一种中药制剂 技术领域：本发明是防治骨质疏松症的制剂，特别是关于一种用蛇床子素制剂在防治骨质疏松症病药的应用。
背景技术：骨质疏松症(Osteoporosis简称OP)是指骨量减少、骨组织纤维结构受损、骨质变薄、变松、骨脆性增加、抗强力减弱而易发骨折，失去活动能力为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。是一种老年人的常见病、多发病，在世界上常见病中占第7位。随着全球人口老龄化和人类生活水平的提高，骨质疏松症及其治疗已成为近来医药研究领域中一个热门课题。国际医学界已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病等并列为严重危害老年人健康的重大疾病。我国是世界上老年人口最多的国家，占世界老年人口的1/5，占亚洲老年人口的1/2。1997年中国骨质疏松症的患者人数约为8390万人，发生率占全国总人口的6.6％。随着时间的推移人类年龄结构的老龄化，该类疾病患者的人数还将不断增加。现代医学对骨质疏松的病因尚不十分清楚，但目前研究认为与雌激素缺乏、钙摄入不足、体力活动减少、阳光照射不足、维生素D缺乏及不良嗜好有关。是多种病因、多个环节共同作用的结果，且与人体的衰老密切相关。目前这类疾病常用治疗方法是雌激素替代疗法和补充钙剂，前者虽然效果较好，但由于有较多的副作用在临床治疗中始终难以推广，后者由于没有解决实质问题所以收效甚微。预防骨质疏松症有着重要的社会意义。目前国内外学者均在努力寻找治疗骨质疏松地特效药，经研究证实和临床应用，补肾壮骨中药治疗骨质疏松症取得了一定效果，且毒副作用小，价格适中，可长期服用。然而，目前骨质疏松症的中药也明显存在着用药量大，有效成分不明确，难以进行必要的质量控制以及无法用现代医药理论进行解释的问题。因此，开发抗骨质疏松症的现代中药，以及对具有抗骨质疏松症作用的中药进行中药现代化的研究，寻找出其中的活性成分非常迫切和必要。近年来国内学者发现中药蛇床子对骨质疏松症有一定疗效，用它制成的制剂能够阻止骨质的进一步丢失，对已形成丢失的骨质也有促进新骨形成的作用，并提出将其作为中药原料应用于一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂中的专利要求(专利申请号分别为：93106922.X、93121565.X和95100697.5)，也有学者通过研究将中药蛇床子进行提取，并将得到的蛇床子提取物应用于防治骨质疏松症制剂的制备。提出“一种防治骨质疏松症的制品，其特征在于该制品含有伞形蛇床属植物蛇床的果实蛇床子的提取物……”的专利要求(专利申请号：92105338.X)。在上述专利中，专利号为：93106922.X、93121565.X和95100697.5的三个专利，均是以蛇床子作为一种中药原料添加于防治骨质疏松症的中药复方制剂，蛇床子中含有许多成分，其中包括有效成分和起毒副作用的成分。而专利号为：92105338.X的专利，发明人也指出用“蛇床子提取物包括蛇床子总香豆素、蛇床子素、佛手柑内酯、β-谷甾醇、异虎耳草素、花椒毒酚、花椒毒素、欧芹属素乙和α-松油二环烃、樟烯、异戊酸龙脑酯”等多种成份，但它的蛇床子提取物构成复杂、各种成分的药理作用不明确，同时由于蛇床子原料的不同，造成不同批次的蛇床子提取物中总香豆素等各种成分的比例也不相同，致使临床用药中有效成分剂量不易控制，增加了不必要的毒副作用(蛇床子总香豆素小鼠口服LD50为2.449/kg《有毒中草药大辞典》郭晓庄主编天津科技翻译出版公司p493-494.)；而且由于蛇床子提取物中成分复杂，难以达到国际药用制剂的基本标准，从而使该类产品无法走向国际药品市场，影响该产品的国际化，也不符合中药现代化的要求。
发明内容：本发明的目的是提供一种中药制剂，它将高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)用于制备防治骨质疏松症的制剂中，这种制剂能阻止骨质的进一步丢失，增加骨密度，促进新骨的形成，具有低毒、疗效确切、不良反应少、治疗剂量易于控制、符合国际药用制剂的标准要求。
本发明的技术方案是：设计一种中药制剂，其特征是：所述的中药制剂是纯度为≥90％以上的蛇床子素Osthol，它作为制备防治骨质疏松症病药的应用。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和淫羊藿甙重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和大豆素重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和染料木素重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和染料木素重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和大豆甙其重量比选择在90％-10％％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和染料木甙其重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和钙剂其重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和葛根素其重量比选择在90％-10％。
所述的中药制剂包含有高纯度蛇床子素Osthol重量比选择在10％-90％，和大豆异黄酮其重量比选择在90％-10％。
