编码重组的来源于巨型艾美球虫配子母细胞的56和82kDa抗原的核 酸和它们的应用
本申请要求2001年7月6日提交的美国临时申请号60/303,699的利益，该申请的内容因此通过参考结合于本申请。
贯穿本申请，在括号中参考了各种出版物。在说明书的结尾紧接着权利要求之前可以发现以字母顺序列出的这些出版物的完整引用。这些出版物它们的全部公开内容因此通过参考结合于本申请以便更充分地描述本发明所属领域的状况。
发明背景
在鸡中导致被称为“球虫病”的疾病的生物属于顶复门(phylumApicomplexa)，孢子纲，球虫亚纲，真球虫目(order Eucoccidia)，艾美球虫亚目(suborder Eimeriorina)，艾美球虫科(family Eimeriidae)，艾美球虫属(genus Eimeria)。在艾美球虫属内存在许多的种，其中几种在鸡中是致病的。对于鸡产业主要关注的物种是柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)，巨型艾美球虫(Eimeria maxima)，堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)，扁嘴艾美球虫(Eimeria necatrix)和布氏艾美球虫(Eimeria brunetti)。
在过去的几十年中，球虫病已经成为鸡产业中的主要经济问题，主要是由于鸡场的过度拥挤和寄生虫抗药性的发展。在干草地面上的拥挤条件下饲养鸡为艾美球虫属寄生虫的生长和传播提供了最适的条件。在该情形下，卫生控制是不可能的，农民必须依靠抑球虫剂药物的效力。然而，必须将药物一直保持在饲料中，必须使用穿梭计划(shuttle program)以避免艾美球虫属的耐药品系出现，并且某些药物具有昂贵的副作用。另外，这些抑球虫剂还具有抗菌效果并因此被认为是进料(in-feed)抗生素。最近欧盟已经决定在鸡产业中禁止使用包括抗球虫药的所有进料抗生素。因此，未来控制球虫病的唯一可行方法是通过疫苗开发。
艾美球虫属寄生虫在肠道的粘膜中经历复杂的生活周期。除了缺乏节肢动物媒介，该生活周期与其它血孢子虫寄生虫(即疟原虫属，巴贝虫属等)非常相似。卵囊在干草地面上形成孢子，产生4个孢囊，每个包含2个子孢子(因此属于孢子纲)。卵囊被鸡摄食，孢囊通过砂囊的机械研磨释放。然后，由于在肠内蛋白水解酶消化孢囊壁，子孢子从孢囊释放。然后可移动的子孢子侵入淋巴细胞并继续侵入上皮细胞，在那里开始无性生殖周期。寄生虫经历2-4个复制和分裂周期(每个物种具有确定的分裂数)，导致大量子裂殖子的产生。在裂殖子产生的末循环之后开始性周期，产生大配子母细胞(雌性)和小配子母细胞(雄性)。大配子母细胞其特征在于成壁体(wall forming bodies)的产生，而小配子母细胞包含涉及小配子的形成的组分，小配子从胞内寄生虫的表面出芽。小配子是有鞭毛的并负责大配子的受精。形成合子，其通过成壁体的融合和细胞核的浓缩成熟为卵囊。卵囊分泌在粪便中，从而完成循环。
在过去几年中，已经使用源于巨型艾美球虫的性(配子母细胞)阶段的天然抗原来免疫产卵的母鸡。子代鸡因此通过母体免疫(保护性母体抗体)接种。在巨型艾美球虫的配子母细胞中先前已经鉴定3种主要的保护性抗原，其具有250，82和56kDa的分子量(欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225)。欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225因此通过参考结合到本发明中以便更充分地描述本发明所属领域的状况。已经显示这些抗原在艾美球虫属的物种之间是很保守的(Wallach 1995)并且可以交叉保护免遭在肉用仔鸡中导致球虫病的3种主要物种一巨型艾美球虫，柔嫩艾美球虫和堆型艾美球虫的侵袭。新近，显示在地面围栏试验(floor pen trials)中，源自用这些天然配子母细胞抗原接种的母鸡的小鸡在野外条件下被保护免遭艾美球虫属侵袭(Wallach 1996)。该保护的作用为将卵囊释放的峰值降低到对肉用仔鸡的性能不导致任何破坏作用的水平。基于上述结果得出结论，这些抗原对鸡的球虫病有效并有可能用于防止包括火鸡，鹅，羊，牛，猪和鱼的其它家畜的球虫病。
这3种抗原特征还在于分子水平。进行无细胞翻译实验以鉴定编码它们的RNA分子(Mencher等)。通过免疫筛选在表达载体λzap中制备的cDNA文库来克隆编码这些抗原的cDNA分子(4，美国专利号5,932,225)。通过该方法，克隆和测序了编码250kDa抗原的基因。在美国专利号5,932,225和5,496,550中部分测序了克隆pEM 250/14。本申请的图13a复制美国专利号5,932,225和5,496,550的图11，其描绘了克隆pEM 250/14开始的293个核苷酸的DNA序列。本申请的图13b复制美国专利号5,932,225和5,496,550地图12，其显示了克隆pEM 250/14最后的196个核苷酸的DNA序列。此外，在美国专利号5,932,225和5,496,550中，克隆和测序了推定的编码56和82kDa抗原的基因。
随后，Fried等将整个pEM 250/14克隆测序并发现抗原具有230kDa的分子量而不是以前所认为的250kDa。Fried等发现230kDa基因包含高度重复的基序并且贯穿整个基因包含这些重复(Fried等)。使用pATH质粒载体在细菌中表达该克隆，显示它被在感染巨型艾美球虫14天后采取的恢复期的鸡血清识别。最后，显示该基因只在大配子母细胞阶段表达，并通过免疫荧光发现位于大配子的成壁体中(Fried等)。
