具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与应用.pdf

本发明公开了具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与以该蛋白为活性成分的疫苗药物。本发明所提供的具有防治流感作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制流感病毒作用的蛋白质。本发明的具有防治流感作用的融合蛋白可作为预防流感病毒的疫苗。

1、  具有防治流感作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制流感病毒作用的蛋白质。

2、  权利要求1所述的具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因。

3、  根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
3)在高严谨条件下可与序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、  含有权利要求2或3所述的具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因的表达载体。

5、  根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGEX-4T-M16。

6、  含有权利要求2或3所述的具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因的细胞系。

7、  含有权利要求2或3所述的具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因的工程菌。

8、  根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为含有pGEX-4T-M16的大肠杆菌BL21(DE3)。

9、  扩增权利要求2或3所述的具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因中任一片段的引物对。

10、  一种预防流感病毒的疫苗，它的活性成分是权利要求1所述的具有防治流感作用的融合蛋白。

具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与以该蛋白为活性成分的疫苗。
背景技术
流感是一种由病毒引起的常见、多发性传染疾病，对人类特别是老人、儿童以及身体较弱的人有很大的威胁，同时流感爆发对整个社会、经济发展也有严重的影响。现有的流感疫苗有以下三种：(1)流感病毒灭活疫苗，该疫苗目前在成人中广泛使用，是利用流感病毒灭活后的病原体制成的。但是该疫苗株需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。此类流感疫苗所需要的病毒需要在鸡胚中繁殖收集，一旦流感大规模爆发，合格的鸡胚供应往往难以保证；而且，此类疫苗中无法完全去除的鸡胚蛋白能够在部分人群中导致过敏症状的出现(Virus Research 2004，103：173-176)。(2)流感病毒减毒活疫苗，该疫苗于1960年开始大量用于人体，也是利用流感病毒减毒后的病原体制成的。该疫苗株也需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，目前，国内外正在进行新疫苗株的筛选实验。(3)流感病毒亚单位疫苗，该疫苗是目前国外儿童正在使用的流感疫苗，是利用基因重组的病毒表面抗原诱导免疫防护，病毒表面抗原也需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。
目前商业化的流感疫苗总的特点是不能对付流感病毒毒株的抗原性变异。流感病毒的变异性很强，抗原性变异不断发生。上述流感疫苗不能对付流感病毒的变异，根本原因是因为上述流感疫苗的设计基本都是基于流感病毒的一个表面胞膜蛋白HA(血凝素)，国外的大量研究表明，流感病毒做为正链RNA病毒，它的RNA依赖型的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase)在基因组的复制过程缺乏真核生物的DNA聚合酶具有的审查活性(Proof Reading Activity)。所以流感病毒的主要表面蛋白抗原HA的不断变异造成了流感病毒的免疫逃逸，HA突变率分别为6.7×10^-3(Annu Rev Genet 2002 36 305-332)。
上个世纪90年代后开始比较多的研究转移到流感病毒的另外一个表面胞膜蛋白M2，并且绝大部分的研究工作是将以M2蛋白的整个胞外区序列(aa1-24)，作为流感病毒疫苗的设计靶点。这主要是因为M2蛋白相比HA有突出的保守性，并且大量的前期研究表明M2蛋白的胞外区序列能够诱导非常有效的防护性体液应答(NatureMedicine 1999，5：1157-1163；Vaccine 2003，21：2616-2626；Vaccine 1995，13：1339-1342；Vaccine 2004，22：2993-3003；Virus Research 2004，103：173-176；Euro J Immunol 2002，32：3305-14)。