本发明的特点是：本发明将蛇床子提取物中各种成分，经特殊手段分离得到了高纯度蛇床子素(这种高纯度蛇床子素是指纯度≥90％的欧芹酚甲醚，Osthol)。蛇床子素的异名是：欧芹酚甲醚；甲氧基欧芹酚。英文名：Osthol；Osthole；Osthola.化学名是：7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素(2H-1-Benzopyran-2-one，7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-)；分子式：C15O16H3，分子量：224.28其结构式见图1，核磁共振图谱见图2和图3。它的制备工艺是将蛇床子原料用醇回流提取、浓缩、水清洗、碱水清洗、醇溶解、活性炭脱色、醇水结晶、干燥，所得产品纯度可以达到90％以上(见专利申请号03134435.6)，该制备工艺完全可以实现大规模工业化生产，通过这种工艺得到的蛇床子素(Osthol≥90％)经过高效液相色谱仪(Waters Corporation，美国)检测，结果显示明显减少了其他成分的存在见图4；使用这种蛇床子素进行的小鼠急性毒性试验，结果表明：该蛇床子素的急性毒性低，毒副作用小(见试验1)；使用这种蛇床子素进行的小鼠药理试验，结果表明：蛇床子素对中枢神经系统无明显的兴奋或抑制作用，对协调运动也无明显的影响(见试验2、试验3、试验4)将这种蛇床子素应用于骨质疏松症实验动物模型进行了试验，数据表明蛇床子素对去卵巢大鼠股骨骨密度的降低具有良好的防治作用。(见试验5)，使用药剂量易于控制，从而使该类制剂符合中药现代化的要求，也能达到国际药用制剂的标准要求。
主要试验：
试验1：
小鼠灌服蛇床子素急性毒性试验报告
一、摘要
小鼠灌服蛇床子素的LD50为6.241g/kg，95％可信限为5.373g/kg～7.249g/kg。给药后小鼠活动减少，趴卧，个别小鼠有流涎，给药后4小时小鼠开始死亡，死亡前小鼠呈持续性小惊厥和抽搐，最后由于呼吸困难而死亡。存活小鼠中，较高剂量组小鼠体重下降，摄食量减少，而小剂量组小鼠体重略有增加。解剖中毒死亡小鼠肉眼观察可见肺脏有不同程度的水肿，脾、肾等脏器有轻微充血，肠胀气。尸解处死存活小鼠，除高剂量组小鼠肠胀气外，未发现其它主要脏器有肉眼可见的病理性改变。
二、试验目的
观察小鼠灌服蛇床子素后所产生的急性毒性反应和死亡情况。
三、受试药物
1名称：蛇床子素
2提供单位：西安绿泉生物技术有限公司提供
3制剂、批号：蛇床子素，为乳白色粉末，纯度为95.00％，批号：030516，临用时用0.5％羧甲基纤维素钠和0.1％吐温-80配制成25.00％烟、21.25％、18.06％、15.35％和13.05％浓度的混悬液，供实验用。
四、实验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重20.5±1.6g，苏州大学实验动物中心供应，清洁级，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。实验饲养室温度18±2℃。
五、实验方法
通过预试，初步估计蛇床子素急性毒性的剂量范围为5.0～10.0g/kg，在此基础上进行正式试验。取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，实验前禁食10小时后，每组动物分别按10.000、8.500、7.224、6.140和5.220g/kg灌服蛇床子素，给药体积为0.4ml/10g体重，剂量比值r＝0.85。
六、实验结果
小鼠灌服蛇床子素后，活动减少，趴卧，个别小鼠有流涎，给药后4小时小鼠开始死亡，死亡中的大部分小鼠于给药后24小时内产生死亡(见表1)。死亡小鼠在死亡前呈持续性小惊厥和抽搐，最后由于呼吸困难而死亡。在实验结束时的存活小鼠中，较高剂量组小鼠体重下降，摄食量减少，而小剂量组小鼠体重略有增加(见表2)。解剖中毒死亡小鼠肉眼观察可见肺脏有不同程度的水肿，脾、肾等脏器有轻微充血，肠胀气。尸解处死存活小鼠除高剂量组小鼠肠胀气外，未发现其它主要脏器有肉眼可见的病理性改变。小鼠灌服蛇床子素的LD50测定结果见表3。
表1 小鼠灌服蛇床子素急性毒性试验期间小鼠死亡情况
受试剂量 动物数 死亡数(只)
(g/kg) (只) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天
10.000 10 8 1 0 0 0 0 0
8.500 10 6 2 0 0 0 0 0
7.224 10 5 3 0 0 0 0 0
6.140 10 2 1 1 0 0 0 0
5.220 10 2 0 0 0 0 0 0
表2小鼠灌服蛇床子素急性毒性试验期间小鼠体重(g)变化
受试剂量(g/kg) 给药前(n＝10) 给药7天后
10.000 20.8±1.6 16(1)
8.500 20.7±1.5 20.5±2.1(2)
7.224 20.5±1.5 22.2±3.9(2)
6.140 20.2±2.1 16.5±3.3(6)
5.220 20.4±1.4 22.8±2.6(8)
注：括号内为存活动物数。
表3 小鼠灌服蛇床子素急性毒性试验结果
受试剂量 对数剂量 动物数 死亡数 死亡率 机率单位 LD50及95％可信限
(g/kg) (X) (只) (只) (％) (Y) (g/kg)
10.000 1.000 10 9 90 6.282
8.500 0.929 10 8 80 5.842 6.241
7.224 0.859 10 8 80 5.842 5.373～7.249
6.140 0.788 10 4 40 4.747
5.220 0.718 10 2 20 4.158
