治疗糖尿病的楤木提取物及楤木皂苷 在治疗糖尿病中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种新的治疗糖尿病的药物。具体的说，本发明涉及治疗糖尿病的含有楤木皂苷A和C等的植物提取物在，以及楤木皂苷A和C在治疗糖尿病中的应用。
背景技术
消渴病(糖尿病)在世界范围内仍是一种未被征服的顽症，据不完全统计，在全世界发病率占3-5％，50岁以上的中老年人发病率占5-7％，我国就有2700多万患者。目前由糖尿病及其并发症导致伤残和死亡的人数仅决于心血管病和肿瘤病，占第三位。糖尿病病因的中心环节是由于胰岛素分泌相对不足，引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，并继发维生素、水、电解质代谢障碍。主要临床表现为“三多一少”(即多饮、多食、多尿、体重减少)，体力减退，并有头晕、失眼多梦、周身不适等症状，并易引发严重的并发症，如心脑血管病、高血压、肾病、糖尿病眼病、肢体坏疽、神经病变等，严重者可导致死亡。
1995年，原国家医药局医药经济信息中心站对全国28个主要城市共28家中西医医院、医药批发公司(站)进行了口服糖尿病用药的市场调查：目前市场占有率较高的西药品种为优降糖(格列本脲，glybenclamide)、降糖灵(苯乙双胍，phenformine)、格列齐特等。中药品种主要有消渴丸(中西结合方)、降糖丹、天安糖泰、玉泉丸、金芪降糖片和新产品糖脉康等。
上述这些中西药为防治糖尿病起到了重大作用，但这份调查报告中也指出，长期口服西药仅是对症的治疗，且易引起高胰岛素血糖、低血糖、肥胖症、恶心、头痛等毒副作用。中药品种绝大多数为大的复方制剂，质量难以控制，并且具有直接降糖作用的极少。从中药或天然产物中提取有效部位，研制开发符合国内外市场需要的现代地中药，既能达到“安全、有效”，质量上又可“稳定、可控”，是目前急需解决的课题之一。
辽东楤木(龙牙楤木)(Aralia elata(Miq.)Seem)，又名刺老牙、刺老鸦、虎牙刺等，是五加科楤木属植物，为黑龙江、吉林、辽宁等省民间所食用之野菜。《中药大辞典》第1268页载本品功用“补气安神，强精滋肾，祛风活血。治神经衰弱、风湿性关节炎、糖尿病以及阳虚气弱、肾阳不足等证。”但是并没有对此作出详细说明。
五十年代初，自楤木中分得皂苷类成分。苏联、波兰、日本及我国等通过药理实验证明皂苷类化合物是其主要有效成分。前苏联以楤木根生产出了楤木浸剂、胶囊剂，后来又生产出楤木皂苷A、B和C的总铵盐制剂，用作中枢神经系统的兴奋剂，治疗脑力和体力的疲劳过度等，发现其具有适应原样作用。
在对皂苷的研究中，各国学者先后研究分得数十种特有皂苷，分别称为Aralosides、Elatosides、Tarasaponin、Congmunosides等。这些化合物均显示皂苷反应，其苷元结构主要为齐墩果烷类五环三萜如齐墩果酸等。其中主要成分为楤木皂苷(Araloside)A、B、C等，都是最早从楤木中提取出的。其中楤木皂苷A和C的结构分别如下。但是上述皂苷对于糖尿病的治疗活性从未被报道过。
楤木皂苷A 楤木皂苷C
1994、1995年，日本人吉川(Yoshikawa)等报道，自日本产的龙牙楤木中分离得到的Elatoside类化合物(Elatoside A、C、E、F、G～K等)，其中Elatoside E、G、H、I、K具有降血糖作用(Chem.Pharm.Bull.1994，42，1354-1356；ibid，1995，43，1878-1882)。但是这些化合物均为自龙牙楤木以甲醇或醇-水提取得到，其含量甚微，其中Elatoside C、E、F略高于万分之一，其它均不足万分之一。与龙牙楤木(辽东楤木)中5％乃至20％以上的总皂苷含量相去甚远(中药通报，1986，11，428-430)。
对于楤木类的皂苷等的提取方法，以往公开的多是以甲醇、乙醇等醇或者含少量水的醇提取并分离的，如上述吉川等(Chem.Pharm.Bull.43，1878-1882，1995)，沈阳药学院学报(1991，8，265-268)，Phytochemistry(2001，56，491-497)等。
方乍浦等(植物学报，1992，34，461-465)虽然采用了水提取黄毛楤木的方法制得了黄毛楤木皂苷，但是并未有收率、含量等的数据。
CN1355171A，虽然给出了用水提取龙牙楤木总皂苷的方法，但是并未有主要成分含量等的数据，也没有主要成分含量的内容，而且该发明提取的总皂苷是用于治疗心、脑血管疾病的，是否可以用于治疗糖尿病也属未知。
另外，以往报道楤木有小毒(《中药大辞典》，2583，上海人民出版社，1977年)，但是迄今为止并无降低毒性的方法，也不知道毒性的来源。
【发明内容】
本发明人等在长期从事辽东楤木(龙牙楤木)等的研究中，意外地发现楤木水提皂苷类成分具有很强的降血糖作用，在此基础上经反复深入研究，完成了本发明。
本发明具有以下内容：
本发明第1方面涉及一种治疗糖尿病的楤木提取物，其特征在于该提取物是以水提取而得到的，其中总皂苷含量在50％以上，且楤木皂苷A和C的总含量在10％以上。
本发明的提取物，优选总皂苷含量在60％以上，不多于90％，更优选不超过80％。
本发明的提取物中，楤木皂苷A和C的合计含量优选在15％以上，更优选不少于20％。
本发明的楤木提取物优选不含有无梗五加苷D。
本发明第2方面涉及楤木皂苷A和/或C的制备治疗糖尿病药物的应用。
本发明第3方面涉及采用含有楤木皂苷A和/或C的组合物治疗糖尿病的方法。
本发明第4方面涉及一种治疗糖尿病的楤木提取物的制备方法，其特征在于包括用水提取楤木活性成分，之后将所得提取物用醇沉淀，将所得滤液通过大孔吸附树脂吸附，然后用醇洗脱、并用吸附剂脱色等步骤。