目前基于流感病毒M2e表位设计的流感疫苗大多采用将M2e表位多肽与载体蛋白耦联的设计思路(Vaccine 2003，21：2616-2626；Vaccine 2004，22：2993-3003；Virus Research 2004，103：173-176；Euro J Immunol 2002，32：3305-14)，这样的流感疫苗设计一方面无法保证成功地耦联到载体蛋白上的M2e表位多肽的数量；另一方面，在将多肽与载体耦联过程中要使用部分有毒的化学耦联剂，例如常用的MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)和戊二醛，以及在融解多肽过程中可能用到的DMSO都是Sigma公司明确表明有毒的物质，这样势必会影响此类流感疫苗的生产和推广。
A/PR/8/34是人甲型流感病毒H1N1亚型的代表毒株之一，常为球型，直径80-120nm。负链RNA病毒，基因组全长为13.6Kb，在病毒复制周期中明确的蛋白产物有10个。把A/PR/8/34病毒在小鼠(Balb/c)中传代适应，使小鼠发病死亡可以得到小鼠致死型的鼠肺适应株，在国内外一般用于流感病毒的小鼠致死型病毒攻击模型的使用毒株。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的具有防治流感作用的融合蛋白，名称为GST-(M2e)₁₆，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制流感病毒作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №：1由645个氨基酸残基组成。序列1中，自氨基端第1位-224位氨基酸残基为谷胱甘肽转移酶，自氨基端第225位-226位氨基酸残基为连接肽GS，自氨基端第227位-640位氨基酸残基为使用二肽接头(linker)RS线性连接在一起的16个拷贝的M2e防护性表位，自氨基端第641位-645位氨基酸残基为端肽RSILL。
上述具有防治流感作用的融合蛋白地编码基因也属于本发明的保护范围。
上述具有防治流感作用的融合蛋白的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
3)在高严谨条件下可与序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中，所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №：2由1938个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1938位碱基。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围，如pGEX-4T-M16，含有pGEX-4T-M16的大肠杆菌BL21(DE3)。
扩增上述具有防治流感作用的融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种预防流感病毒的疫苗。
本发明所提供的预防流感病毒的疫苗，它的活性成分是上述具有防治流感作用的融合蛋白。
需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂等。
本发明的疫苗可以制成注射液，该剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
上述疫苗的免疫用量一般为0.5-2.5mg具有防治流感作用的融合蛋白/kg体重/次。
本发明的具有防治流感作用的融合蛋白GST-(M2e)₁₆是基于流感病毒胞膜蛋白M2胞外区的防护性序列设计而成，是将谷胱甘肽转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)和使用二肽接头(linker)RS线性连接在一起的16个拷贝的M2e防护性表位的重组融合蛋白，特异性地提高了M2e防护性表位序列的拷贝数目(表位密度)。且GST-(M2e)₁₆使用生物工程方法发酵而成，生产工艺成熟，其安全性较化学偶联疫苗大为提高。
实验证明相同的免疫剂量和途径免疫小鼠或者新西兰白兔，GST-(M2e)₁₆诱导产生的针对M2e表位序列的体液免疫应答显著强于仅仅含有一个或者四个M2e表位序列拷贝的融合蛋白GST-M2e或GST-(M2e)₄诱导的M2e特异性体液应答；而且针对新西兰白兔的实验表明GST-(M2e)₁₆作为免疫剂诱导产生的抗血清中M2e表位序列特异性的抗体浓度显著高于GST-M2e或者GST-(M2e)₄作为免疫剂诱导产生的抗血清；不仅如此，GST-(M2e)₁₆诱导产生的抗血清在识别流感病毒M2天然蛋白方面能力显著强于GST-(M2e)或者GST-(M2e)₄诱导产生的抗血清；最为重要的是，小鼠体内的攻毒实验表明，GST-(M2e)₁₆作为免疫剂能够100％的防护小鼠抵抗致死剂量的致死型流感病毒的攻击，GST-(M2e)₄只能分别保护50％小鼠免受攻击，而GST-M2e不能提供有效的防护。而且大量的研究证明本发明使用的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位(流感病毒胞膜蛋白M2的胞外区氨基酸序列(aa1-24：MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD))，在所有的人类流感病毒中非常保守(Nature Medicine 1999，5：1157-1163；Vaccine 2004，22：2993-3003)，所以本发明GST-(M2e)₁₆具有潜在的针对不同亚型的流感病毒的防护性能力，GST-(M2e)₁₆将在流感的防治中发挥重要作用。
图1A为质粒pGEX-4T-M1，pGEX-4T-M4，pGEX-4T-M16经BamHI+XhoI双酶切鉴定图谱
图1B为GST-M2e、GST-(M2e)₄、GST-(M2e)₁₆的SDS-PAGE图谱
