促红细胞生成素在预防或治疗心力衰竭中的用途.pdf

本发明提供了促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、或其衍生物或功能性类似物在制备用于预防和/或治疗患有心力衰竭或具有患心力衰竭的危险的患者的药物中的用途。

1、  促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物在制备一种用于预防和/或治疗患有心力衰竭或具有患心力衰竭的危险的患者的药物中的用途。

2、  权利要求1的用途，其中所述患者是非贫血患者。

3、  治疗患有心力衰竭或具有患心力衰竭的危险的患者的方法，所述方法包含将促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物施用于所述患者的步骤。

4、  权利要求4的方法，其中所述患者是非贫血患者。

5、  权利要求1或2的用途或权利要求3或4的方法，其中所述患者患有心肌梗死、冠心病、心肌炎、化疗、酗酒和心肌病、高血压、心脏瓣膜病包括二尖瓣关闭不全和主动脉瓣狭窄、以及甲状腺疾病或具有患以上疾病的危险。

6、  权利要求1、2或5中任一项的用途或权利要求3至5中任一项的方法，其中所述促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物是由至少表达腺病毒E1A蛋白的宿主细胞产生的。

7、  权利要求6的用途，其中所述宿主细胞衍生自PER.C6^TM细胞。

8、  治疗患有慢性和/或急性冠脉综合征或具有患慢性和/或急性冠脉综合征的危险的患者的方法，所述方法包含将促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物施用于所述患者的步骤，特征在于所述促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物是由至少表达腺病毒E1A蛋白的宿主细胞产生的。

9、  权利要求8的方法，其中所述宿主细胞衍生自PER.C6^TM细胞。

10、  权利要求8或9的方法，其中所述患者是非贫血患者。

11、  权利要求8至10中任一项的方法，其中所述冠脉综合征选自心肌缺血、心肌梗死或心衰。

12、  一种药物制剂，包含促红细胞生成素、或其功能性部分、衍生物和/或类似物以及选自他汀类或血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)中的一或多种化合物。

13、  治疗患有急性冠脉综合征或具有患急性冠脉综合征的危险的患者的方法，所述方法包含在所述急性冠脉综合征发作后的24小时内将促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物施用于所述患者的步骤。

14、  治疗患有慢性和/或急性冠脉综合征的不良反应或具有患慢性和/或急性冠脉综合征的不良反应的危险的患者的方法，所述方法包含将促红细胞生成素、或其功能性部分、衍生物和/或类似物施用于所述患者的步骤，其中所述不良反应选自心肌将嘌呤释放至冠脉流出液、心肌细胞凋亡和心肌细胞坏死。