本发明第5方面还涉及降低楤木提取物毒性的方法，其特征在于在获得以皂苷为主要成分的楤木提取物后，用吸附剂进行脱色，同时脱去造成毒性的无梗五加苷D。
本发明的其他实施方式和优良效果，从以下的具体叙述中可以了解。
附图简要说明
图1是楤木皂苷A的HPLC色谱图。
图2是楤木皂苷C的HPLC色谱图。
图3是制备实施例1所得的提取物的薄层色谱图。
图4是制备实施例4所得的各提取物的薄层色谱图。
【具体实施方式】
以下叙述中，若非特别注明，百分含量均指重量(质量)百分含量。
一、关于楤木
本发明中所述的楤木是指双子叶植物纲五加科楤木属的植物，例如辽东楤木Aralia elata(Miq.)Seem或称龙牙楤木A.mandshuriaRupr.、楤木A.chinensis L.、黄毛楤木A.decaisneana Hance、虎阳刺楤木A.armata(Wall)Seem、长刺楤木A.spinfolia Merr.、远东楤木A.schmidtii、长白楤木A.continentalis Kitagawa、多刺楤木A.spinosa L.、太白楤木A.taibaiensis Z.Z.Wang et H.C.Zheng等。其中从分布广泛，活性成分含量高等方面，优选辽东楤木Araliaelata(Miq.)Seem即龙牙楤木A.mandshuria Rupr.，以下内容中，若非特别指出，所说楤木就是指上述楤木属植物，特别是辽东楤木Aralia elata(Miq.)Seem。本发明的治疗糖尿病的楤木提取物就是主要从辽东楤木Aralia elata(Miq.)Seem的根皮或树皮提取分离得到的，当然只要能获得本发明所述的治疗糖尿病的效果，也可以从楤木的芽、叶或木质部分等部位进行提取，本发明中对此不进行限制。
经本发明人对上述植物的各种提取物的研究，现发现特定的提取物以及单体楤木皂苷A和C具有抗糖尿病的活性。在这些具有抗糖尿病活性的提取物中，总皂苷含量总在50％以上，且其中楤木皂苷A和C的含量在10％以上。通过我们的研究也首次发现，单体楤木皂苷A或C等也具有抗糖尿病活性。
本发明的楤木提取物中，总皂苷量应该在50％以上，优选60％以上，更优选75％以上，最优选85％以上。楤木提取物中总皂苷的含量上限没有特别限制，在50％～100％的范围内均具有抗糖尿病活性。从工艺路线的选择和成本方面考虑，总皂苷的含量在60％以上即可较好的实现本发明的目的，如果把总皂苷的量提高到90％以上，不仅原料的成本要上升，而且还要增加额外的处理工序，因此总皂苷的含量最优选在50％～90％的范围内。
在本发明的提取物中，楤木皂苷A和C的合计含量应不少于10％，优选不少于15％，更优选不少于20％，由于提取工艺的限制以及出于化合物协同作用的考虑，楤木皂苷A、C的和为以不超过50％为宜。
我们提取了楤木的含楤木皂苷A和C的提取物(如上述所定义的)。通过后文实验及临床研究表明，根据本发明方法制备的楤木提取物确有较好的抗糖尿病效果。
对于楤木提取物的毒性成分，通过我们的研究，发现主要源于其中所含的无梗五加苷D。在小鼠灌胃给药的急性毒性实验中，无梗五加苷D的半数致死量LD50为11.45mg/kg，而去除该成分的本发明提取物的半数致死量LD50达到1028mg/kg，属于实际无毒的范围。虽然无梗五加苷D并不影响楤木皂苷的活性，但是由于抗糖尿病的药物通常需要长期服用，因此最好从提取物中除去。本发明的楤木提取物优选不含有无梗五加苷D。
在此，所谓“不含有”并不是指绝对的不含有，而是指仅有生理学上无显著意义量以下的含量。在此基础上虽然越少越好，但是通常只要低于0.01％就可以基本实现本发明的目的了。
以下讨论本发明楤木提取物的制备方法。
本发明楤木提取物的典型制备方法包含如下步骤：
〔药材粉碎→〕水煎煮→(醇沉淀/过滤)→树脂吸附→(水洗→)醇/水洗脱→后处理
上述方法中，药材的粉碎是本领域技术人员所熟知的常规步骤。对于粉碎的方法，本发明不加限制。粉碎后的粉末，如果粒度过粗，则有效成分难以充分提出；如果粉末过细，则会给煎煮后的分离提取液的步骤带来不利，对此，本领域技术人员可以根据实际经验加以选择，对此也不做限制。
在中药提取中，为了提取出有效成分，可以采用水和/或醇浸润提取的方式，但是由于有效成分的浸出不容易完全，所以采用加热抽提的方式。加热温度为室温-抽提溶剂的沸点。本发明中，为了避免不需要的杂质，优选水提取。
加热提取时，优选在水(或含水溶剂)的沸点进行(回流)。
如单纯用水时，优选在常压或加压下进行提取，从成本角度看优选常压提取。加压提取可以减少提取时间，因此也可以采用。本申请对此不作限制。
常压提取下，总提取时间为2-24小时，提取次数1-4次，每次提取加入的水量为生药量的2-20倍。如果用醇或醇水溶液回流提取，则用量为生药量的5-30倍，上述数据仅作为参考，实际中根据需要，本领域技术人员可以根据经验进行适当变动，应予理解，这种变化不超过本发明的范围。
获得提取液以后，根据需要可以对提取液进行减压浓缩等以缩小体积，或者再加以过滤(例如用超滤膜等)或者用醇沉淀，以除去不需要的淀粉、粘液、蛋白质等。此种操作属于本领域技术人员在提取中药过程中的常规操作，对此不加限制。例如可以加醇到40％～80％(v/v)左右进行沉淀等，也可以根据和沉淀效果溶剂回收情况进行确定。
然后把提取液用树脂吸附。可以用来吸附的树脂是弱极性的大孔吸附树脂，例如D-101、D-201、D-301树脂等(沧州市宝恩化工有限公司)、AB-8树脂(天津骨胶厂)、WLD树脂(四川省中药研究所)、CAD-40(华北制药厂)等，但本发明方法并不受上述树脂柱型号的限制，只要是弱极性的大孔吸附树脂，即可以完成本发明方法。对于树脂吸附的方法参见CN1072089A、WO02053164A等，上述文献中对树脂吸附方法进行了详细的描述，本申请引用了文献中公开的方法，并作为本发明方法的一部分，记载在本申请文件中。