图2为纯化后的融合蛋白GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄，GST-M2e与M2e表位序列特异性的单克隆抗体相互作用的免疫印迹图谱
图3为将GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄、GST-(M2e)₁₆进行免疫实验的图例式说明
图4A-图4C为GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄和GST-M2e分别进行初次，第二次，第三次免疫后15天，采集的小鼠血清中M2e表位特异性的抗体滴度的测定曲线
图4D-图4F为GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄和GST-M2e分别进行初次，第二次，第三次免疫后20天，采集的新西兰白兔血清中M2e表位特异性的抗体滴度的测定曲线
图5为分别使用GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄和GST-M2e进行初次，第二次，第三次免疫后20天，采集的新西兰白兔血清中M2e表位特异性抗体的浓度柱状图
6A-图6B为PBS以及分别使用GST、GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄和GST-M2e第三次免疫后20天采集的新西兰白兔血清识别流感病毒天然M2蛋白的流式细胞仪检测曲线
图7为对GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄或GST-M2e第三次免疫后15天的小鼠攻毒后，小鼠的体重随攻毒时间的变化曲线
图8为对GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄或GST-M2e第三次免疫后15天的小鼠攻毒后，小鼠的存活率随攻毒时间的变化曲线
实施例1、GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄和GST-M2e的制备与鉴定
1、GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄和GST-M2e三种融合蛋白基因的构建
由北京奥科生物科技有限责任公司采用8909 Expedite核酸自动合成仪器合成寡核苷酸链L1，L2，P1和P2，并经凝胶纯化鉴定。它们的序列如下：L1：5`GCGCGGATCCATGTCCCTGCTGACTGAAGTTGAAACTCCGATCCGTAACGAATG 3`(带下划线的碱基为BamH I识别序列)；
L2：5`GTTATCAAGATCTGTCGGAGGAGTCGTTGCAACGGCAACCCCATTCGTTACGG 3`(带下划线的碱基为Bgl II识别序列)；
P1：5`GTGCGCGGATCC 3`(带下划线的碱基为BamH I识别序列)；
P2：5`CTCGAGTTATCAAGATCT 3`(5`端带下划线的碱基为Xho I识别序列，3`端带下划线的碱基为Bgl II识别序列)
采用P1和P2作为上游和下游引物，采用L1和L2作为嵌套式PCR(overlapping PCR)的嵌套寡合苷酸链，采用如下的PCR(聚合酶链式反应)程序，完成融合蛋白的人工基因构建。反应体系为：2.5pmol/L引物P1和P2各4μL，10pmol/L嵌套寡合苷酸链L1和L2各5μL做为模板，10mmol/LdNTPs 1μl，Taq酶1U(购自上海申能博采生物公司)，Buffer 5μl，纯水补足到50μl。反应条件为：94℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环，最后72℃延伸5分钟。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并纯化回收。将PCR产物与T-easy载体(购自美国Promega公司)混合后于4℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，利用IPTG、X-gal蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒测序，将含有嵌套式PCR产物(具有序列表中序列3的核苷酸序列)的连接产物命名为pGEM-T-MO，它在多克隆位点中含有M2e表位基因片断，这段基因片断有下面的特点：该片段的5’端含有限制性内切酶BamHI的识别位点；3’端含有限制性内切酶BglII和XhoI的识别位点。使用BglII酶和XhoI(购自Takata公司)双酶切pGEM-T-MO，使用DNA胶回收试剂盒(购自上海申能博采公司)纯化回收载体片断。使用T₄DNA连接酶在回收的经过双酶切的载体片断的两个酶切位点之间连入一个614bp的DNA片段(该DNA片断按照刘祖强、陈应华，Recombinant Technology：Design and construction of a recombinant epitope-peptide gene as a universalepitope-vaccine strategy，Journal of Immunological Methods 2004，285：93-97的方法制备，其具有序列表中序列5的核苷酸序列)，该片段具有如下特点：5’端含有BglII(AGATCT)的限制性内切酶的识别位点，其后紧接终止密码子(TAA)，即5`-AGATCTATTCTACTGTAA3`；3’端含有XhoI的识别位点；该片段中只有单一的BglII和XhoI，没有BamHI位点。