15、  促红细胞生成素、或其功能性部分、衍生物和/或类似物用于刺激心脏毛细血管的血管生成的用途。

促红细胞生成素在预防或治疗心力衰竭中的用途
技术领域
本发明涉及医学领域，更具体地，本发明涉及对哺乳动物的组织缺氧相关性疾病进行治疗以及其中所用的化合物和药物制剂。
背景技术
心力衰竭(cardiac failure)是一种慢性临床综合征，其特征在于心脏不能充分地将血液泵至全身。一般而言，导致心力衰竭的原因可以是任何引起心肌组织(特别是左室的心肌)减少的疾病或病症。最常见的原因包括心肌梗死、冠心病、心肌炎、化疗、酗酒和心肌病。另一方面，引起心力衰竭的原因可以是那些导致对心输出量要求过高的疾病或病症。其中最常见的原因包括高血压、心脏瓣膜病(最常见的为二尖瓣关闭不全和主动脉瓣狭窄)以及甲状腺疾病。对心脏的长期的、额外的需求将引起心肌细胞的代偿性肥大。由于毛细血管网无法相应地延伸、心肌肥厚会导致氧的扩散距离延长，因此引起心肌相对缺血。近来，已经注意到缺血在心力衰竭中的重要作用(Van den Heuvel等，2000)。
迄今，对于患有导致心力衰竭的缺血性心脏病及其并发的心肌损伤的病人的治疗仍旧集中在早期再灌注(early reperfusion)方面。尽管额外的细胞保护治疗或许——在理论上——能够减轻心肌缺血引起的损伤并因此降低发病率和死亡率，但至今还没有充分可靠的治疗。目前所采用的对处于急性缺血情况下的心肌进行保护的额外的支持治疗为施用β-阻滞剂、钙拮抗剂和硝酸酯类。不过，这些治疗的功效很低，因此亟需一些替代性和/或额外的治疗策略。
附图说明
图1：EPO-R mRNA的实时RT-PCR。使用限制性内切酶(NciI)将72bp的EPO-R产物部分消化为预期的片段(39bp和34bp)，由此核实其特异性。
图2.Western印迹。条带1-3：假处理的心脏的MAPK(pERK1＝44kD；pERK2＝42Kd)；条带4-6：EPO处理的心脏的MAPK；条带7：假处理的心脏的EPO；条带8：假处理的心脏的EPO-R。
发明内容
本发明提供了促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、或其衍生物或功能性类似物在制备用于预防和/或治疗患有心力衰竭或具有患心力衰竭的危险的患者的药物中的用途。无论这些病症的原因或性质如何，EPO治疗均可产生有益的作用。本发明还提供了用于治疗患有心力衰竭或具有患心力衰竭的危险的患者的方法，所述的方法包含给所述患者施用促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物的步骤。在本发明的一个方面，所述患有心力衰竭的患者不是贫血患者。尽管近来的临床研究发现EPO在同时患有贫血的充血性心衰(CHF)的患者中具有有益的作用(Silverberg等，2000和2001)，但在本发明之前，除非存在特定的指征如贫血、肾脏疾病或白血病，否则本领域技术人员不会使用EPO来治疗患有心衰的患者。一部分CHF患者存在贫血(血细胞比容(hematocrit)降低/血红蛋白含量降低)且在CHF的严重程度与贫血程度之间存在相关性。使用重组EPO治疗患有CHF的贫血患者可以观察到心功能和肾功能的改善，以及对使用利尿剂和住院治疗的需要的下降(Silverberg等，2000和2001)。其他一些出版物(EP0813877；Mancini等，2001)也描述了使用EPO来提升充血性心衰患者的红细胞和/或预防贫血。目前看起来，经EPO治疗的心脏病患者的病情改善的原因在于，当患者存在需要使用EPO进行治疗的情况时，EPO使得血细胞比容升高，由此通过与心功能的改变无关的机制而改善了周围组织的氧合。本发明首次揭示将EPO用于治疗心衰，而无论病人的血细胞比容值(红细胞计数)是否低于正常。这使得心力衰竭本身成为使用EPO的一种新的指征。因此本发明提供了EPO在治疗心衰病人中地用途，其中所述病人不必具有除心衰以外的其他的基于现有知识需要使用EPO进行治疗的指征。在特定的实施方式中，已经用至少表达腺病毒E1A蛋白的宿主细胞产生促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物，优选地使用衍生自PER.C6^TM细胞的宿主细胞。