根据上述实验结果，按Bliss法计算小鼠灌服蛇床子素的LD50为6.241g/kg，95％可信限为5.373g/kg～7.249g/kg。
七、结论
小鼠灌服蛇床子素的LD50为6.241g/kg，95％可信限为5.373g/kg～7.249g/kg。比总香豆素急性毒性小(蛇床子总香豆素小鼠口服LD50为2.44g/kg《有毒中草药大辞典》
本实验方法符合中华人民共和国卫生部药政局：中药新药研究指南(药学、药理学、毒理学)1994年，203-204。和徐叔云等主编：药理实验方法学，第二版，北京：人民卫生出版社，1991：201-203。
试验2：
口服蛇床子素对小鼠自发活动的影响
一、摘要
用抖笼法记录小鼠口服蛇床子素后的活动情况，结果表明，给小鼠灌服蛇床子素10、20、40mg/kg后，小鼠的自发活动未见有明显增加或减少，提示蛇床子素对中枢神经系统无明显的兴奋或抑制作用。
二、试验目的
观察小鼠口服蛇床子素后的自发活动，了解蛇床子素对小鼠中枢神经系统的影响。
三、受试药物
1.蛇床子素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030516，用0.5％吐温-80配制成0.1％、0.2％、0.4％混悬液，备用。
2.舒乐安定片，1mg/片，由常州四药制药有限公司生产，批准文号：国药准字H32020699，生产批号：KC9327，用0.5％吐温-80配制成0.01％的溶液。
四、实验仪器
张力换能器，量程0～30g，由安徽传感器系统工程(集团)公司技术开发部生产。
Medlab生物信号采集处理系统，由南京美易科技有限公司提供。
五、实验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重20.3±1.4g，苏州大学实验动物中心供应，清洁级，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。实验期间饲养室温度18±2℃。
六、实验方法
取昆明种小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，用抖笼法，将小鼠置于笼中，笼下丝线通过张力换能器与电脑信号采集处理系统相连。小鼠禁食10小时后，分别灌胃给予蛇床子素10、20、40mg/kg，舒乐安定1mg/kg和溶媒组(0.5％吐温-80)，给药容积均为0.1ml/10g体重，正常对照组给予相应体积的蒸馏水，分别记录给药前、给药后15，30，45，60，75，90，105分钟的小鼠活动轨迹，每次记录2分钟，用SigmaScan Pro4.0软件正确扫描记录纸上的活动轨迹图形的面积，然后进行统计学处理。
七、实验结果
由图5表4和图6、图7、图8、图9、图10、图11可见，溶媒组小鼠在给予灌服0.5％吐温-80后，自发活动与正常对照组相比未见有明显影响(P＞0.05)，小鼠灌服蛇床子素10、20、40mg/kg组在给药后各个时间段，自发活动与溶媒组相比也未见有明显影响(P＞0.05)，而舒乐安定组在给药后15，30，45，60分钟时的活动轨迹面积明显减少，与溶媒组相比，则有显著性差异(P＜0.01)。由此提示，小鼠口服蛇床子素10、20、40mg/kg对中枢神经系统无明显兴奋或抑制作用。
八、结论
在本实验条件下，小鼠灌服蛇床子素10、20、40mg/kg后对小鼠自发活动未见有明显的增加或减少，提示对中枢神经系统无明显兴奋或抑制作用。
本试验方法符合：徐叔云、卞如濂，陈修主编：药理实验方法学(第二版)，人民卫生出版社，1991年，652-653和陈奇主编：中药药理研究方法学，人民卫生出版社，1993年，667-669。
试验3
小鼠口服蛇床子素对戊巴比妥钠催眠作用的影响
一、摘要
小鼠口服蛇床子素10、20、40mg/kg加腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)三个剂量组与溶媒(0.5％吐温-80)加腹腔注射戊巴比妥钠组相比，小鼠入睡时间与睡眠持续时间均无显著性差异。提示：小鼠口服蛇床子素10、20、40mg/kg对腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)催眠作用无明显协同或拮抗效应。
二、试验目的
观察小鼠口服蛇床子素对腹腔注射戊巴比妥钠的催眠作用是否具有协同或拮抗作用。
三、受试药物
1.蛇床子素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030516，用0.5％吐温-80配制成0.1％、0.2％、0.4％混悬液，备用。
2.舒乐安定片，1mg/片，由常州四药制药有限公司生产，批准文号：国药准字H32020699，生产批号：KC9327，用0.5％吐温-80配制成0.01％的溶液。
3.戊巴比妥钠：中国医药(集团)上海化学试剂公司提供，批号：20030816。用生理盐水配成0.30％的溶液。
四、实验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重19.6±1.0g，苏州大学实验动物中心供应，清洁级，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。实验期间饲养室温度18±2℃。
五、实验方法
取昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为8组。其中6组分别灌胃给予蛇床子素10、20、40mg/kg，舒乐安定1mg/kg，溶媒(0.5％吐温-80)和等体积蒸馏水，给药容积均为0.1ml/10g体重，灌胃后1小时腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，另两组分别腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)和灌胃给予舒乐安定(1mg/kg)，观察并记录小鼠腹腔注射戊巴比妥钠后的时间和翻正反射消失及恢复时间，按下列公式计算小鼠的入睡时间和睡眠持续时间。入睡时间＝翻正反射消失时间-腹腔注射完毕时间，睡眠持续时间＝翻正反射恢复时间-翻正反射消失时间。
六、实验结果
由表5可见，溶媒+戊巴比妥钠组与蒸馏水+戊巴比妥钠组相比，小鼠入睡时间和睡眠持续时间均无明显差异(P＞0.05)，蛇床子素10、20、40mg/kg+戊巴比妥钠(30mg/kg)三个剂量组与溶媒+戊巴比妥钠组相比，小鼠入睡时间和睡眠持续时间也均无明显差异(P＞0.05)，口服舒乐安定+戊巴比妥钠组小鼠的入睡时间与溶媒+戊巴比妥钠组相比显著加快，睡眠持续时间显著延长(P＜0.01)。
表5 小鼠口服蛇床子素对戊巴比妥钠催眠作用的影响( x±SD，n＝10)
组别 动物数 小鼠入睡时间(分钟) 小鼠睡眠持续时间(分钟)
戊巴比妥钠(30mg/kg)组 10 5.2±1.5 61.7±33.6
舒乐安定(1mg/kg)组 10 未入睡 未入睡
蒸馏水+戊巴比妥钠
10 5.9±1.5 60.3±32.5
(30mg/kg)组
溶媒+戊巴比妥钠
10 6.3±1.9 58.9±33.9
(30mg/kg)组
蛇床子素10mg/kg+戊巴
10 6.1±1.3 66.3±50.5
比妥钠(30mg/kg)组
蛇床子素20mg/kg+戊巴
10 5.7±1.2 72.6±42.3
比妥钠(30mg/kg)组
蛇床子素40mg/kg+戊巴
10 6.0±0.9 52.2±40.7
比妥钠(30mg/kg)组
舒乐安定1mg/kg+戊巴
10 2.7±1.3** 169.0±46.4**
比妥钠(30mg/kg)组
与溶媒+戊巴比妥钠组比较，**P＜0.01
七、结论
在本实验条件下，小鼠口服蛇床子素10、20、40mg/kg对戊巴比妥钠的催眠作用无明显协同或拮抗效应，提示小鼠口服蛇床子素10～40mg/kg对中枢神经无抑制或兴奋作用。
试验4：
口服蛇床子素对小鼠爬杆协调运动的影响
一、摘要
用爬杆法观察小鼠口服蛇床子素后协调运动的情况，结果表明，给小鼠灌服蛇床子素10、20、40mg/kg后，各组小鼠的爬杆时间和协调运动各评分等级出现的动物数，与溶媒对照组相比未见有明显差异，提示蛇床子素对协调运动无明显的不良影响。
二、试验目的
观察口服蛇床子素后对小鼠协调运动是否具有不良的影响。
三、受试药物
1.蛇床子素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030516，用0.5％吐温-80配制成0.1％、0.2％、0.4％混悬液，备用。
2.氯丙嗪注射液，2ml/支，250mg/mL，由上海禾丰制药有限公司提供，批准文号：沪卫药准字(1995)第010048号，生产批号：020801，用蒸馏水配成0.25％的溶液。
四、实验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重19.0±1.0g，苏州大学实验动物中心供应，清洁级，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。实验期间饲养室温度18±2℃。
五、实验方法
取昆明种小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。用一根光滑的金属棒，直径为1.5cm，棒长70cm，把小鼠放在垂直竖立棒的顶端，头向下，让它自然爬行。小鼠禁食10小时后，分别灌胃给予蛇床子素10、20、40mg/kg，氯丙嗪25mg/kg和溶媒(0.5％吐温-80)，给药容积均为0.1ml/10g体重，正常对照组给予相应体积的蒸馏水，分别记录给药前，给药后30、90分钟小鼠在杆上爬行3次所用的时间，同时观察小鼠爬行时的运动状态，按下列标准判断协调运动障碍情况，并给予评分，0级：一步一步向下爬行；1级：向下滑行；2级：不能抓住棒；3级：翻正反射消失。在0～3级间又设0.5级、1.5级和2.5级。爬杆时间结果用 x±SD表示，评分等级结果用相应等级出现的动物数表示，然后分别进行统计学处理。
六、实验结果
由表6和表7可知，小鼠口服蛇床子素10、20和40mg/kg后，其爬杆时间和各评分等级出现的动物数与溶媒对照组相比较未见有明显差异，提示蛇床子素对协调运动无明显的影响。
表6 小鼠口服蛇床子素后对爬杆时间的影响( x±SD，n＝10) 组别 爬杆时间(秒) 给药前 给药后30min 给药后90min 正常对照组 33.2±11.1 29.7±12.6 35.3±22.7 溶媒对照组 30.7±7.9 35.3±9.8 45.0±25.78 蛇床子素10mg/kg组 30.0±14.9 26.2±12.4 28.4±12.5 蛇床子素20mg/kg组 30.1±7.2 30.1±10.7 43.0±20.4 蛇床子素40mg/kg组 25.7±4.4 33.4±14.5 40.5±31.1 氯丙嗪25mg/kg组 30.6±7.4 不能抓住棒 不能抓住棒