将该连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，利用IPTG、X-gal蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒测序，将含有编码一个M2e表位的GST-M2e基因(具有序列表中序列4的核苷酸序列)的连接产物命名为pGEM-T-M1，该基因编码一个M2e表位。用BamHI+XhoI消化pGEM-T-M1回收小片段，插入经BglII+XhoI消化pGEM-T-M1后得到的载体片段，将该连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，利用IPTG、X-gal蓝白斑筛选及测序，得到含有编码两个M2e表位的GST-(M2e)₂基因的连接产物pGEM-T-M2。按照上述原理，基本重复上面的步骤，用BamHI+XhoI消化pGEM-T-M2回收小片段，插入经BglII+XhoI消化pGEM-T-M2后得到的载体片段，将该连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，利用IPTG、X-gal蓝白斑筛选及测序，得到含有编码4个M2e表位的GST-(M2e)₄基因的阳性质粒
pGEM-T-M4。按照上述原理再重复上述步骤两次，得到阳性质粒pGEM-T-M16，该质粒含有编码十六个M2e表位的GST-(M2e)₁₆基因(具有序列表中序列2的核苷酸序列)。这样得到三种重组质粒pGEM-T-M1，pGEM-T-M4和pGEM-T-M16分别具有能够编码一个，四个和十六个M2e表位的基因。BamHI+XhoI酶切上述三种质粒，回收三种经过酶切释放的表位基因片断，分别插入经BamHI+XhoI消化的pGEX-4T-2(购自AmershamBiosciences公司)，经筛选分别得到阳性克隆pGEX-4T-M1，pGEX-4T-M4，pGEX-4T-M16。这些阳性质粒经BamHI+XhoI双酶切鉴定(图1A，泳道1、2、3分别为GST-M2e基因、GST-(M2e)₄基因、GST-(M2e)₁₆基因)和DNA测序鉴定表明结构正确。
2、GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄、GST-M2e融合蛋白的表达纯化
分别将pGEX-4T-M1，pGEX-4T-M4，pGEX-4T-M16以及作为阴性对照的pGEX-4T-2质粒通过CaCl₂法转化BL21(DE3)菌，利用IPTG、X-gal蓝白斑筛选及测序，得到阳性克隆。每一种转化了重组原核表达质粒的BL21(DE3)单克隆菌株都按照如下的条件进行融合蛋白的表达纯化。在LB培养基中37℃、220rpm振荡培养过夜，第二天以1∶50转接到新鲜的LB培养基中进行诱导表达。表达条件为：在细菌生长到OD A600约0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导3-4小时(诱导时间越长目的蛋白降解比例越高)，10,000rpm离心收获细菌，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)洗涤一次，菌沉淀-20℃冻存(冰冻有利于细菌的裂解)。
融合蛋白纯化步骤如下：
(1)20ml冰冷的PBS(pH7.2)重悬500ml细菌沉淀，加入溶菌酶粉末20mg，加入2ml 10％Triton X-100 PBS溶液，加入100ul 5mg/ml DNase和Rnase，冰浴同时快速搅拌30分钟至溶液不再粘稠。同时加入蛋白酶抑制剂PMSF到终浓度为100mmol/L。
(2)冰浴超声裂解，收集上清。0.45μm滤膜过滤上清，滤液用于亲和纯化融合蛋白。
(3)将过滤的上清流过亲和柱Glutathione-Sepharose 4B亲和柱(购自Amersham Biosciences公司)，流速为30ml/h。50-100ml 0.6-1M NaCl PBS(pH7.2)溶液洗柱，去除大部分非特异性吸附的蛋白。
(4)在FPLC系统(Pharmacia)监控下，继续用PBS(pH7.2)平衡亲和柱，利用10mM还原型谷胱甘肽50mM Tris-HCl(pH8.0)溶液竞争性洗脱吸附的重组抗原，收集洗脱的蛋白，获得免疫用重组抗原。
利用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的融合蛋白的纯度，结果如图1B所示，表明得到电泳纯的融合蛋白(图1B，泳道1、2、3分别为GST-M2e、GST-(M2e)₄、GST-(M2e)₁₆)
4、GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄、GST-M2e融合蛋白的蛋白浓度与抗原性鉴定
用Bradford法(考马斯亮兰法)测定纯化的蛋白浓度，其中，测取A630nm，以蛋白含量为Y轴，A630nm为X轴标上标准溶液的点，在Microsoft Excel中利用二项式法进行曲线拟合，再用获得的曲线公式计算未知蛋白的浓度。结果表明步骤2表达的GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄、GST-M2e的蛋白浓度分别为0.30、0.50、0.67g/L。
用Immunoblotting(免疫印迹)法测定融合蛋白针对M2e表位的抗原性，具体步骤如下：
(1)首先完成四种样品GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄、GST-M2e和GST对照的12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