本发明还提供了用于治疗患有慢性和/或急性冠脉综合征或具有患慢性和/或急性冠脉综合征的患者的促红细胞生成素、或其功能性部分、衍生物或功能性类似物。优选地，所述EPO是由至少表达腺病毒E1A蛋白的宿主细胞产生的，更优选地是由衍生自PER.C6^TM细胞的宿主细胞产生的。尽管已经披露EPO可用于在急性缺血性损伤中保护心肌(见WO00/61164，WO 01/82952)，但使用EPO可同时引起血细胞比容值显著升高，这对于本申请来说会被视为一种不良反应。使用衍生自PER.C6^TM或其他表达E1A的宿主细胞的EPO可降低这种不良反应，因此是有益的(参见PCT/NL02/00686，其证实由PER.C6^TM产生的EPO是有功能的，但与一种商品化的EPO制剂(EPREX)相比，其引起的血细胞比容值升高的程度较低)。
本发明进一步提供了促红细胞生成素、或其衍生物或功能性类似物在制备一种用于预防和/或治疗慢性和/或急性冠脉综合征的药物值用途。本发明还提供了用于此类治疗的、包含EPO、或其衍生物或功能性类似物的药物学上有效的制剂。
此外，本发明提供了用于治疗患有慢性或急性冠脉综合征的不良反应或者具有患慢性或急性冠脉综合征的不良反应的患者的方法，包含给该患者施用促红细胞生成素、或其衍生物或类似物，施用的量足以预防或减少所述的不良反应。可以被本发明的化合物降低和/或抑制的不良反应包括多种有害反应例如心肌细胞的凋亡和/或坏死。在这些细胞上产生的作用最有可能是通过本发明的化合物与这些细胞上的受体之间的相互作用而产生的。由本发明的化合物产生的直接作用还包括血管形成作用(angiogenic effects)，由此在急性和慢性病例中均可减轻某些低氧相关性冠脉综合征的严重程度。
具体实施方式
在此为方便起见，在合适的情况下，将促红细胞生成素(EPO)、EPO衍生物和功能性类似物简称为“EPO”。EPO在造血干细胞分化为红细胞中所起的作用已经为人所熟知，但EPO还具有多种其他的功能。本申请揭示了心脏中存在一种新的EPO和EPO受体(EPO-R)系统，根据本发明，通过给患有心衰的患者施用EPO而将这一发现转化为实际用途。
心力衰竭也称为心衰，或慢性心衰或充血性心衰，是指一种心脏疾病，其中心脏所泵出的血液不能满足组织代谢的需求，或者心脏仅在其充盈压升高的情况下才能达到该需求。根据本发明，使用EPO治疗心衰包括治疗那些患有以下疾病或者具有患以下疾病的危险的患者，所述疾病是指心肌梗死、冠心病、心肌炎、化疗、酗酒、心肌病、高血压、瓣膜性心脏病(最常见的为二尖瓣关闭不全和主动脉瓣狭窄)以及甲状腺疾病等等。
本发明的患者可以是患有心衰的人，但也可以包括动物。因此，本发明的治疗可以涉及人以及其他的动物物种。
在此，非贫血患者是指该患者的血红蛋白值处于正常范围内，而医生不会根据该值给该患者使用EPO。迄今为止，EPO的应用还限于用来在特定的患者群体中预防或纠正贫血，包括慢性肾功能不全的透析阶段或非透析阶段、抑制细胞生长的治疗期间、早产儿以及为进行自体输血或预计可能大量失血的外科情况做准备。在这些情况中，共同的目的在于根据个体需要采用标准的剂量方案，通过将红细胞数量(血细胞比容)增加到一个特定范围，从而提高血红蛋白水平(Hb)。根据患者群体的不同，理想的Hb水平的范围在低限为6.5-7.5mmol/L至高限为8.0-8.7mmol/L之间。
根据本发明的一个方面，用于治疗心肌疾病所施用或配制的EPO可以分离自任何合适的来源。优选地，人EPO是重组产生并自合适的重组宿主细胞中和/或自培养基中分离得到的。对于重组产生EPO，宿主细胞可适当地选自能够重组产生蛋白质的任何细胞，例如细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、酵母(如酿酒酵母(S.cerevisiae)，乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、真菌(如黑曲霉(A.niger)，毕赤酵母(Pichia))、哺乳动物细胞(如CHO，BHK)包括人类细胞。根据本发明的一个方面，EPO是用一种永生的人类细胞系重组产生的，具体使用的是PER.C6^TM(ECACC保藏号96022940)。根据本发明，也可以以基因治疗的策略施用EPO，例如用包含一种输送至靶细胞后能够表达EPO的核酸序列的载体处理患者。
