黄瓜抗霜霉病异源易位系的选育方法.pdf

本发明黄瓜抗霜霉病异源易位系CT－01的选育方法，专用于黄瓜抗病育种，利用甜瓜属双二倍体新种与栽培黄瓜亲本“北京截头”回交。通过根尖分生细胞染色体制片技术和抗霜霉病田间接种试验从回交后代中直接筛选染色体数目2n＝14、抗霜霉病的单株，对其自交后代进行跟踪鉴定，获得了一高抗霜霉病的黄瓜异源易位系CT－01。

1、  黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育方法，包括：
1)利用专利号ZL 00 1 12271.1，公开号：CN 1279009A，公开日：2001年1月10日获得的黄瓜双二倍体新种为父本，以普通黄瓜“北京截头”为母本，回交一代，利用根尖分生细胞染色体制片技术和抗霜霉病田间接种试验直接筛选，获得单株，该单株染色体数目2n＝14、高抗霜霉病，即霜霉病病级1.8±0.5；
2)对上述单株自交后代筛选，选择单株为高抗霜霉病，即病级为2.8±0.2，其叶面积182.1±26.1cm²、节长5.9±3.1cm、果长15.6±1.3cm、果径3.3±0.4cm，果色为深绿底色加浅绿色条纹，侧枝数7.5±4.2个、果刺颜色棕色；其花粉母细胞减数分裂过程中期I多价体频率56±8％和后期I二价体分离滞后率72±5％；
3)对所选单株用RAPD引物E-19：ACGGCGTATG和AI-20：CCTGTTCCCT在其中可重复地扩增出原始亲本野生种的特异DNA片断，片段大小为1200bp，即为获得的黄瓜异源易位系，定名为CT-01。

黄瓜抗霜霉病异源易位系的选育方法
一、技术领域
本发明涉及黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育方法，属于生物技术育种领域。
二、背景技术
十几年来，国内培育的黄瓜杂交品种亲本资源有限，甚至出现一个亲本在多个品种中重复利用的现象。因而，在目前的黄瓜育种中，特异优良种质资源的缺乏是一个亟待解决的问题，而通过远缘杂交可为黄瓜的抗病、抗虫、抗逆等特异种质资源的创新提供一个有效的途径。但远缘种属之间由于遗传或生理障碍的存在，很难杂交成功。
课题组在已取得专利《甜瓜属野生种用于黄瓜育种的方法》(专利号ZL 00 1 12271.1，公开号：CN 1279009A，公开日：2001年1月10日)中，我们通过幼胚拯救，首次把高抗霜霉病的野生种C.hystrix与栽培黄瓜杂交获得双单倍体杂种，再通过染色体加倍培育出世界上第一个甜瓜属种间杂交双二倍体新种C.hytivus。双二倍体新种C.hytivus携有野生种C.hystrix和栽培黄瓜的全套染色体组，在减数分裂过程中两套染色体组常发生交换，产生易位的n＝19和n＝7配子(Chen J，Staub J，Qian CH，et al，Reproduction and cytogeneticcharacterization of interspecific hybrids derived from Cucumis hystrixchakr.× Cucumis sativus L.Theor Appl Genet.2003，106：688～695)。利用双二倍体新种(有效配子n＝19)与栽培黄瓜回交已培育出异源三倍体黄瓜，并已申请专利《异源三倍体黄瓜的选育及其用于黄瓜育种的方法》(申请号：02148497.X，公开号：CN1413447，公开日：2003.04.30)。同时利用双二倍体新种(有效配子n＝7)与栽培黄瓜回交、自交，获得许多体细胞染色体数目2n＝14的群体。通过对这些回交自交后代进行过氧化物同工酶的分析，发现其遗传变异比普通栽培黄瓜丰富(陈劲枫，任刚，余纪柱等.甜瓜属远缘杂种回交自交群体的过氧化物酶同工酶分析.武汉植物学研究，2002，20(5)：336-337)，表明其可能已经转导了部分外源遗传物质，或者产生了异源易位系。
携带有亲缘物种有用基因的易位系可用作品种改良的亲本，具有优良遗传背景的一些易位系本身就是优良品种。目前，常用的诱导产生异源易位系的方法主要有：(1)自发产生易位；(2)利用部分同源配对诱导易位系；(3)利用电离辐射诱发染色体易位；(4)利用植物组织培养诱发易位。一般，自发产生易位系的频率较低，但遗传平衡性较好，而后三者的发生频率却相对较高。
黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉病菌Pseudoperonospora cubensis(Berk.& Curt.)Rostov引起的，是黄瓜三大病害之一，在适宜的条件下，病情发展很快，几天时间便会蔓延到全田，造成叶片发黄，枯死，产量损失大，轻者减产10％-20％，重者达30％以上，给黄瓜生产带来巨大威胁(黄仲生，张芝莉等.黄瓜病虫害识别与防治.北京：中国农业出版社.2002，31-41)。由于黄瓜遗传基础狭窄，国内外对黄瓜霜霉病的抗性材料仅集中在少数几个抗源上(汪隆植.蔬菜抗病育种学.北京：中国农业出版社.1998，142-144)，而且不同抗源材料对黄瓜霜霉病的抗性机制不同。目前存在两种研究结果，即多基因抗性和单隐性基因抗性(高利，庞金安.黄瓜主要病害抗性遗传研究进展.中国蔬菜.2004(1)：63-66)。因此，通过远缘杂交利用野生种的抗霜霉病基因，培育抗霜霉病的黄瓜异源易位系，不但可以引进新的抗源，拓宽黄瓜现有遗传基础；而且可以在生产上培育出抗黄瓜霜霉病新品种，在理论上丰富了黄瓜霜霉病抗性机制的内容。