(2)准备与凝胶大小相同的6张滤纸和1张混合硝酸纤维素滤膜。
(3)将3张滤纸和硝酸纤维素滤膜依次置于电转移装置阳极平板，并浸泡于转移缓冲液(转移缓冲液的配制：称取11.17g甘氨酸，2.42gTris碱，加水至800ml，用浓盐酸调pH至8.0，再加入200ml甲醇)中。
(4)将电泳完毕的凝胶置于硝酸纤维素滤膜上，上面覆以3张滤纸和电转移装置阴极平板。在电转移槽中加入转移缓冲液。以恒压14V电转移8小时以上。
(5)转膜完成以后，用10×丽春红染色液(10×丽春红染液配方：丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水至100ml)标记蛋白并切带。将切下的硝酸纤维素膜置于含1％脱脂奶粉的PBS溶液中室温条件下封闭2小时以上。
(6)与经PBS溶液稀释的M2e表位特异性的单克隆抗体(5μg/ml，该单克隆抗体按照刘万里、邹鹏、陈应华，Monoclonal antibodies recognizing EVETPIRNepitope of influenza A virus M2 protein could protect mice from lethalinfluenza A virus challenge，Immunology letters 2004，93：131-136的方法制备)室温条件下反应30分钟。用PBS溶液漂洗膜三次，每次10分钟。
(7)加入经PBS稀释的浓度为1μg/ml二抗(共价耦联辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig-HRP(购自DAKO))溶液室温条件下避光反应30分钟。PBS溶液漂洗膜三次，每次10分钟。
(8)加入新鲜配置的底物溶液，避光反应，当观察到蛋白带显色比较明显时将膜从底物溶液(底物溶液：将6mg DAB(3，3’-二氨基联苯胺，Sigma)溶于10ml PBS中，加入15μl 30％的H₂O₂，混合均匀即可使用)中取出并用去离子水漂洗以终止反应，拍照保存。
结果如图2所示，表明GST-(M2e)₁₆、GST-(M2e)₄和GST-M2e均能够被M2e表位特异性的单克隆抗体识别，具有良好的免疫原性。图2中，泳道1、2、3和4分别表示GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆。
实施例2、GST-(M2e)₁₆诱导的抗体水平实验
图3用图例形象地表示GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆中M2e的表位密度情况，用M0、M1、M4和M16分别表示GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆。
按照如下方法进行小鼠(BALB/c)和新西兰白兔作为动物模型的免疫实验：
雌性Balb/c小鼠16-20克共32只，随机均分成四组，用免疫原(GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄或GST-(M2e)₁₆)分别腹腔免疫8只小鼠。每只小鼠第一次注射完全福氏佐剂(PIERCE公司产品)1∶1乳化的PBS稀释的重组免疫原50μg，免疫体积200μl进行首次皮下多点(4点)注射免疫，每点皮下注射50μL。以后每隔两个星期免疫一次，后两次免疫使用不完全福氏佐剂乳化，免疫剂量不变。免疫前和每次免疫后15天从尾静脉取血。雌性新西兰白兔1.7-1.9kg，每种免疫原用皮下免疫三只兔子。每只兔子第一次注射完全福氏佐剂(PIERCE公司产品)1∶1乳化的PBS稀释的重组免疫原200μg，免疫体积1000μl进行首次皮下多点(4点)注射免疫，每点皮下注射250μL。以后每隔两个星期免疫一次，后两次免疫使用不完全福氏佐剂乳化，免疫剂量不变。免疫前和每次免疫后20天从耳缘静脉取血，最后一次免疫后20天通过颈动脉放血获得大量的血清。
用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定得到的血清针对M2e表位多肽的识别：
M2e表位多肽(由美国Genemed Synthesis公司合成，San Francisco，CA，USA)，其氨基酸序列为N-KSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-C，将M2e多肽包被在固相的聚苯乙烯ELISA板上(购自Costar)，以每次免疫后15天采血获取的抗血清作为第一抗体与抗原室温反应1小时；PBS-Tween(0.05％Tween，购自Sigma)洗涤，不结合的抗体被洗掉；共价耦联辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig-HRP做为显色二抗(购自DAKO)；PBS-Tween洗涤后，加入生色底物邻笨二胺(OPD，购自Sigma)；最后用酶标仪(购自Bio-Rad，model550)测量450nm下的吸光度。结果如图4A-图4F所示，表明无论在小鼠模型还是在新西兰白兔模型中，GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆诱导的抗血清能够识别流感病毒M2蛋白胞外区的M2e表位多肽。GST-(M2e)₁₆在相同的免疫剂量的情况下，能够诱导出显著增强的M2e表位多肽特异性的免疫应答；小鼠初次免疫后15天(兔20天)，GST-(M2e)₁₆诱导的M2e特异性的抗体滴度超过了1∶1600，而包含较低的M2e表位密度的融合蛋白GST-(M2e)₄，GST-M2e诱导的M2e特异性的抗体滴度都没有超过1∶400(图4A，图4D)。新西兰白兔二次免疫后20天(小鼠15天)，GST-(M2e)₁₆诱导的M2e特异性的抗体滴度超过了1∶25600，而融合蛋白GST-M2e诱导的M2e特异性的抗体滴度仅仅接近1∶1600(图4B，图4E)。在第三次免疫后，在新西兰白兔中GST-(M2e)₁₆诱导的M2e特异性的抗体滴度超过GST-M2e诱导的M2e特异性的抗体滴度十倍以上；在小鼠中GST-(M2e)₁₆诱导的M2e特异性的抗体水平也明显得超过GST-M2e诱导的M2e特异性的抗体水平(图4C，图4F)。