EPO的衍生物是指对源EPO(source EPO)进行修饰，其可以是尿液中的EPO，或自cDNA或基因序列重组产生的EPO，其中的表达产物相对于源EPO具有一或多个修饰，所述的修饰可以是发生于主体结构上的一或多个氨基酸的取代(如发生于NESP中)、一或多个氨基酸残基的缺失、添加或换位(relocation)，或者是对蛋白骨架的翻译后或围翻译阶段的修饰(post-or peri-translational modification)，例如氨基酸的羟基化、磷酸化或糖基化、二硫键形成，等等。衍生物还函盖了天然存在的或非天然产生的偶联于非EPO相关性蛋白质部分、甚至是非蛋白质部分的EPO变体。本发明函盖了EPO的衍生物，条件是这些EPO衍生物能够与EPO受体相互作用并可降低或预防由慢性或急性冠脉综合征所引起的或者由一般意义上的心脏缺氧情况所引起的不良反应，所述的慢性或急性冠脉综合征包括但不限于心肌缺血、心肌梗死或心衰。可将测定心脏组织的凋亡和/或坏死程度和/或由冠脉流出的血流中的嘌呤水平作为检测出现所述不良反应的手段，或可通过其他本领域已知的方法。
EPO的功能性类似物所指的分子不一定是由天然存在的或非天然产生的EPO衍生而来，所述EPO的功能性类似物能够模拟EPO与其受体的相互作用，由此降低和/或预防由慢性或急性心肌缺血或心肌梗死所引起的或者由一般意义上的心脏缺氧所引起的不良反应。此类功能性类似物可包含模拟与EPO-R相互作用的独特位(idiotope)的肽拟似物(peptidomimetic)和/或非肽分子。本领域人员可以明了，只要能够模拟EPO与其受体的相互作用，本发明的功能性类似物不一定需要与相同的独特位发生相互作用或不一定以同样的方式发生相互作用。功能性类似物可适当地筛选自(合成的)肽文库、噬菌体或核糖体多肽展示文库、或小分子文库。本领域人员能够筛选或设计功能性类似物，并在本文揭示的分析方法中测试其功能。处理基于凋亡和/或嘌呤测定的分析方法，其他的方法例如本领域熟知的检测细胞坏死的方法等，也可用来测试类似物的降低和/或预防缺氧引起的不良反应的功能。
EPO可以任何药物学可接受的形式施用于哺乳动物。通常，EPO可经胃肠外或皮下(sc)施用，但施用途径也在不断变化。如果需要获得快速起效，可以通过已知的方式加以大剂量形式的EPO以便将药物快速输送至心脏。明显需要如此治疗的情况例如为，患者患有一些急性病症如急性心肌缺血、心肌梗死或急性心衰。在这些情况下，施用的剂量通常高于给患有贫血或患有慢性冠脉综合征的病人所施用的剂量(Silverberg等，2000和2001)。施用于肾功能衰竭的成人患者的常规剂量的范围为每周4000-7500IU(体重80-100kg)。对于商品化的Epoetin alpha或Eprex(由CHO细胞产生的EPO)，该剂量通常按照每周3次进行平均分别施用。用于治疗急性冠脉疾病的剂量则更高，且可以每天一次或更频繁的施用。必须确定最大的可耐受剂量，以避免血细胞比容值和血红蛋白浓度升高过快。本领域人员了解如何监测患者的血细胞比容值和血红蛋白浓度，以避免出现不良的副作用，例如可能出现于治疗后期的血压急剧升高。这些施用方案与Silverberg等(2000和2001)所采用的用于治疗患有充血性心衰的贫血患者的方案相比不同，EPO的施用被延长至数周，甚至是数月。对于急性冠脉综合征，可能不需要将大剂量的治疗延长至数月，因为对于这种保护作用的需求是急迫的，而长期施用如此大的剂量可能会导致不良的副作用。对于慢性冠脉综合征，包括但不限于心肌缺血或心衰，可以较低的剂量施用更长的时间。心衰既包括急性心衰综合征如心肌梗死，也包括慢性的心脏泵功能下降的情况。这些施用剂量相当于给缺乏EPO的肾功能衰减患者所施用的剂量。非急性缺氧相关性心肌疾病所采用的剂量范围在每次施用10至10000IU，优选地为1000至2500IU(按体重为80-100kg的成人计算)。