根据本发明人的研究结果，在提取本发明的楤木提取物的时候，这几种树脂中以D-101树脂吸附容量最大，洗脱也更容易。故本提取方法优选D-101型吸附树脂为吸附剂。原药材提取液与吸附树脂的比例，视提取液的浓度而变，可以在0.3～2∶1(体积)之间适当选择，优选0.6～1.6∶1，最优选1∶1左右，本领域技术人员可以根据经验适当选择。如果比例小于0.3∶1，则可能吸附不完全，如果大于2∶1，则因为吸附的皂苷量不再增加，会浪费树脂，不利于成本控制。
在使用吸附树脂的时候，根据本领域技术人员熟悉的常识，树脂应该先进行预处理然后才能使用，预处理可以采用已知方法进行，例如可以按如下方法操作：
将树脂装柱，用95％乙醇冲洗，洗至流出液用2倍量水稀释时，不显浑浊后，再用水冲洗流出液无醇味，然后将药液上柱。
以上说明仅为示例性质，具体应根据所使用的吸附树脂的说明进行。
吸附时当然须控制提取液的流速，才能保证吸附完全和保证适当的速度。对于适当吸附速度的选择属于本领域的常规操作，在此不作限制。例如，在20mL树脂的情况下，吸附流速在0.5～10ml/分左右都可以比较好的实现本发明的目的。高于或低于此值将降低分离效率或者造成收率的损失。本领域技术人员可以根据实际情况加以决定。
上柱后洗脱所用的醇可以是低级醇如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等。从健康角度看优选乙醇，采用乙醇洗脱时，浓度为30-80％(v/v)左右，优选40-70％(v/v)。从乙醇可以回收利用的角度来看，最好50～70％(v/v)(因实际条件而变，也可以±5％)左右。
用醇洗脱后，收集洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后再浓缩，最后，经喷雾干燥或冷冻干燥或直接干燥后粉碎，得到本发明的楤木提取物的粉末，所得粉末可以进一步精制，或直接制成适当的剂型，例如，胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、溶液剂或注射剂等。
另外，洗脱液也可以经过脱色后再制成粉末。脱色可以采用氧化铝、氧化镁、硅藻土、活性炭、分子筛、碳酸钙等或者它们的组合进行。脱色时，可以采用常规脱色工艺，即将适量脱色剂加入洗脱液中，回流，之后放冷、过滤，以后按照上述方法制成粉末。
本发明人发现，通过脱色可以出乎意料的同时降低无梗五加苷D在提取物中的含量，就是说脱色可同时去除无梗五加苷D，降低楤木提取物的毒性。在CN1355171A和CN1355172A中没有提到对楤木提取物进行脱色的步骤，因此本发明也提供了对楤木提取物降低毒性的方法。
在脱色过程中的脱色剂优选氧化镁、氧化铝、碳酸钙、明胶、分子筛、活性炭、硅藻土等中的一种或多种的组合。特别优选氧化镁或者含有氧化镁的脱色剂组合，如氧化镁-活性炭、氧化镁-氧化铝、氧化镁-硅藻土等。组合使用时，氧化镁与另一组分的使用量比例可以根据情况适当调整，比如在20∶1～1∶20间进行调整。
如上所述本发明的提取物，可以按照常规的制剂工艺，制备成任何适用于临床使用的药物剂型，例如，胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂，溶液剂或注射剂等。其中各剂型所含提取物的量依据剂型组成、所治疗患者的状况、临床使用条件等而有所不同。由于糖尿病属于慢性疾病，因此优选各种口服剂型。大体来说，当提取物中总皂苷含量以50％计时，体重70公斤左右的患者可以每天给药0.1～10克(相当于原药材2～3克到2～300克左右)，分1～3次服用。由于本发明的提取物的原料楤木本身具有适应原样作用和滋补强壮作用等，因此用量适当加大也不会有明显的毒副作用。
动物实验表明，本发明的楤木提取物对四氧嘧啶、链脲霉素、外源性葡萄糖、肾上腺素所致的多种试验性高血糖动物模型均具有显著的降糖作用。同时楤木提取物还可以增加肝糖元的含量，增加血清胰岛素水平。
另外，初步临床试验表明，本发明的楤木提取物对中医诊断为气阴两虚证消渴病患者，总疗效63.33％，显效率43.33％；对于消渴病证候疗效，总疗效83.33％，愈显率56.67％。
以下举出制备实施例、制剂实施例和药理实验例具体说明本发明。但本发明不受以下实施例的任何限制。
制备实施例1
称取楤木药材粗粉1kg，粉碎。水24升，分3次煎煮提取，每次提取前可适当浸泡。每次时间分别为2小时、1小时40分、1小时。合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15。
在搅拌下加乙醇使含醇量达60％，放置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.20～1.25。将此浓缩滤液通过已处理完毕的大孔吸附树脂(D101型)柱(2kg)以进行吸附。水洗一个柱体积，再用10％乙醇洗脱一个柱体积，最后用60％乙醇洗脱树脂柱，使吸附于树脂柱上的皂苷被完全洗脱止，收集60％的洗脱液。
洗脱液中加入0.02kg脱色剂(MgO∶活性炭＝1∶1)，加热至70-80℃，回流30分钟，放冷，滤过。减压回收乙醇，真空干燥。得到浅黄白色的本发明的提取物45克。
按本实施例方法制取的楤木总皂苷产品：
收率：4.5％。
按比色法检测总皂苷含量
仪器：722型紫外-可见分光光度计
测定方法：取楤木皂苷C，用甲醇制成每1ml含2mg的溶液。精密吸取对照品溶液30μl，60μl，90μl，120μl，150μl，180μl，置于具塞试管中，挥去甲醇，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，于70度水浴加热20分钟，取出，冷却至室温后精密加入醋酸乙酯5ml，摇匀，以相应的试剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在595nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