实施例3、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆诱导的兔血清M2e特异性抗体浓度以及识别流感病毒天然M2蛋白的实验
1、使用M2e表位多肽特异性的亲和层析柱鉴定GST-(M2e)₁₆，GST-(M2e)₄，GST-M2e诱导的兔抗血清中M2e表位多肽特异性抗体浓度的实验
亲和层析柱的制备的原理和步骤：利用Pharmacia公司的柱材产品Sepharose4-FAST上的活性基团NHS-易于与M2e表位多肽氨基酸的NH₂-基团结合发生反应并且相对稳定的耦联在一起的特点完成亲和层析柱的制备。
(1)吸取1ml的NHS-activated_Sepharose4-FAST柱材(Pharmacia公司)，将2mg的M2e表位多肽(由美国Genemed Synthesis公司合成，San Francisco，CA，USA；其氨基酸序列为N-KSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-C)用去离子水溶解。用1mM的HCl激活柱材上的NHS基团。
(2)将柱材置于1ml的0.1M NaHCO₃(PH7.7)中，加入溶解后的2mg的M2e表位多肽，轻轻震荡0.5小时，而后在摇床上摇动过夜。
(3)将离心后的柱材中加入1ml的0.5M Tris-0.5M NaCl(PH8.3)，封闭2个小时，以封闭尚未反应的NHS基团，离心用20％乙醇洗数遍后备用。
经过预实验证明，制备的M2e特异性的亲和柱能够彻底的吸附1ml的兔血清中所有的M2e特异性的抗体，而且此亲和柱的重复使用的效率高。
兔血清中M2e表位多肽特异性抗体浓度的测定步骤如下：
(1)使用5ml超纯水和5mlPBS(pH7.2)清洗原来保存在20％乙醇中的M2e表位多肽特异性的亲和柱。
(2)将GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆免疫获得的兔血清1ml，在12000g的条件下高速离心5分钟，用4ml PBS(pH7.2)稀释5倍，用0.45μm滤膜过滤。
(3)滤过的血清通过M2e特异性亲和柱，流速为30ml/h(在4℃冰箱中过柱，以尽量减少蛋白变性)，重复上样一次。
(4)5-10ml PBS(pH7.2)溶液洗柱，去除大部分非特异性吸附的蛋白。
(5)在FPLC系统(Pharmacia)监控下，继续用PBS(pH7.2)平衡亲和柱，利用0.15mM的甘氨酸溶液(pH2.5)洗脱吸附的M2e特异性的抗体。
(6)利用FPLC系统监控洗脱M2e特异性抗体的洗脱峰，利用FPLC系统软件积分获得此洗脱峰对应的M2e特异性抗体的质量(μg)。
(7)用此质量的大小除以用于初始上样的初始1ml兔血清就能够得到兔血清中M2e表位多肽特异性的抗体浓度(单位μg/ml)。
结果如图5所示，表明GST-(M2e)₁₆在初免后20天，第二次免疫后20天，第三次免疫后20天，每次都在兔血清中诱导了比较高的M2e表位多肽特异性的抗体浓度，而且要明显得高于融合蛋白GST-(M2e)₄，GST-M2e诱导的M2e特异性的抗体的浓度；在第三次免疫后20天采集的血清中的浓度高达420μg/ml。图5中，M0、M1、M4和M16分别表示GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆。
2、流式细胞标记检测法(FACS)检测流感病毒融合蛋白疫苗诱导兔血清对流感病毒天然M2蛋白的识别
在10⁷-10⁸个MDCK细胞(购自美国菌种保藏中心，ATCC)中接种10⁵-10⁶的流感病毒A/wuhan/359/95(A/wuhan/359/95是人甲型流感病毒(H3N2亚型)的代表毒株之一，常为球型，直径80-120nm。负链RNA病毒，基因组全长为13.6Kb，在病毒复制周期中明确的蛋白产物有10个，见《流行性感冒病毒及其实验技术》，郭元吉，程小雯著 中国三峡出版社)，34摄氏度培养18小时；而后将流感病毒感染后的在细胞表面大量表达M2蛋白的MDCK细胞(Nature Medicine 1999，5：1157-1163)，与PBS以及使用GST、GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆第三次免疫新西兰白兔后20天的1∶400稀释度抗血清分别室温共浴1小时；使用FITC标记的羊抗兔Ig-FITC(购自DAKO，Danmark)作为发光二抗，用FACSCalibur(购自BD Biosciences，Pharmingen)检测识别情况。结果如图6A-图6B所示，表明经过三次免疫后带有M2e表位的融合蛋白诱导的抗血清(1∶400)能够识别流感病毒天然的M2蛋白(曲线3、4、5)，其中GST-(M2e)₁₆诱导的抗血清(曲线5)识别流感病毒天然M2蛋白的能力显然高于融合蛋白GST-(M2e)₄，GST-M2e诱导的抗血清(分别是曲线4和3)。图6A-图6B中，曲线1是PBS与流感病毒天然M2蛋白的识别结果，曲线2是GST对照蛋白诱导的抗血清与流感病毒天然M2蛋白的识别结果，曲线3、4、5分别是含有M2e表位序列的融合蛋白GST-M2e、GST-(M2e)₄和GST-(M2e)₁₆诱导的抗血清与流感病毒天然M2蛋白的识别结果。