在这种情况下同样需要进行监测以避免不良的副作用。WO 00/63403还揭示，可用PER.C6^TM细胞重组产生EPO。最近揭示(见专利申请PCT/NL02/00686)，与相似剂量的目前已经商品化的EPO(EPREX)相比，如此产生的EPO在施用后引起的血细胞比容值的升高明显较低。这似乎可归因于如此产生的EPO所具有的特异性翻译后修饰，这大概与重组产生EPO所采用的宿主细胞中至少存在可表达形式的腺病毒的E1A序列有关。在本发明的用途中，施用EPO后血细胞比容值不会明显升高是有益的。区此这是使用本发明的EPO的一个优选的实施方案，由此在至少表达E1A蛋白、或其衍生物或功能性类似物(见PCT/NL02/00686)的宿主细胞中重组产生了EPO。优选地，所述的宿主细胞是PER.C6^TM细胞。根据本发明，如此产生的EPO可用于慢性和急性冠脉综合征。
EPO样蛋白质的新配方是本领域已知的。新型红系造血刺激蛋白(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein，NESP)由于其糖基化修饰的方式而具有更长的作用时间，这使得其可采用以下施用方案，即仅需要每周施用一个剂量便可取得以往用原来的重组EPO蛋白每周3个剂量所能达到的作用。NESP也可以用于治疗急性或慢性冠脉综合征，其可以按照与上述EPO类似的方式施用，即对于急性冠脉综合征用较大的剂量(且可更加频繁施用)，而对于慢性心衰则采用相当的剂量(且施用频率相同)。尚需要进一步观察的是，与EPO相比，NESP的修饰的糖基化作用是否对心肌细胞和心脏血管的内皮细胞上表达的EPO-R产生不同的影响。
本发明的药物学可接受的配方典型地包含本发明的EPO，通常连同药物学可接受的赋形剂、稀释剂、溶剂，并任选地包含起到添加剂甚至协同剂(synergistic)作用的化合物。属于后者范畴内的化合物包含他汀类化合物，如洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)等等。
值得注意的是，通过冠脉流出血液的嘌呤分析和/或心肌内的凋亡细胞水平的测定，在皮下施用后数分钟内即可观察到本发明的EPO缺氧诱导的心肌损伤的保护作用。很难想象将这种作用归因于已知的EPO刺激血管生成作用或其造血作用，因为这些作用通常不会于数分钟内产生，而是需要数天甚至数周。因此，这促使人去推测这种在施用后数分钟内出现的EPO的细胞保护作用是由EPO对心肌组织的直接影响或与心肌的间接接触引起的。已经发现EPO-R表达于心肌细胞的细胞表面(如本发明所示)，这一点强烈提示EPO通过作用于这些受体而产生直接的抗凋亡和抗坏死作用，而EPO的血管生成作用最有可能是通过表达于毛细血管内皮细胞上的EPO-R而产生的。该作用在体外以及体内均可产生。
现结合以下实施例对本发明做进一步阐述。
实施例
实施例1.在正常人和大鼠的心脏组织中检测EPO和EPO-R
已经发现，EPO和EPO-R表达于胎儿心脏组织中(Juul等1998)。尽管有关EPO及其受体的表达及推测其相关作用的文献与日俱增，但对EPO和EPO-R在成人心脏组织中的分布却所知甚少。
通过对大鼠心脏组织进行实时RT-PCR、western印迹和免疫组化以及对人心脏活检组织进行western印迹和免疫组化来检测EPO和EPO-R的表达。
大鼠心脏(Langendorff装置)
为此，将分离的大鼠心脏悬置于称为Langendorff装置(Van Gilst等1988)，在施用或不施用EPO的情况下，采用本领域人员已知的方法进行缺血/再灌注(I/R)实验。
将体重大约为300克的雄性Sprague Dawley大鼠(n＝12)分为4个实验组。其中2个组通过将冠脉血流降低至0.6ml/分钟达30分钟，继而进行再灌注达45分钟，造成整体心脏缺血。另外2个组不发生缺血。各组中，半数大鼠接受EPO(10U/ml)处理，而另一半大鼠接受盐水处理。将大鼠麻醉并自尾静脉注射500U肝素。迅速将心脏取出并立即自主动脉逆行灌注改良的Tyrode溶液(葡萄糖10，NaCl 128.3，KCl 4.7，NaHCO₃20.2，CaCl₂ 1.35，NaH₂PO₄ 0.42，MgCl₂ 1.05；均为mmol/l)并以95％O₂和5％CO₂进行平衡。灌注压保持于60mmHg。冠脉流量(CF)通过微处理器进行测量，该微处理器通过调整蠕动灌注泵而控制灌注压。连续监测CF、心率(HR)和左心室峰压。平衡5分钟后，以EPO或盐水灌注心脏20分钟，然后进行所述I/R方案。