本发明提取物约50mg，精密称取，置于具塞试管中，精密加入甲醇5ml，超声处理20分钟，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液25μl，置于具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥去甲醇”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液楤木皂苷C的量，计算，即得。
含量，以楤木皂苷C计，含总皂苷87％。
HPLC法检测楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和
色谱条件：
设备：PE-1022色谱工作站
色谱柱：C18(Dikmosil，250×4.6mm，5μm)
流动相：乙腈∶0.2％磷酸水溶液(32∶68)
柱温：30℃
检测波长：207nm。
按照面积归一化法测定，该产品含楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和25％。
楤木皂苷A、楤木皂苷C的高效液相(HPLC)色谱图见附图1和2。
本实施例的所得提取物的薄层色谱图见图3，展开系统为CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。从图中可见不含无梗五加苷D。
制备实施例2
除大孔吸附树脂分别改以D201树脂、AB-8树脂、WLD树脂、CAD-40树脂以外，按照上述制备实施例1同样方法进行提取，得到提取物。按照制备实施例1的方法测定总皂苷含量。树脂种类、树脂-提取液用量比(吸附量)、总皂苷含量、收率如表1所示。
表1 树脂 吸附量(v/v) 总苷(％) 收率(％) D201 1∶1 91.1 4.1 AB-8 1∶1 89.6 4.8 WLD 2∶1 84 3.8 CAD-40 2∶1 81 4.0
制备实施例3
除洗脱乙醇浓度分别为30、40、50、70％以外，按照上述制备实施例1同样方法进行提取，得到提取物。按照制备实施例1的方法测定总皂苷含量以及楤木皂苷A和C的含量。乙醇浓度、收率、总皂苷含量、楤木皂苷A和C的含量和如表2所示。
表2乙醇浓度(％)收率(％)总皂苷含量(％) A和C含量和(％) 30 2.1 51 6.9 40 2.5 62 12.4 50 3.6 78 15.1 70 5.1 80 14.2
制备实施例4
除脱色剂分别改为活性炭、氧化铝、活性炭+氧化铝、氧化镁、活性炭+氧化镁或者不进行脱色以外，按照上述制备实施例1同样方法进行提取，得到提取物。按照制备实施例1的方法测定总皂苷含量。脱色剂用量(相对于提取物)、总皂苷含量、所得提取物的性状和收率如下表3所示。
表3 脱色剂用量皂苷含量(％) 颜色 收率(％) 不脱色 71 棕色 5.6 活性炭(3％) 73 黄棕色 2.8 氧化铝(2％) 54 黄棕色 3.1 活性炭(2％)+氧化铝(2％) 58 浅黄棕色 2.9 氧化镁(2％) 62 浅黄棕色 5.1 活性炭(0.1％)+氧化镁(2％) 87 浅黄白色 4.2
本实施例的所得提取物的薄层色谱图见图4，其中1是未经脱色的，2是以活性炭为脱色剂的，3是氧化铝的，4是活性炭+氧化铝的，5是氧化镁的，6是活性炭+氧化镁的。展开系统为CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。从图中可见加入脱色剂后无梗五加苷D明显减少，尤其是采用含有氧化镁的脱色剂后效果更明显。
制剂实施例1胶囊剂
取制备实施例1方法得到的提取物35g，粉碎，过80目筛，依次加入过80目筛的微晶纤维素55g、可压性淀粉10g和适量淀粉，混匀，再过80目筛，装入2号胶囊，制成1000粒，即得。
制剂实施例2片剂
取按制备实施例1方法所得的提取物105g，以乙醇为粘和剂，一步法制粒。颗粒依次加入羧甲基纤维素钠220g、硬脂酸镁75g，混匀，压片，分装，制成1000片，即得。
药理实验例1
消渴病是以多尿、多饮、多食、形体消瘦、或尿有甜味为主要临床表现的病症。中老年糖尿病患者中，还多呈现气阴两虚之证。这类病人，由于年事已高，通常在服用西药降糖药后，会因血糖突然下降而感到头晕、乏力等症愈加明显。因此他们期有一种使血糖呈缓慢型下降的降糖药。以下实验例证明本发明提取物可以缓慢降低血糖，同时能改善气阴两虚之症状。
因此我们用本发明的楤木提取物对气阴两虚证消渴病(II型糖尿病)患者46例(含对照组16例)，进行了临床试验，其结果如下：
(一)病例标准
参照《新药(中药)治疗消渴病(糖尿病)临床研究指导原则》确诊为消渴病(糖尿病)且辨征为气阴两虚的病人同时，根据1980年WHO暂行标准(静脉血浆真糖法)，诊断为分类属轻、中度非胰岛素依赖型(NIDDM，II型)糖尿病，分期属糖尿病症状期(II期)，糖尿病合并症早期(III期)者。
(二)、临床试验方法：
给药方法
1.治疗组：服用制剂例1制备的胶囊(50mg/粒)，2粒/次，3次/日，口服。
2.对照组：①口服降糖灵片，南通制药厂生产，25mg/片，1片/次，3次/日。②口服优降糖，北京双桥制药公司生产，按说明服用。
3.治疗疗程：治疗组与对照组均以用药两个月为一疗程，疗程结束，即结束临床观察。
(三)观察指标
1.中医疗效性观测：
按以下评价指标，除特别指出外，相应于正常、轻度、中度和重度分别评分为0、2、4、6分。
A.倦怠乏力：
正常，症状无或消失；轻度，易疲劳，但可胜任日常工作；中度，疲劳于休息后可缓解，不耐重工作或持久工作；重度，疲乏于休息后不能恢复，不能胜任工作。
B.头晕
正常，症状无或消失；轻度，偶有，轻微；中度，明显，时有；重度，严重，持续不断。