三、发明内容
技术问题  本发明的目的是针对目前直接利用甜瓜属外源抗病基因困难、黄瓜遗传基础狭窄和抗黄瓜霜霉病抗源不足的现状，提供一套黄瓜抗霜霉病异源易位系的选育方法，获得甜瓜属抗病异源易位系，提供黄瓜抗病育种新材料，培育抗病的黄瓜新品种。
技术方案  本发明所提供的黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育方法，其实施方案如下：
1)利用专利号ZL 00 1 12271.1，公开号：CN 1279009A，公开日：2001年1月10日获得的黄瓜双二倍体新种为父本，以普通黄瓜“北京截头”为母本，回交一代，利用根尖分生细胞染色体制片技术和抗霜霉病田间接种试验直接筛选，获得单株，该单株染色体数目2n＝14、高抗霜霉病，即霜霉病病级1.8±0.5；
2)对上述单株自交后代筛选，选择单株为高抗霜霉病，即病级为2.8±0.2，其叶面积182.1±26.1cm²、节长5.9±3.1cm、果长15.6±1.3cm、果径3.3±0.4cm，果色为深绿底色加浅绿色条纹，侧枝数7.5±4.2个、果刺颜色棕色；其花粉母细胞减数分裂过程中期I多价体频率56±8％和后期I二价体分离滞后率72±5％；
3)对所选单株用RAPD引物E-19：ACGGCGTATG和AI-20：CCTGTTCCCT在其中可以重复地扩增出原始亲本野生种的特异DNA片断，片段大小为1200bp，即为获得的黄瓜异源易位系，定名为CT-01。
有益效果  本发明黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育方法，与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：
本发明是通过甜瓜属种间杂交双二倍体新种与普通黄瓜回交再自交获得的，是完全自然产生的，与诱发产生的异源易位系相比，具有较高的遗传平衡性、稳定性，能够尽快地用于黄瓜抗病育种实践。
利用田间抗霜霉病接种鉴定、农艺性状观测、细胞学和RAPD分子标记等技术进行黄瓜异源易位系的综合鉴定，把传统方法和现代分子生物学手段有机地结合在一起，鉴定技术较为全面，可信度较高，对甜瓜属异源易位系的鉴定具有重要的借鉴价值。
本发明获得的异源易位系拓宽了黄瓜的遗传基础，丰富了抗霜霉病的黄瓜抗源材料，通过接种鉴定，此易位系的抗性极强，达到高抗水平(病级2.8±0.2)。其农艺性状不同于普通黄瓜，如其叶面积182.1±26.1cm²、节长5.9±3.1cm、果长15.6±1.3cm、果径3.3±0.4cm，果色为深绿底色加浅绿色条纹，侧枝数7.5±4.2个、果刺颜色棕色等都是其独特的形态学特征，丰富了普通黄瓜的形态类型。
利用本发明与综合性状优良但需要霜霉病抗性的黄瓜配组，可望能够培育出抗霜霉病的黄瓜新品种。
四、附图说明
图1、黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育及其用于黄瓜育种的系谱图
图2、CT-01的较小的叶片和雌花(左)，普通黄瓜“北京截头”较大的叶片和雌花(右)
图3、CT-01的果实和普通栽培黄瓜“北京截头”的果实
图4、CT-01体细胞染色体数目(A)、减数分裂中期I多价体(B)和后期I二价体分离滞后(C)
图5、以E-19为引物在CT-01(泳道2)中扩增出了野生种C.hystrix的特征带
图6、以AI-20为引物在CT-01(泳道1)中扩增出了野生种C.hystrix地特征带
五、具体实施方式
实施例1  黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01的选育方法，包括：
1)利用人工合成的双二倍体新种(专利号ZL 00 1 12271.1，公开号：CN 1279009A，公开日：2001年1月10日)为父本，以普通黄瓜“北京截头”(公知公用品种，中国农科院国家蔬菜种质资源中期库保存)为母本，进行回交，在回交群体中，利用根尖分生细胞染色体制片技术和抗霜霉病田间接种试验直接筛选获得染色体数目2n＝14(图4.A)，抗霜霉病，病级为1.8±0.5(表1)的单株HH_1-8；