表7 小鼠口服蛇床子素后爬杆协调运动试验评分结果(n＝10) 组别 评分等级(出现例数) 0级 0.5级 1级 1.5级 2级 2.5级 3级 正常对照组药前药后30分钟药后90分钟 4 8 5 6 2 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶媒对照组药前药后30分钟药后90分钟 3 5 7 7 5 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蛇床子素10mg/kg组药前药后30分钟药后90分钟 6 8 7 4 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蛇床子素20mg/kg组药前药后30分钟药后90分钟 4 6 5 6 4 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蛇床子素40mg/kg组药前药后30分钟药后90分钟 4 5 5 6 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 氯丙嗪25mg/kg组药前药后30分钟药后90分钟 3 0 0 7 0 0 0 0 1 0 0 0 0 10 9 0 0 0 0 0 0
注：协调运动障碍的标准可分为0级：一步一步向下爬行；1级：向下滑行；2级：不能抓住棒；3级：翻正反射消失。在0～3级间又设0.5级、1.5级和2.5级。正常动物平均级数为0～0.3级。
七、结论
在本实验条件下，小鼠口服蛇床子素10～40mg/kg后，对协调运动无明显的不良影响。
本试验方法符合.徐叔云，卞如濂，陈修主编：药理实验方法学(第一版)，人民卫生出版社，1985年，第470页。
试验5：
蛇床子素预防大鼠骨质疏松的实验研究
(一)、摘要
本实验研究蛇床子素对大鼠骨质疏松形成的影响。大鼠去卵巢后，连续口服蛇床子素5，10，20mg/kg 12周，检测大鼠体重、子宫重量、血清钙、磷、碱性磷酸酶、羟脯氨酸/肌酐、E2、CT、TGF-β、BGP，股骨骨密度、骨组织形态等指标，并与模型组和阳性对照药物尼尔雌醇组比较。结果显示：蛇床子素组大鼠体重与模型组相比无显著差异，但子宫重量和子宫/体重比值有一定的降低。大鼠给予蛇床子素后，血清钙含量明显增加，血清磷含量下降，血清碱性磷酸酶有增加趋势，羟脯氨酸/肌酐有降低趋势，血清CT和TGF-β升高，E2小剂量时下降，中、大剂量时升高，血清BGP随剂量的增大逐步升高。蛇床子素组大鼠股骨骨密度和骨小梁面积百分比均较模型组明显增加，股骨骨组织形态较模型组明显得到改善，逐渐接近假手术组。这些实验结果表明蛇床子素可预防去势大鼠骨质疏松的形成。
(二)、实验目的
观察去势大鼠口服蛇床子素对骨质疏松形成的影响。
(三)、受试药物
1、蛇床子素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030516，用0.2％吐温-80配制成0.05％、0.1％、0.2％混悬液，备用。
2、尼尔雌醇，上海华联制药有限公司生产，批准文号：沪卫药准字(1995)第012090号，生产批号：030801。取一粒药片5mg，充分研细，50ml 0.2％吐温-80溶解，备用。
(四)、试剂
1、大鼠转化生长因子(TGF-β)EIA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司进口分装，批号：040418。
2、清骨钙素(BGP)，降钙素(CT)放射免疫测定试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所提供，批号：20040423。
3、雌二醇(E2)放射免疫测定试剂盒，天津德普生物技术和医学产品有限公司提供，批号：20040420。
4、羟脯氨酸测定试剂盒(抽提法)，南京建成工程研究所提供，批号：040310。
(五)、仪器设备
1、美国德灵Dimension RXL全自动生化分析仪。
2、美国GE LUNAR DPXIQ双能X线骨密度仪，小动物分析软件。
3、放射免疫分析仪，上海原子核研究所制造。
(六)、动物
SD大鼠60只，雌性，体重234±20g，清洁级，苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。
(七)、实验方法
取雌性大鼠50只，在实验室适应性饲养7天后，10％水合氯醛0.3ml/100g体重腹腔内注射麻醉，俯卧位固定，在背部中1/3处剪毛，碘酒、酒精局部消毒皮肤，沿背部腰椎正中线向下做一长约2～3厘米的切口，切开皮肤，将皮肤先牵向一侧，切开筋膜，钝性分离肌肉，进入腹膜后，在子宫角上用线结扎输卵管，切断输卵管，提起卵巢(呈深粉红色颗粒状)，丝线扎其周围相连组织，切除卵巢，缝合腹膜切口。用同样方法操作对侧，缝合皮肤切口。大鼠制成去势模型后随机分成5组，即模型组、尼尔雌醇1mg/kg组、蛇床子素5mg/kg组、蛇床子素10mg/kg组、蛇床子素20mg/kg组。另取10只雌性大鼠，手术方法同上，但不切断输卵管，不切除卵巢，仅摘除相当于卵巢大小的肠系膜作为假手术组。每只大鼠术后连续3天肌肉注射青霉素10万u，预防创口感染。
造模7天后，蛇床子素组大鼠每天上午8:00～9:00灌胃给药，给药体积为1ml/100g体重，而尼尔雌醇组每周给药一次，模型组和假手术组则每天给予等体积的0.2％吐温-80。连续给药12周后，10％水合氯醛0.3ml/100g体重麻醉，腹主动脉取血，完整取下子宫进行称重，并将子宫用10％甲醛溶液固定，常规组织切片，HE染色，病理形态观察。分离双侧股骨，去除肌肉。右侧股骨测定骨密度，左侧股骨用10％甲醛溶液固定，常规脱钙、包埋、制成5mm厚的组织切片，HE染色，病理形态学观察并摄片。
大鼠血清经离心分离后，取上层血清按试剂盒方法测定TGF-β、BGP、CT、E2、羟脯氨酸，全自动生化分析仪测定血清钙、磷、碱性磷酸酶和肌酐。
(八)、实验结果