C.气短懒言
正常，症状无或消失；轻度，运动后气短，不喜多言；中度，稍动即气短，不喜多言；重度，平静时亦气短，不欲言语，呈无欲状。
D.口渴喜饮
正常，症状无或消失；轻度，口渴，饮水后可缓解，日饮水量增加1/2倍以上；中度，口渴明显，日饮水量＜4000ml，或增加1/2-1倍；重度，口干甚饮水不解，日饮水量＞4000ml，或增加＞1倍。
E.五心烦热
正常，症状无或消失；轻度，手足心热，偶有心烦；中度，手足欲露衣被外，时感心烦；重度，手足热，喜触冷物，心烦不宁。
F.自汗
正常，症状无或消失；轻度，动则微汗出；中度，不动即皮肤潮湿，稍动则汗出；重度，经常汗出，动则汗出如水洗。
G.盗汗
正常，症状无或消失；轻度，寐则偶汗出；中度，寐则汗出；重度，寐则大汗出如珠。
H.多食易饥
正常，症状无或消失；轻度，有轻度饥饿感，食量略增加；中度，时感饥饿，尚能控制，或食量增加1/2-1倍；重度，易饥多食，不能自控，或食量增加1倍以上。
I.大便干结(0、1、2、3分)
正常，症状无或消失；轻度，便干，排之不畅；中度，大便干结，排之困难，2-3日/次；重度，大便硬结，干涩难解，数日/次。
J.多尿或溲赤(0、1、2、3分)
正常，症状无或消失；轻度，尿色深黄，或尿量增加1倍以上；中度：尿色黄赤，或尿量增加1-2倍；重度：尿呈茶褐色，尿量增加2倍以上。
K.心悸(0、1、2、3分)
正常，症状无或消失；轻度，活动量稍大即感心悸；中度，轻微活动即感心悸；重度，休息时可感心悸。
F.失眠(0、1、2、3分)
正常，症状无或消失；轻度，睡眠不足6小时；中度，睡眠不足4小时；重度，睡眠不足3小时。
I.舌象、脉象
舌红少津 1分
舌体胖大 1分
苔薄黄或少苔 1分
脉弦细或细数 1分
中医症状分级标准：
以上累积分＞44分为重度；20分～44分为中度；＜20分为轻度
2.空腹及餐后两小时血糖检测，用药后每两周一次。
3.24小时尿糖定量检测，用药后每两周一次。
4.血脂测定
5.糖基化血红蛋白测定。
6.血液流变学测定。
(四)疗效判定标准
根据临床症状及化验检查变化作为判定标准(以卫生部一九九三年中药新药临床研究指导原则为标准)。
1.显效：治疗后症状基本消失，空腹血糖＜7.2mmol/L(130mg/dl)，餐后2小时血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，24小时尿糖定量＜10.0克；或血糖、24小时尿糖定量较治疗前下降30％以上。
2.有效：治疗后症状明显改善，空腹血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，餐后2小时血糖＜10.0mmol/L(180mg/dl)。24小时尿糖定量＜25.0克；或血糖、24小时尿糖定量较治疗前下降10-29％。
3.无效：治疗后症状无明显改善，而血糖、尿糖下降未达上述标准。
(五)中医证侯疗效标准
证侯疗效评定按半定量评分法。
综合证侯疗效评定方法：
1.痊愈：积分比100％
2.显效：积分比≥70％
3.有效：70％＞积分比≥30％
4.无效：30％＞积分比
(六)、临床总结及统计处理
所有资料汇总，输入IBM/PC兼容计算机，建立数据库，用POMS(医学统计程序)、PEMS(华西医科大学医学统计程序)进行统计处理。
统计处理方法：计数资料用χ2检验，等级资料用Ridit分析，计量资料用t检验。
结果
1.总疗效(表4)
表4分组 例数 显效例(％) 有效例(％)无效例(％)总有效率例(％)给药组 30 13(43.33) 6(20.0)11(36.67) 63.33降糖灵 9 1(11.11) 5(55.55)3(33.33) 66.66优降糖 7 4(57.14) 03(42.85) 57.14
2.中医证候疗效(表5)
表5分组例数痊愈例(％)显效例(％)有效例(％)无效例(％)给药组30 7(23.33)10(33.33)8(26.67)5(16.67)降糖灵9 3(33.33)2(22.22)2(22.22)2(22.22)优降糖7 0(0)3(42.86)1(14.29)3(42.86)
3.中医症状疗效分析(表6)
表6 症状给药组 例(％)降糖灵 例(％)优降糖 例(％)倦怠乏力n消失改善好转无效3016(53.33)*9(30.0)5(16.67)093(33.33)2(22.22)2(22.22)2(22.22)71(14.28)2(28.57)1(14.28)3(42.86)头晕n消失改善好转无效2815(53.57)*6(21.43)7(25.0)092(22.22)2(22.22)3(33.33)2(22.22)602(33.33)2(33.33)2(33.33)气短懒言n消失改善好转无效2719(70.37)*7(25.93)1(3.7)083(37.5)2(25.0)1(12.5)2(25.0)602(33.33)2(33.33)2(33.33)口渴喜饮n消失改善好转无效308(26.67)18(60.0)*4(13.33)093(33.33)2(22.22)3(33.33)1(11.11)71(14.29)2(28.57)2(28.57)2(28.57)五心烦热n消失改善好转无效2918(62.07)*7(24.14)4(13.8)082(25.0)3(37.5)2(25.0)1(12.5)602(33.33)2(33.33)2(33.33)自汗n消失改善好转无效2413(54.17)*6(25.0)3(12.5)2(8.3)71(14.29)2(28.57)2(28.57)2(28.57)401(25.0)1(25.0)2(50.0)盗汗n消失改善好转无效2113(61.9)*5(23.8)2(9.52)1(4.76)702(28.57)2(28.57)3(42.86)602(33.33)2(33.33)2(33.33)多食易饥n消失改善好转无效3013(43.33)6(20.0)4(13.33)7(23.33)94(44.44)2(22.22)3(33.33)071(14.29)2(28.57)3(42.86)1(14.29)大便干结n消失改善好转无效206(30.0)4(20.0)4(20.0)6(30.0)602(33.33)1(16.67)3(50.0)401(25.0)2(50.0)1(25.0)多尿或溲赤n消失改善好转无效308(26.66)15(50.0)5(16.67)2(6.67)93(33.33)3(33.33)3(33.33)071(14.29)2(28.57)2(28.57)2(28.57)