实时RT-PCR
自大鼠左心室分离总RNA并按照如前所述(Brundel等，1999)进行处理。简言之，将1μg的RNA在逆转录缓冲液中进行孵育而合成cDNA，所述逆转录缓冲液加入200ng的随机6聚体和200U的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，1mmol/L的每种dNTP，和1U的RNase抑制剂(Promega)。合成反应如下进行：20℃ 10分钟，42℃ 20分钟，99℃ 5分钟，以及4℃ 5分钟。检测所有产物是否存在DNA污染。以GeneAmp5700(Perkin-Elmer/ABI)扩增EPO-R片段(正向引物：CAGGACACCTACCTGGTATTGGA；反向引物：CAGGCCCAGAGAGGTTCTCA，eurogentec，Belgium)，方案为94℃ 30秒，56℃ 1分钟，以及72℃ 30秒，共40个循环。最后一个循环后，将72℃的延伸步骤延长至5分钟。以SYBR-green I检测PCR产物。测定来自正常大鼠的心脏组织和来自体外经历30分钟缺血过程的组织的心脏样品的EPO-R，所述样品经过或未经过EPO处理。
为了证实产物的特异性，将扩增得到的片段以限制性酶NciI处理3小时进行部分消化，并在2.5％琼脂糖凝胶上电泳分离，并以溴化乙啶(ethidium bromide)染色。限制性分析证实，所得产物被切成预期大小的2个片段(34和39bp，图1)。
与EPO-R形成对照的是，用Neumcke等(1999)所述的实时RT-PCR方法，我们未能在大鼠心脏中检测到EPO mRNA(不过，相同的PCR反应在脑组织中得到阳性结果)。
Western印迹
按照标准方法(Brundel等，1999)，用来自大鼠心脏左心室的乳头正中切片(midpapillary slice)进行Western印迹，大鼠心脏被迅速冷冻于液氮中。简言之，将1ml冰冷的蛋白裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂加入到冷冻的LV组织(约50mg)中，进行组织匀浆。将匀浆物在4℃以14000rpm离心20分钟，将上清液转移至干净试管中，冰上放置。以标准蛋白分析法测定蛋白浓度(Bio-Rad蛋白分析，Bio-Rad，Richmond，CA)。取蛋白样品(50μg)在7.5％聚丙稀酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，然后使用湿转移体系将蛋白转移至PVDF膜上(100mA转移3小时)。将该膜在Tris缓冲盐溶液中封闭20分钟，该Tris缓冲盐溶液含有0.04％Tween 20和5％脱脂奶粉，然后在含有0.04％Tween 20的Tris缓冲盐溶液中与第一抗体孵育3小时；兔多克隆抗EPO-R抗体(C20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和抗EPO抗体(H-162，Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)按照1∶100进行稀释，而小鼠单克隆抗磷酸化ERK1/ERK2抗体(#9106S，New England Biolabs，Beverly MA)按照1∶1000稀释。将膜与HRP缀合的第二抗体孵育1小时，然后以ECL试剂盒(Amersham)显色。我们的结果显示，在Langendorff灌注心脏中，EPO和EPO受体(EPO-R)在蛋白水平均有表达(图2)。EPO和EPO-R的表达水平似乎均不受缺血再灌注以及施用EPO的影响。在下一个实验中，将大鼠心脏在体内暴露于10U/ml EPO达20分钟。用Western印迹法，我们发现磷酸化的MAPK升高，特别是ERK1，而ERK2升高的程度较低(图2)。