1、蛇床子素对去势大鼠体重及子宫重量的影响
模型组大鼠体重与假手术组相比明显增加(P＜0.01)，而子宫重量、子宫/体重均较假手术组低(P＜0.01)，蛇床子素各剂量组大鼠体重与模型组相比无显著差异(P＞0.05)，但子宫重量和子宫/体重比值有一定的降低，尤其是蛇床子素10mg/kg组的作用较为明显，与模型组相比P＜0.01。子宫病理切片显示，蛇床子素各剂量组子宫内膜腺体数目与模型组无差异，说明蛇床子素对去势大鼠子宫内膜无明显的雌激素样影响，结果见图12、图13、图14、图15、图16、图17。尼尔雌醇组体重、子宫重、子宫/体重均与假手术组接近，与模型组有显著差异(P＜0.01)。结果见表8。
表8 蛇床子素对去势大鼠体重和子宫重量的影响(n＝10， x±s)组别假手术组模型组蛇床子素1组蛇床子素2组蛇床子素3组尼尔雌醇组剂量(mg/kg) 5 10 20 1 体重(g) 252±25 328±34▲▲ 330±35 308±35 326±32 260±23** 子宫重(g) 0.439±0.109 0.136±0.026▲▲ 0.103 ±0.036 0.092±0.012** 0.120±0.027 0.368 ±0.076**子宫/体重0.00175±0.000460.00042±0.00009▲▲0.00031±0.000100.00030±0.00005**0.00037±0.000080.00142±0.00032**
注：与假手术组相比，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
1、蛇床子素对去势大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶、羟脯氨酸/肌酐的影响
模型组大鼠血清钙比假手术组明显降低(P＜0.01)，而血清磷略有升高，给予一定剂量的蛇床子素后血清钙含量明显增加，血清磷含量下降，其结果基本与阳性对照尼尔雌醇组相似。大鼠血清碱性磷酸酶、羟脯氨酸/肌酐在各组动物之间虽均无显著差异(P＞0.05)，但给予蛇床子素后，碱性磷酸酶有增加趋势，羟脯氨酸/肌酐有降低趋势。这些结果均提示蛇床子素具有一定的抑制骨吸收，促进成骨的作用。结果见表9。
表9 蛇床子素对去势大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶、羟脯氨酸/肌酐的影响(n＝10， x±s)组别假手术组模型组剂量(mg/kg) 钙(mmol/L) 2.47±0.06 2.31±0.08▲▲ 磷(mmol/L) 1.87±0.23 2.16±0.30 碱性磷酸酶(U/L) 58.3±9.9 64.8±16.5 羟脯氨酸/肌酐 0.058±0.013 0.070±0.014蛇床子素1组蛇床子素2组蛇床子素3组尼尔雌醇组 5 10 20 1 2.42±0.06* 2.30±0.14 2.45±0.07** 2.49±0.07** 2.09±0.17 1.83±0.21* 1.91±0.15 2.05±0.19 69.7±11.5 68.4±16.3 62.3±10.0 56.6±11.2 0.064±0.011 0.061±0.007 0.069±0.013 0.071±0.012
注：与假手术组相比，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
3、蛇床子素对去势大鼠血清E2、CT、TGF-β、BGP的影响
模型组大鼠血清E2、CT、TGF-β均显著低于假手术组(P＜0.05或P＜0.01)，口服蛇床子素后CT和TGF-β回升，尤其是TGF-β呈明显的剂量依赖性。蛇床子素在小剂量(5mg/kg)时，血清E2水平较低，而在中剂量(10mg/kg)以上时则血清E2水平较高，结合子宫重量和病理学的变化，提示蛇床子素的雌激素样作用较弱，在较高剂量时相反可能具有一定的抗雌激素样作用。模型组血清BGP较假手术组高(P＜0.01)，给予蛇床子素后，血清BGP随剂量的增大进一步升高，蛇床子素20mg/kg组血清BGP明显高于模型组(P＜0.05)，而尼尔雌醇组血清BGP明显低于模型组(P＜0.01)，说明去势大鼠给予蛇床子素后，成骨细胞活性明显增强。结果见表l0。
表10 蛇床子素对去势大鼠血清E2、CT、TGF-β、BGP的影响(n＝l0， x±s)组别假手术组模型组蛇床子素l组蛇床子素2组蛇床子素3组尼尔雌醇组剂量(mg/kg) 5 10 20 1E2(pg/ml)21.8±10.59.7±3.2▲▲4.1±2.2**16.5±9.2*12.1±6.711.4±5.2CT(ng/L)552±237276±115▲479±178**414±93**438±104*436±125*TGF-β(pg/ml)26309±488312746±3979▲▲13856±698717081±742819906±5594**21745±4618**BGP(ng/ml)0.119±0.0860.341±0.149▲▲0.411±0.2040.427±0.1320.584±0.211*0.128±0.094**
注：与假手术组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
4、蛇床子素对去势大鼠骨密度的影响
模型组大鼠股骨近端干骺端骨密度较假手术组明显降低(P＜0.01)，给予不同剂量蛇床子素后骨密度逐步升高，蛇床子素20mg/kg组与阳性对照尼尔雌醇组相比作用基本相似，说明蛇床子素能够防止去卵巢大鼠骨密度下降。结果见表11。