*与降糖灵、优降糖同等级比较，P＜0.05
小结：
1.本发明的楤木提取物对气阴两虚证消渴病患者30例临床预试，其疗效观察结果示：总疗效63.33％，显效率43.33％。
2.本发明的楤木提取物证候疗效分别为总疗效83.33％，愈显率56.67％。
3.本发明提取物对中医症状改善情况优于降糖灵、优降糖，尤其对倦怠乏力、头晕、气短懒言、口渴喜饮、五心烦热、自汗、盗汗之气阴两虚症状的改善效果更为明显。
4.另外发现本发明的楤木提取物对血糖的下降不及降糖灵、优降糖迅速，具有起效相对缓慢的特点，但患者一当血糖下降后，一般不再出现反跳。
5.30例服用制剂例1胶囊的患者，在临床观察中，未发现1例毒、副反应。
药理实验例2.本发明楤木提取物对正常动物血糖的影响：
(1)单次给药对正常动物血糖的影响：
取正常家兔48只，随机分为6组，在饲养观察室内观察7天，给药前禁食12小时，耳缘静脉取血，测定给药前血糖值。分别灌胃给提取物100mg/kg、50mg/kg，25mg/kg，参芪降糖胶囊300mg/kg及优降糖3.5mg/kg，给药容积为5m/kg，空白对照组给相当容积0.5％CMC-Na，给药后3小时取血，离心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶试剂，混匀后37℃保温15分钟，505nm波长处测定吸收度(A)。与标准葡萄糖吸收度比较，计算血清中葡萄糖含量。并与给药前血糖浓度比较。试验结果如下表7所示，各给药组给药前后血糖值无明显差异。
表7组别剂量(mg/kg)动物数(只) 给药前血糖(mg/dl) 给药后血糖 (mg/dl)空白对照组楤木提取物组 参芪降糖胶囊组优降糖组 - 100 50 25 300 3.5 8 8 8 8 8 8 105.4±20.9 114.5±15.3 101.6±25.4 115.7±22.3 106.8±15.5 101.9±12.8 95.1±29.6 91.0±21.1 93.5±14.3 114.2±23.7 100.2±12.8 85.4±17.7*
注： X±SD，给药前后血糖值比较*p＜0.05
(2)多次给药对正常动物血糖的影响：
取正常小鼠60只，随机分为6组，在饲养观察室内观察7天，给药前禁食12小时，眼球后静脉取血，测定给药前血糖值。分别灌胃给提取物120mg/kg、60mg/kg，30mg/kg，参芪降糖胶囊800mg/kg及优降糖4mg/kg，空白对照组给相当容积0.5％CMC-Na，给药容积为0.2ml/10g，连续给药7天，末次给药后3小时眼球后静脉取血，离心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶试剂，混匀后37℃保温15分钟，505nm波长处测定吸收度A。与标准葡萄糖吸收度比较，计算血清中葡萄糖含量。并与给药前血糖浓度比较。结果如表8所示。各给药组给药前后血糖值明显下降，与给药前血糖值比较有非常显著差异(p＜0.01)
表8 组别 剂量(mg/kg)动物数(只) 给药前血糖 (mg/dl) 给药后血糖 (mg/dl) 空白对照组 提取物组 参芪胶囊组 优降糖组 等体积 120 60 30 800 4 10 10 10 10 10 10 90.2±14.4 89.9±14.8 91.5±17.2 97.0±14.7 95.3±16.7 93.2±13.4 88.2±12.4 60.2±12.8** 62.9±9.1** 85.7±14.3* 78.2±11.8* 50.8±10.0**
注： X±SD，给药前后血糖值比较*p＜0.05，**p＜0.01
药理实验例3.本发明楤木提取物对四氧嘧啶致高血糖动物血糖的影响：
(1)单次给药对血糖影响的时效关系
取正常家兔，禁食12小时后用固定箱固定之。以酒精涂擦兔耳，使耳缘静脉轮廓清晰，于试验前用生理盐水配制四氧嘧啶，以150mg/kg从耳缘静脉注入，诱导成高血糖动物模型，另准备高渗葡萄糖溶液，以便在给药初期低血糖痉挛发作时及时给予。待其血糖值稳定后，取血，离心，测血糖值，取空腹血糖值在200mg/dl以上的家兔随机分为6组，每组8只，分别灌胃给提取物100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，参芪降糖胶囊300mg/kg及降糖灵35mg/kg及相当容积的0.5％CMC混悬液，分别在给药后1、2、3、4小时取血，离心，用葡萄糖氧化酶法测血糖浓度，并与给药前血糖值比较，结果如表9所示，楤木单次灌胃给药后对四氧嘧啶高血糖家兔有降低血糖作用，但仅第3小时与模型组比较有显著差异。