实施例4、GST-(M2e)₁₆能够100％的防护小鼠免受致死剂量的流感病毒的攻击
对实施例2中第三次免疫后15天的所有四组小鼠(BALB/c)以致死剂量(约10000个活病毒粒子)的小鼠致死型流感病毒(A/PR/8/34)(A/PR/8/34是人甲型流感病毒(H1N1亚型)的代表毒株之一，常为球型，直径80-120nm。负链RNA病毒，基因组全长为13.6Kb，在病毒复制周期中明确的蛋白产物有10个。把A/PR/8/34病毒在小鼠(Balb/c)中传代适应，使小鼠发病死亡可以得到小鼠致死型的鼠肺适应株，见《流行性感冒病毒及其实验技术》，郭元吉，程小雯著 中国三峡出版社)进行病毒攻击。在攻击后的30天内每天记录所有小鼠的体重变化，和死亡小鼠的数目。结果如图7和图8所示，使用GST阴性对照组和只含有一个M2e表位的融合蛋白GST-M2e免疫的所有小鼠在攻毒后，体重明显减轻，并且在攻毒后10天内完全死亡；含有较低的M2e表位密度的融合蛋白GST-(M2e)₄免疫的小鼠在致死剂量的攻击后，虽然有50％的存活率但是体重下降明显；而使用GST-(M2e)₁₆免疫的小鼠不仅能够100％地抵御致死剂量致死性流感病毒(A/PR/8/34)的攻击，而且在进行病毒攻击后小鼠的体重没有明显得降低。小鼠攻毒实验为GST-(M2e)₁₆的有效性提供了最直接的证据，以上的所有实验结果表明本发明提出的新型流感病毒融合蛋白疫苗有良好的应用价值，将在流感防治中发挥重要的作用。
                            序列表
<160>5
<210>1
<211>645
<212>PRT
<213>流感病毒属人流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>1
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
Gly Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
225                 230                 235                 240
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu
                245                 250                 255
Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn
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Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
        275                 280                 285
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser
    290                 295                 300
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
305                 310                 315                 320
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu
                325                 330                 335
Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser
            340                 345                 350
Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
        355                 360                 365
Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser
    370                 375                 380
Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg
385                 390                 395                 400
Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu
                405                 410                 415
Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            420                 425                 430
Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
        435                 440                 445
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu
    450                 455                 460
Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn
465                 470                 475                 480
Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
                485                 490                 495
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser
            500                 505                 510
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
        515                 520                 525
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu
    530                 535                 540
Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser
545                 550                 555                 560
Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
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Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser
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Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg
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Cys Asn Asp Ser Ser Asp Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu
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Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
625                 630                 635                 640
Arg Ser Ile Leu Leu
                645
<210>2
<211>1938
<212>DNA
<213>流感病毒属人流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>2
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gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa    420
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gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa    540
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agatctattc tactgtaa                                                1938
<210>3
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ggatccatgt ccctgctgac tgaagttgaa actccgatcc gtaacgaatg gggttgccgt    60
tgcaacgact cctccgacag atcttgataa ctcgag                              96
<210>4
<211>768
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>
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ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa    120
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gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa    420
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<210>5
<211>614
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>5
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