表11 蛇床子素对去势大鼠股骨近端干骺端骨密度的影响(n＝10， x±s)组别假手术组模型组蛇床子素1组 剂量(mg/kg) 5 骨密度(g/cm2) 0.084±0.022 0.057±0.016▲▲ 0.084±0.023*蛇床子素2组蛇床子素3组尼尔雌醇组 10 20 1 0.088±0.017** 0.107±0.028** 0.112±0.019**
注：与假手术组相比，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
1.蛇床子素对去势大鼠骨组织形态的影响
大鼠股骨近端干骺端病理切片光镜检查可见假手术组骨小梁多，较粗，相互连接成网，髓腔较小。模型组大鼠股骨骨小梁明显减少，变细，大部分不能连接成网，髓腔较大。给予蛇床子素后，骨小梁明显增多，增粗，呈网状，髓腔变小。总香豆素组大鼠股骨骨小梁较多，较粗，且连接成网。尼尔雌醇组与假手术组的形态学表现基本相似。结果见图18、图19、图20、图21、图22、图23。骨组织形态经计算机图像分析软件Sigmascan Pro 5.0分析，模型组大鼠股骨近端干骺端骨小梁面积百分率(骨小梁面积/视野面积)明显低于假手术组(P＜0.01)，给予蛇床子素后可明显增加骨小梁面积百分率，与模型组相比明显增加(P＜0.05)，与阳性对照尼尔雌醇组结果相似。说明蛇床子素对去势大鼠股骨骨小梁具有明显的增多、增粗作用。结果见表12。
表12 蛇床子素对去势大鼠股骨近端干骺端骨小梁面积百分比的影响(n＝10， x±s)组别假手术组模型组蛇床子素1组蛇床子素2组蛇床子素3组尼尔雌醇组 剂量(mg/kg) 5 10 20 1 骨小梁面积百分比(％) 52.9±2.8 41.0±5.8▲▲ 48.9±7.6* 50.6±7.5* 49.2±5.6* 50.9±4.3**
注：与假手术组相比，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
(九)、结论
去势大鼠连续服用蛇床子素5~20mg/kg 12周后，可明显预防其骨质疏松的发生。
本试验方法符合：陈东，王连唐，陈国栋。去卵巢后大鼠不同部位的骨组织计量学与骨密度研究。中国骨质疏松杂志，2002，8(3)：208
附图说明：图1是蛇床子素分子结构式。
图2是核磁共振图谱。
图3是核磁共振图谱。
图4是高纯度蛇床子素(Osthol≥90％)高效液相色谱仪图示。
图5是表4即抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动轨迹面积的影响。
图6是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的正常对照图组；
图7是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的溶媒对照图组；
图8是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的蛇床子素10mg/kg图组；
图9是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的蛇床子素20mg/kg图组；
图10是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的蛇床子素40mg/kg图组；
图11是抖笼法测定小鼠口服蛇床子素后对自发活动的张力电信号图的安定1mg/kg图组；
图12假手术组子宫切片图，HE染色×200
图13模型组子宫切片图，HE染色×200
图14蛇床子素5mg/kg组子宫切片，HE染色×200
图15蛇床子素10mg/kg组子宫切片，HE染色×200
图16蛇床子素20mg/kg组子宫切片，HE染色×200
图17尼尔雌醇组子宫切片，HE染色×200
图18假手术组大鼠股骨近端干骺端组织切片，可见正常的骨小梁和髓腔。HE染色×100
图19模型组大鼠股骨近端干骺端组织切片，可见骨小梁明显减少、变细，大部分不能连接成网状，髓腔明显增大。HE染色×100
图20蛇床子素5mg/kg组大鼠股骨近端干骺端组织切片，可见骨小梁粗于模型组，但可连接成网，髓腔较大。HE染色×100
图21蛇床子素10mg/kg组大鼠股骨近端干骺端组织切片，可见骨小梁明显增粗，连接成网，髓腔较模型组小。HE染色×100
图22蛇床子素20mg/kg组大鼠股骨近端干骺端组织切片，可见骨小梁明显增粗，连接成网，髓腔较小。HE染色×100
图23尼尔雌醇组大鼠股骨切片，可见骨小梁增粗，连接成网与假手术组基本相似。HE染色×100
具体实施方式：
实施例中的蛇床子素提纯生产制备过程见专利申请号03134435.6，它是将蛇床子原料用醇回流提取、浓缩、水清洗、碱水清洗、醇溶解、活性炭脱色、醇水结晶、干燥，所得产品纯度可以达到90％以上。也可以用其它方法提取高纯度蛇床子素。
实施例1，取纯度可以达到90％以上的高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)，按25mg-200mg为一个剂量单位，经过粉碎，制成防治骨质疏松症的制剂。这种制剂可以是普通片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂。
实施例2，取高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)，按重量计80％，再添加20％的淫羊藿甙，经过粉碎，混合，制成防治骨质疏松症的制剂。这种制剂可以是普通片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂。