表9 组别 给药前血糖 给药后血糖(mg/dl) 1小时 2小时 3小时 4小时 模型对照组 提取物组(100mg/kg) (50mg/kg) (25mg/kg) 参芪胶囊组 降糖灵组 553.3±68.8 541.1±22.5 543.2±26.9 544.6±55.6 534.6±22.0 560.4±24.0 562.1±27.7 529.7±33.0 535.9±32.8 539.6±51.7 542.9±37.6 526.8±22.8 540.6±33.3 505.6±31.3* 507.4±31.8* 523.3±32.8 522.4±37.9 489.6±27.5 555.4±45.0 521.0±29.0 522.0±30.8 529.4±30.8 529.2±40.7 541.0±30.9 560.2±48.5 537.2±43.7 542.3±33.5 541.6±27.5 543.6±36.8 526.3±30.5
X±SD，与给药前相比*p＜0.05，**p＜0.001
(2)连续给药对四氧嘧啶所致高血糖家兔血糖影响
如前所述方法制备四氧嘧啶高血糖模型家兔48只，测给药前空腹血糖后，选合格动物均分为6组，每组8只，分别是模型对照组、楤木提取物组100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、两组阳性对照组(包括参芪降糖胶囊300mg/kg，降糖灵35mg/kg)、空白对照组另取8只仅静脉注射相当容积的四氧嘧啶溶剂生理盐水的正常家兔。每天灌胃给药一次，给药容积为5.0ml/kg，空白对照组和模型对照组给相当容积的0.5CMC-Na，连续给药4周(28天)，每给药7天测定一次空腹血糖进行组间比较并于末次给药(28天)后不同时间(1，2，4，24h)采血，进行比较，给药后第7天楤木提取物100mg/kg和50mg/kg组开始出现明显降糖作用，并随给药时间延长，降糖作用日趋明显，停药后其降糖作用可维持4小时左右(表10，11)
表10连续给药对血糖影响组别 血糖值(mg/dl) 给药前 给药后 第7天第14天 第21天第28天空白对照组101.9±14.2 97.2±12.8105.6±17.2 114.6±12.8107.4±14.0模型对照组463.2±54.1 458.2±38.5474.6±58.3 468.9±46.6454.8±48.5提取物组(100mg/kg)(50mg/kg)(25mg/kg)458.7±56.0 406.4±40.2*402.9±25.0* 394.1±44.0**388.6±43.9**467.9±59.8 416.3±42.3*411.8±29.1* 403.7±34.9**410.2±21.3**450.8±60.6 437.6±57.4427.9±45.4 414.6±25.8*407.3±34.9**参芪降糖胶囊组474.2±51.8 460.6±52.0434.6±48.3 428.4±44.4412.6±21.6*降糖灵组489.2±65.2 408.3±41.0*396.5±42.9** 374.5±49.8**368.5±32.2**
X±SD，各给药组血糖与模型对照组血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01
表11连续灌胃血糖影响组别 末次给药后不同时间血糖值(mg/dl) 1小时 2小时 4小时 24小时空白对照组107.4±14.0112.6±17.5107.3±10.8103.4±16.5模型对照组454.8±48.5459.6±47.8439.9±43.7479.0±57.7提取物组(100mg/kg)(50mg/kg)(25mg/kg)388.6±43.9**368.5±29.8**394.6±22.5*432.7±41.0386.5±36.9**374.6±38.5**417.6±35.4434.5±23.8407.3±32.3 402.3±34.3427.6±47.4443.4±36.2参芪降糖胶囊组412.6±21.6*407.5±36.5430.6±26.2456.4±37.4降糖灵组368.5±32.2**344.6±34.8**374.8±31.9**453.4±43.5
X±SD，各给药组血糖与模型对照组血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01
药理实验例4.楤木提取物对链脲霉素致高血糖小鼠血糖的影响
取昆明种小鼠，体重20-22g，禁食12小时后尾静脉注射用生理盐水新鲜配制的链脲霉素溶液，剂量180mg/kg，造成务糖模型，稳定一周后取空腹血糖值在180mg/dl以上的小鼠60只，均分6组，各组给药剂量如表6-7所示，模型对照组灌胃给相当容积0.5CMC-Na。于给药后0、2、4、6小时分别采血用葡萄糖氧化酶法测血糖，各给药组血糖与模型组血糖进行比较显著性检验、结果如表12所示，楤木皂苷对链脲霉素高血糖小鼠有明显降糖作用。
表12楤木提取物对链脲霉素致高血糖小鼠血糖的影响组别剂量给药后不同时间血糖值(mg/dl)(mg/kg)0小时2小时4小时6小时模型对照组-252.8±27.0 260.2±25.8268.6±24.1263.6±25.6120269.4±20.9 195.6±24.6**220.4±22.8**256.1±26.0提取物组60289.6±41.0 227.6±20.7**230.3±25.3*246.3±22.930260.8±27.0 232.8±24.7*242.3±23.8237.0±39.0参芪降糖胶囊800255.5±22.5 230.6±24.1*236.4±23.96244.3±23.8降糖灵40262.4±27.5 217.7±26.2**172.6±16.0**233.1±35.2*
X±SD，各给药组血糖值与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01
药理实验例5.楤木提取物对肾上腺素致高血糖小鼠血糖的影响