总之，Western印迹证实心脏中存在EPO及其受体。我们在心脏组织中发现了EPO-R mRNA，但未能检测到EPO mRNA，提示EPO不是在局部产生的。
最后，我们发现EPO改变了磷酸化的MAPK的水平，特别是pERK-1，因此提示EPO-R在心脏组织中具有功能。由于受到细胞外调控的激酶途径(ERK1/2)被认为是应答于肥大刺激因素和应激刺激的心脏肥大和心肌细胞存活的重要调控因素(Bueno和Molkentin，2002)，这强烈提示EPO在治疗心衰中具有用途。
免疫组化
为评价EPO和EPO-R在大鼠心脏中的表达模式，自对照组大鼠取得完整的心室正中(mid-ventricular)心肌切片。将组织切片固定并石蜡包埋，切成大约3μm的组织切片，经脱蜡并用梯度乙醇再水化(rehydratedwith graded ethanol)。采用免疫组化领域人员熟知的实验方法，将切片与抗EPO-R抗体(C20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和抗EPO抗体(H-162，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)一起孵育。采用两步骤的间接过氧化物酶检测系统来观察EPO和EPO-R的表达模式。所有孵育均在室温下进行，并以不加第一抗体的样品作为阴性对照，同步进行检测。通过在非缺血大鼠心脏组织中进行免疫组化染色，在若干大鼠(n＝4)中发现存在EPO表达，其中EPO的表达似乎局限于细动脉和毛细血管。在心肌细胞或纤维细胞中未见EPO表达。EPO-R的表达也主要局限于细动脉和毛细血管，不过心肌细胞显示具有EPO-R的弱染色。
这些发现进一步提示EPO和EPO-R可能在血管生成中起作用。
人类心脏
经福尔马林固定和石蜡包埋的人类心脏的切片是通过常规活检而获得的(Dept.Pathology，Academic Hospital Groningen)。无心脏病理情况的正常活检材料来自至少10个个体。按照上述针对大鼠心脏组织的方法，对这些材料进行Western印迹和免疫组化分析。
实施例2.EPO在急性缺血发作中的作用
EPO受体(EPO-R)以高浓度表达于神经组织(Digicaylioglu等1995；Juul等1997)。WO 00/35475揭示，施用促红细胞生成素(EPO)可减轻因脑缺血导致的(暂时性)组织缺氧所引起反应。Digicaylioglu和Liptyon(2001)发现，以EPO进行预处理可保护缺血损伤模型中的神经元并防止凋亡。如本文所述，EPO和EPO-R在心脏组织中也有表达。因此，易于遭受组织缺氧影响的心脏组织也可从EPO治疗中获益(见例如WO 00/61164、WO 01/82952)。
对于心脏组织发生缺血的情况，可测定凋亡以及自心脏释放的嘌呤以确定EPO对缺血心脏的作用。为此，将分离的大鼠心脏悬置于称为Langendorff装置(Van Gilst等1988)，在施用或不施用EPO的情况下，采用本领域人员已知的方法进行缺血/再灌注(I/R)实验。优选地，根据WO 00/63403所述，采用蛋白质产生和分离领域已知的纯化方法(见PCT/NL02/00686)，获得重组EPO。或者，也可以使用商品化的Epoetinalpha(Eprex)作为源EPO。设立4个不同的实验组，每组有8只SpragueDawley(SD)大鼠。每只大鼠体重大约为250克。这些实验组为：
-无I/R处理，无EPO处理的SD大鼠
-无I/R处理，有EPO处理的SD大鼠
-有I/R处理，无EPO处理的SD大鼠
-有I/R处理，有EPO处理的SD大鼠
将大鼠麻醉并迅速将心脏取出。立即自主动脉逆行灌注。冠脉流量(CF)通过微处理器进行测量，该微处理器通过调整蠕动灌注泵而控制灌注压。连续监测CF、心率(HR)和左心室峰压，并储存于电脑数据库。平衡5分钟后测量基线参数。通过结扎左侧冠状动脉15分钟诱发缺血。然后，通过松解结扎造成再灌注，允许心脏恢复15分钟。
