阳网遮光保持黑暗的环境，相 对湿度95％以上，温度28±2度，3天后揭开小拱棚，7、14和21天后分别调查统计病 情。在接种4天后使用统计，病害茎部分级标准为：1级＝无伤害；2级＝单个病斑1～10 mm长或者多个病斑总长度为1～20mm但没有环茎一周；3级＝病斑达21～80mm或者 环茎一周；4级＝茎蔓萎蔫，但未死亡；5级＝植株死亡；其中病害级别为1，2的个体记 为抗病株，病害级别为3，4和5的个体记为感病株。叶片侵染分级标准：1)无可见侵 染；2)叶片侵染面积≤25％；3)叶片侵染面积≥25％≤50％；)；4)叶坏死面积＞50％，≤ 75％；5)叶坏死面积＞75％。其中病害级别为1，2的个体记为抗病株，病害级别为3，4 和5的个体记为感病株。其发病率和病情指数如表1，由此可知聚合抗源材料抗性高于 单一抗源。
表1抗蔓枯病接种鉴定

(3)SCAR标记的转化：采用EcoRI-TG/MseI-CTC200对PI420145、白皮脆及白皮脆 ×PI420145后代(F1和F2)进行AFLP引物多态性筛选。抗性材料均在200bp处扩出了 1条多态性条带，而感病材料则无。回收200bp处的特异性条带并克隆、测序，根据测 序结果设计SCAR引物SGSB1800，在抗性材料中1800bp处扩增出抗性特异条带感病 材料无，由上海英潍捷基(上海)生物公司合成，序列为：
正向引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’
反向引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3
利用白皮脆×PI420145后代(F1和F2)对SGSB1800进行验证，其与EcoRI-TG/MseI-CTC200在F1和F2上条带一致，说明AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200成功转化为SCAR标记 SGSB1800。SGSB1800具体应用程序如下：PCR反应体系为20μL，含 10×PCR Buffer2.0μL，25mmol/L MgCl21.2μL，150μmol/L dNTPs2.0μL，0.67μmol/L标 记引物各1.0μL，40ng/μL基因组DNA1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补 足至20μL；94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min20s，35个 循环；72℃延伸10min，4℃保存；利用1％琼脂糖凝胶电泳，将4μL PCR和2μL上样 缓冲液混合点样，90V电泳40min，溴化乙锭显色。
(4)利用SCAR标记与SSR标记相结合方法进行分子标记辅助选择。若SCAR标 记SGSB1800在PI420145和聚合抗源上在1800bp处扩增出一样的抗性特异条带(图2)， 则聚合抗源材料聚合了PI420145的抗蔓枯病基因；若SSR标记CMTA170a在抗源 PI483398和聚合抗源中扩增出120bp的特异条带(图1)，则聚合抗源材料含有PI482398 的抗蔓枯病基因Gsb-4。蔓枯病接种鉴定，其表型表现高抗，所以F4聚合了PI420145 和PI482398两份抗源的抗蔓枯病基因，抗性增强，是一份新的聚合抗源新种质。