2)对单株HH_1-8进行自交留种，并于第二年播种继续进行抗病性田间接种鉴定，结果发现单株HH_1-8-57高抗霜霉病，病级2.8±0.2(表1)。对其进行农艺性状观测结果发现，此株在其叶面积182.1±26.1cm²、节长5.9±3.1cm、果长15.6±1.3cm、果径3.3±0.4cm、果色为深绿底色加浅绿色条纹等方面介于亲本黄瓜和野生种之间，在侧枝数7.5±4.2个、果刺颜色棕色等方面更加偏向野生种(表2、图2、图3)。观察其花粉母细胞(PMC)减数分裂过程，发现其PMC中期I多价体频率56±8％和后期I二价体分离滞后率72±5％都较高(图4.B、C)。这种现象在普通黄瓜减数分裂过程中很少观察到，初步推测是由染色体易位造成的，并把此易位系命名为CT-01。进一步利用RAPD分子标记分析，结果在40个随机引物中找到了两个引物E-19：ACGGCGTATG和AI-20：CCTGTTCCCT，能够在CT-01中重复地扩增出原始亲本野生种Cucumis hystrix的大小为1200bp特异DNA片断(图5、图6)，从分子水平上鉴定了其为黄瓜异源易位系。
上述黄瓜抗霜霉病异源易位系选育过程中采用的相关技术和和鉴定方法，包括：
1)抗霜霉病接种鉴定方法为：
1.1)霜霉病病级划分标准：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的0-1％；2级，病斑面积占整个叶面积的2-3％；3级，病斑面积占整个叶面积的4-6％；4级，病斑面积占整个叶面积的7-12％；5级，病斑面积占整个叶片面积的13-25％；6级，病斑面积占整个叶面积的26-50％；7级，病斑面积占整个叶面积的51-75％；8级，病斑面积占整个叶面积的76-100％；9级，植株死亡。
根据病级划分抗性水平：高抗，病级1.3-3.0；中抗，病级3.3-5.0；中感，病级5.3-7.0；高感，病级7.3-9.0。(Todd C.Wehner.Downy mildewresistance of the cucumber germplasm collection in North Carolina fieldtests.Crop Sci.1997，37：1331-1340)
1.2)田间抗霜霉病接种鉴定：把亲本、新种、回交自交后代及感病品种北京小刺等材料催芽和播种，并于出苗后2周按行株距(70cm×30cm)统一定植于大田。为了增强感染力度和去除边际效应，每隔三行种植一行北京小刺。在定植4周后，用孢子浓度为2.5×10⁴个/ml在田间喷雾接种。接种2周后进行田间病级统计。
2)其农艺性状观测方法为：
观测亲本、双二倍体杂种和回交自交后代的第1、5、10、15和20节的节长及叶面积，侧枝数，果实长度，果色，果刺颜色等性状，每处理5株，采用重量法测定叶面积。
3)根尖分生细胞染色体制片方法：
取处于生长旺盛期的黄瓜侧根置于装有现配的0.002mol·L^-1的8-羟基喹啉预处理药剂的10ml离心管中，在19℃左右避光处理1-4h。用现配的改良Carnoy’s II固定液(无水酒精∶氯仿∶冰醋酸＝5∶2∶3)于低温暗处固定材料12h以上，然后转入70％酒精中，冰箱中保存备用。在超级恒温器(501型)中于严格的60℃下用1mol·L^-1HCl解离。用卡宝染液滴染5min，再用1％醋酸分色，微烤，敲片，压片。OLYMPUS(BX-51)显微镜镜检、照相。每个制片观察30个分裂相良好的分生细胞。
4)花粉母细胞减数分裂构型分析：
在植株主蔓发育10节以内取直径为1-4mm的幼小花蕾，用改良Carnoy’s II固定液(无水酒精∶氯仿∶冰醋酸＝5∶2∶3)固定24小时，然后转入70％酒精中放置于4℃冰箱保存备用。进行染色体制片时，首先对固定的花蕾纵切，用去离子水漂洗5分钟，取其中一个花药进行初步镜检。对处于减数分裂时期的PMC用卡宝品红染色，染色后用洁净的盖玻片覆盖，不压或微压，采用火焰微烤和45％醋酸分色制片。用OLYMPUS(BX-51)显微镜观察和照相。
5)RAPD分子标记鉴定方法：
选用上海生工公司的40条随机引物(AI组和E组)。反应体系为20μl，包括Tris-HCl(pH＝9.0)10mM，KCl 50mM，MgCl2 2.5mM，4种核苷酸各为150μM(大连宝生产)，引物0.4μM，模板DNA 40ng，1.0u的Tag DNA聚合酶(上海生工产)。在PTC-100 PCR仪(MJ，美国)中进行。反应程序条件如下：94℃先预变性4min；94℃变性15s，35℃复性15s，72℃延伸75s，循环3周；94℃变性15s，40℃复性15s，72℃延伸75s，循环40周；72℃延伸7min，最后4℃下保存。反应产物在含有EB的1.2％琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下检测并拍照。
本发明甜瓜属抗霜霉病异源易位系CT-01进行黄瓜育种的应用：
以综合经济性状优良的、需要抗黄瓜霜霉病的雌性系材料为母本，与本发明黄瓜抗霜霉病异源易位系CT-01进行配组。通过观察试验、品比试验和区域试验，可以筛选出抗病、高产和优质的黄瓜新品种。
                表1  申请在两年中抗霜霉病的接种鉴定结果