取小鼠70只，均分为7组，1、2组灌胃生理盐水0.2ml/10g，3、4、5组灌胃给提取物(剂量120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)，第6组灌胃给参芪降糖胶囊(300mg/kg)，第七组灌胃给降糖灵(40mg/kg)，连续给药9天，末次给药前禁食12小时，末次给药后2小时，2、3、4、5、6组小鼠腹腔注射肾上腺素50ug/kg，30分钟后眼眶取血，葡萄糖氧化酶法测血糖。结果见表13。肾上腺素能促进肝脏及肌肉糖原分解，并能促进糖异生作用，使动物血糖升高，本发明提取物对肾上腺素所致的试验性高血糖动物模型具有显著的降糖作用。
表13对肾上腺素引起的高血糖小鼠血糖的影响 组别 剂量(mg/kgxd) 动物数(只) 给药后血糖(mg/dl) 空白对照组 模型对照组 提取物组 参芪降糖胶囊组 降糖灵 - - 120 60 30 800 40 10 10 10 10 10 10 10 80.1±42.1 477.8±42.9 269.5±47.2** 324.5±36.6** 328.5±37.1** 340.6±31.7** 245.7±36.8**
注： X±SD，与模型对照组作t检验p＜0.05，**与模型对照组作t检验p＜0.01
药理实验例6.楤木提取物对葡萄糖致糖耐量的影响
取四氧嘧啶致高血糖家兔48只，分为6组，分别是模型对照组(给0.5％CMC混悬液)、提取物组(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)、阳性对照组参芪降糖胶囊(300mg/kg)、降糖灵(35mg/kg)，禁食12小时，取血，测血糖后分别给药30分钟后，以2.5g/kg剂量灌胃给葡萄糖，给糖后分别在30分钟、60分钟、90分钟、120分钟耳缘静脉取血，离心，用葡萄糖氧化酶法测血糖。结果见表14，试验结果表明楤木提取物能提高受试动物的糖耐受性。
表14楤木提取物对高血糖家兔糖耐量的影响组别给药前给糖后血糖值mg/dl 30分60分90分120分模型组493.7±48.2 701.4±76.0783.0±41.4752.4±30.0734.6±28.3提取物509.8±50.1 640.0±27.0**738.8±36.9*704.6±45.7**674.6±47.9**511.3±48.2 663.0±53.2*764.4±34.9720.4±29.9*702.2±37.2507.6±50.7 671.3±49.2756.8±31.96734.7±43.7713.6±30.1参芪降糖胶囊509.5±62.1 668.0±22.6*750.0±37.2*743.7±43.7710.4±22.9降糖灵517.9±47.5 622.0±27.0**564.0±26.5**534.2±28.3**535.6±23.7**
注： X±SD，各给药组血糖与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01
药理实验例7.楤木提取物对肝糖元含量的影响
取四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠60只，均分为6组，分别为提取物高剂量组(120mg/kg)、提取物中剂量组(60mg/kg)、提取物低剂量组(30mg/kg)及模型对照组(0.5％CMC)、阳性对照组为参芪降糖胶囊(800mg/kg)、降糖灵(40mg/kg)另取正常小鼠10只，作为空白对照组(0.5％CMC)，灌胃给药，连续9天，末次给药前禁食12小时，末末次给药后2小时处死小鼠取小鼠肝脏，以生理盐水洗净血液，用滤纸吸干表面水分后分别称取各组小鼠肝组织0.5g，加入事先加及1.5ml 30％KOH的溶液的试管中，置沸水浴中煮沸20min，取出冷却，转移到100ml容量瓶中，蒸馏水清洗，合并清洗液至刻度，混匀。用蒽酮法测定肝糖元的含量。结果如表15所示，试验结果表明楤木提取物可使四氧嘧啶高血糖小鼠肝糖元含量增加，与模型对照组肝糖元含量间有显著差异。楤木提取物可以增加肝糖元的含量，说明其降糖作用与促进动物的糖的合成代谢有一定关系。
表15楤木提取物对肝糖元含量的影响 组别 剂量(mg/kgxd) 动物数(只) 肝糖元含量(g/100g肝组织 空白对照组 模型对照组 提取物组 参芪降糖胶囊 降糖灵 - - 120 60 30 800 40 10 10 10 10 10 10 10 3.338±0.327 1.299±0.396 2.712±0.323** 2.159±0.339** 1.752±0.185* 2.047±0.344** 1.304±0.327
注： X±SD，*与模型对照组作t检验p＜0.05，**与模型对照组作t检验p＜0.01
药理实验例8.楤木提取物对血清胰岛素含量的影响
取四氧嘧啶诱发高血糖小鼠60只，分为6组，分别为提取物高剂量组(120mg/kg)、提取物中剂量组(60mg/kg)、提取物低剂量组(30mg/kg)及模型对照组参芪降糖胶囊(800mg/kg)，降糖灵组(40mg/kg)，另取正常小鼠10只，为正常对照组(0.5％CMC)，连续给药9天，末次给药前禁食12小时，于末次灌胃给药后2小时眼眶取血，离心，取血清，测血清中的胰岛素含量。结果见表16，本发明提取物可以增加血清胰岛素水平。
表16楤木提取物对四氧嘧啶致高血糖小鼠血清胰岛素含量的影响组别剂量(mg/kg/日)动物数(只)血清胰岛素Iu/ml正常对照组模型对照组给药组 参芪降糖胶囊降糖灵组 - - 120 60 30 800 40 10 10 10 10 10 10 1014.30±2.509.84±1.7113.96±3.83**13.51±2.72*13.34±1.81*13.49±4.42*10.41±1.36
注： X±SD，*与模型对照组作t检验p＜0.05，**与模型对照组作t检验p＜0.01