实施案例3，取高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)，按重量计60％再添加40％的染料木素，经过粉碎，混合，制成防治骨质疏松症的制剂。这种制剂可以是普通片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂。
实施例4，取高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)，按重量计50％再添加35％的染料木素和15％的淫羊藿甙，经过粉碎，混合，制成防治骨质疏松症的制剂。这种制剂可以是普通片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂。
实施例5，取高纯度蛇床子素(欧芹酚甲醚，Osthol≥90％)，按重量计30％、淫羊藿甙15％，大豆素12％、大豆甙10％、染料木甙10％、染料木素10％、钙剂13％，经过粉碎、混合，制成防治骨质疏松症的制剂。
试验6蛇床子素和淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合应用预防大鼠骨质疏松的实验研究。
本实验研究蛇床子素和淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合应用对大鼠骨质疏松形成的影响。大鼠去卵巢后，连续口服蛇床子素和淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮复合物12周，检测大鼠股骨骨密度、骨组织形态等指标，并与模型组和阳性对照药物尼尔雌醇组比较。结果显示：蛇床子素和淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合用药后，各组大鼠股骨骨密度均较模型组明显增加，股骨骨组织形态较模型组明显得到改善，接近假手术组。这些实验结果表明蛇床子素与淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合用药可预防去势大鼠骨质疏松的形成。
一、实验目的
观察去势大鼠口服蛇床子素和淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合用药对骨质疏松形成的影响。
二、试药物
1.蛇床子素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030516
2.淫羊藿，纯度为30％，由西安绿泉生物技术有限公司提供，批号：030722
3.染料木素，纯度为95％，由西安绿泉生物技术有限公司提供批号：030706
4.大豆异黄酮，纯度为40％，由西安绿泉生物技术有限公司提供批号：030412
5.尼尔雌醇，上海华联制药有限公司生产，批准文号：沪卫药准字(1995)第012090号，生产批号：030801。取一粒药片5mg，充分研细，50ml 0.2％吐温-80溶解，备用。
三、仪器设备
美国GE LUNAR DPXIQ双能X线骨密度仪，小动物分析软件。
四、实验动物
SD大鼠60只，雌性，体重234±20g，清洁级，苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。
五、实验方法
取雌性大鼠50只，在实验室适应性饲养7天后，10％水合氯醛0.3ml/100g体重腹腔内注射麻醉，俯卧位固定，在背部中1/3处剪毛，碘酒、酒精局部消毒皮肤，沿背部腰椎正中线向下做一长约2～3厘米的切口，切开皮肤，将皮肤先牵向一侧，切开筋膜，钝性分离肌肉，进入腹膜后，在子宫角上用线结扎输卵管，切断输卵管，提起卵巢(呈深粉红色颗粒状)，丝线扎其周围相连组织，切除卵巢，缝合腹膜切口。用同样方法操作对侧，缝合皮肤切口。大鼠制成去势模型后随机分成5组，即模型组、尼尔雌醇1mg/kg组、蛇床子素5mg/kg加淫羊藿4mg/kg组、蛇床子素5mg/kg加染料木素3.5mg/kg组、蛇床子素5mg/kg加大豆异黄酮5mg/kg组。另取10只雌性大鼠，手术方法同上，但不切断输卵管，不切除卵巢，仅摘除相当于卵巢大小的肠系膜作为假手术组。每只大鼠术后连续3天肌肉注射青霉素10万u，预防创口感染。
造模7天后，蛇床子素组大鼠每天上午8:00～9:00灌胃给药，给药体积为1ml/100g体重，而尼尔雌醇组每周给药一次，模型组和假手术组则每天给予等体积的0.2％吐温-80。连续给药12周后，10％水合氯醛0.3ml/100g体重麻醉，分离双侧股骨，去除肌肉。右侧股骨测定骨密度，左侧股骨用10％甲醛溶液固定，常规脱钙、包埋、制成5mm厚的组织切片，HE染色，病理形态学观察并摄片。
六、实验结果
蛇床子素对去势大鼠骨密度的影响
模型组大鼠股骨近端干骺端骨密度较假手术组明显降低(P＜0.01)，各组蛇床子素联合用药后骨密度均有升高，说明蛇床子素联合用药能够防止去卵巢大鼠骨密度下降。结果见表13。
表13 蛇床子素对去势大鼠股骨近端干骺端骨密度的影响(n＝10， x±s)
蛇床子素剂 联合用药剂量
组别 骨密度(g/cm2)
量(mg/kg) (mg/kg)
假手术组 0.084±0.022
模型组 0.057±0.016▲▲
蛇床子素加淫羊藿组 5 4 0.094±0.021**
蛇床子素加染料木素组 5 3.5 0.108±0.024**
蛇床子素加大豆异黄酮组 5 5 0.097±0.019**
尼尔雌醇组 1 0.112±0.019**
注：与假手术组相比，▲▲P＜0.01；与模型组相比，**P＜0.01
七、结论
去势大鼠连续服用蛇床子素与淫羊藿、染料木素、大豆异黄酮联合用药12周后，可明显预防去势大鼠骨质疏松的形成。