自心脏释放的嘌呤可反映心肌损伤的程度(Van Jaarsveld等1989)。收集心脏的冠脉流出液用于测定心肌释放的嘌呤。在预处理达到稳定后收集基线样品，并在15分钟的缺血后以及15分钟的再灌注后对冠脉流出液进行取样，通过高效液相层析(HPLC)测定嘌呤。通常的趋势是，与EPO处理组的动物相比，最初自非EPO处理组的动物的冠脉流出液中释放的嘌呤值较高，而随着时间延长，嘌呤值的下降较慢。
实验结束时，将心脏称重，并自左心室取得midpapillary切片并固定。将非梗死部位的心脏(后壁、室间隔)迅速冷冻于液氮。如上所述，使用EPO和EPO-R的抗多克隆抗体测定两种蛋白质的表达。
如下进行凋亡的检测。将石蜡包埋的组织块的切片置于盖玻片上以原位检测凋亡细胞。采用ApopTag原位凋亡检测试剂盒(Oncor，Gaithersburg USA)，按照制造商的说明，通过酶促反应观察核DNA的片段化。对着色细胞的数量和分布、细胞核的形态学特征以及染色强度进行评估。
实施例3.EPO对慢性缺血模型系统的作用
诱发大鼠心肌梗死，通过测量左室压力(LVP)、梗死面积和微血管密度，来确定体内施用的EPO的作用。为此，对SD大鼠进行假手术(SH)或造成心肌梗死(MI)，并以400单位/公斤的EPO(如上)或盐水进行皮下注射，每日一次共4周。设立4个不同的实验组，每组有8只SD大鼠。每只大鼠体重约为250克。分组如下：
-假手术且无EPO处理的SD大鼠
-假手术且有EPO处理的SD大鼠
-心肌梗死且无EPO处理的SD大鼠
-心肌梗死且有EPO处理的SD大鼠
心肌梗死模型在其他文献中描述(Pinto等1993)。简言之，进行麻醉并实施左侧胸廓切开术，并在主动脉分叉后方1-2mm处以6-0丝质医用缝线结扎左侧冠状动脉，以造成MI。在假手术组，实施同样的手术，不同之处在于不进行缝线结扎。
如下测定左心室(LV)的功能。4周后将大鼠麻醉，在右侧颈动脉内置入压力传感器导管。经过3分钟的稳定期后，记录最大LVP、LV舒张末压(LVEDP)以及心率。其后，将导管回撤以测量主动脉根部的收缩压。作为整体收缩性(contractility)和舒张性(relaxation)的指数，测定了LVP上升和下降的最大速度(收缩期dP/dt和舒张期dP/dt)，并进一步将其校正为收缩期LVP峰值。
采用本领域人员已知的通用方法，通过LDH染色的组织学分析来确定梗死范围。用计算机化的求积仪(computerized planimeter)来确定左室的心外膜和心内膜总周径以及梗死区域的心外膜和心内膜疤痕长度。按照已有的详细描述(Pinto等1993)，以疤痕长度的和除以总周径的和计算出梗死范围。此外，按照如上所述测定凋亡。
如下所述(Loot等，2002)确定微血管密度。采用本领域已知的方法，将石蜡包埋的LV切片以HE(hematoxylin-eosin)染色进行组织学分析以评价梗死范围，并以RECA-1抗体染色观察微血管。测量其余心肌(相对于梗死心肌而言，通常为室间隔或后壁)的每平方毫米的微血管密度。以适用的数字成像软件记录每只大鼠的7-10帧的心肌细胞横切面的高倍视野显微图象。微循环的定义为三级小动脉以上的、直径为150μm或小于150μm、供应小动脉和小静脉之间的组织的血管分支。以图象分析软件选择具有最大表面积的具有中央核的心肌细胞，通过形态学测量心肌细胞表面积(Loot等，2002)。
实施例4.测定慢性缺血的人类心脏中EPO和EPO-R的水平
采用半定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术，在mRNA水平测定EPO和EPO-R的表达水平。为此，采用酸性硫氰酸胍(acid guanidiumthiocyanate)裂解法分离总RNA(Chomczynski和Sacchi 1987)。由此自缺血性心衰患者的组织取得RNA。采用本领域人员已知的标准技术，自右侧颈静脉或股静脉进行心脏插管，从右心室心内膜下心肌活检取得组织。通过RT-PCR进行RNA逆转录并扩增cDNA。如上所述通过实时RT-PCR检测目的cDNA和管家酶GAPDH的cDNA。
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