通过使用针对56kDa抗原的多克隆抗体以及单克隆抗体筛选文库还获得编码56和82kDa抗原的cDNA克隆。先前显示该单克隆抗体给幼鸡提供被动免疫(Wallach 1990)。获得并分析几个克隆。发现克隆中的一个编码10kDa的小抗原，因此不是所需克隆。发现另一个克隆只包含可读框(ORF)的一小部分，并通过RNA印迹法显示与对于56和82kDa抗原差不多期望大小的两条mRNA杂交。因此得出结论这是所需克隆。然后筛选基因组文库以获得全长克隆。然而，由于在该克隆中高度重复的GCA基序，不可能特异性地分离全长克隆。由于这些重复导致克隆全长cDNA分子的尝试也不成功。最后，可能由于它们的异常序列在细菌中表达部分cDNA克隆的尝试也失败了，未获得合理的基因表达水平。先前已经显示56和82kDa抗原是糖基化的(美国专利号5,932,225)。这是基于它们与大豆凝集素的强烈反应性。因此，可能需要糖基化作用以便获得这些基因的良好表达和基因产物的正确构象。
除了56，82和230kDa抗原以外，从高度纯化的卵囊壁的级分中获得的14kDa抗原已经被提议作为防止球虫病的疫苗的可能候选物(Eschenbacher等)。然而，该假说没有被研究。
几个实验室已经正在研究针对球虫病的亚单位疫苗。这些研究人员大部分已经将它们的努力集中在生活周期的胞外无性繁殖阶段，特别是子孢子和裂殖子阶段，其被认为是最易受免疫攻击。在先前的研究中发现来自柔嫩艾美球虫的子孢子提取物可以在肉仔鸡中诱导针对该寄生虫的保护以防攻击感染达7周龄(Karkhanis等)。使用针对来源于柔嫩艾美球虫子孢子的抗原的单克隆抗体进行的工作导致25,000分子量抗原的鉴定，其被克隆和测序(欧洲专利公开号0 164 176，1985年12月11日)。鉴定了其它几个子孢子基因并且检验它们的重组抗原或转化细菌本身的保护性免疫(Danforth等)。结果显示这些重组体只能提供针对艾美球虫属攻击感染的相对低水平的保护，并不一定防止显著病变的出现。
也已经检验使用来源于裂殖子阶段的抗原的疫苗(欧洲专利公开号0135 073)。使用这些抗原来免疫幼肉仔鸡，再次发现提供的保护是相对低的(Danforth等)。
在1993年，发现在保护性母体免疫和针对巨型艾美球虫230kDa裂殖子(与配子母细胞相对)抗原的母体抗体的出现之间存在相关性(Smith等)。该保护经常是在90％以上并发现即使当母体抗体水平相对低(尽管与230kDa蛋白质的反应性仍然强烈)的时候也存在。还发现从SDS-PAGE凝胶切割的极少量的天然230kDa裂殖子抗原可以在子代鸡中诱导针对巨型艾美球虫感染的显著(60％)水平的保护性母体免疫。另外，蛋白质印迹显示该蛋白质在巨型艾美球虫的裂殖子和子孢子中都表达，并且在艾美球虫属的物种之间也很保守。
发明概述
本发明提供编码两种具有56和82kDa分子量的主要的巨型艾美球虫的配子母细胞抗原的核酸。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫配子母细胞的30kDa蛋白质，其在N-末端具有由SEQ.ID NO.35表示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫配子母细胞的30kDa蛋白质，其在N-末端具有由SEQ.ID NO.42表示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有由SEQ.ID NO.37表示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有由SEQ.ID NO.39表示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有由SEQ.ID NO.41表示的氨基酸序列。
本发明还提供抗球虫病的疫苗，其单独或与上述蛋白质中任何一种结合包含重组的56kDa抗原。
本发明还提供抗球虫病的疫苗，其单独或与上述蛋白质中任何一种结合包含重组的82kDa抗原。
本发明还提供一种免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫(Eimeria praecox)，缓艾美球虫(Eimeria mitis)或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用上述疫苗中任何一种的步骤。
附图简述
图1.描述考马斯染色的亲和纯化的天然配子母细胞抗原的SDSPAGE凝胶。箭头指向56和82kDa抗原。指出了分子量标记蛋白质。
图2.描述在免疫印迹和银染色后，亲和纯化的天然配子母细胞抗原的双向(2D)SDS-PAGE凝胶。指出了分子量标记蛋白质。
图3.描述考马斯染色的来自双向SDS PAGE凝胶的PVDF滤器(filter)，和用于序列分析的斑点的鉴定。箭头指向56和82kDa天然抗原。
图4.描述56kDa配子母细胞抗原的完整DNA序列。标明了氨基末端以及内部胰蛋白酶肽片段。另外，显示了预测的起始甲硫氨酸和信号肽切割位点。显示了编码序列，它的互补序列和氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.1-3)。
图5.描述82kDa配子母细胞抗原的完整DNA序列。标明了氨基末端以及内部的胰蛋白酶肽片段。另外，显示了预测的起始甲硫氨酸和信号肽切割位点。显示了编码序列，它的互补序列和氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.4-6)。
图6.描述配子母细胞和对照鸡DNA的DNA印迹，其用56kDa抗原的cDNA克隆探测。指出了用于消化DNA的限制性内切酶和千碱基的标记带大小。
图7.描述配子母细胞和对照鸡DNA的DNA印迹，其用82kDa抗原的cDNA克隆探测。指出了用于消化DNA的限制性内切酶和标记带的大小。
图8.描述配子母细胞(G)和对照(C)鸡总RNA的RNA印迹，其用82kDa cDNA克隆探测。在左边显示千碱基的标记带大小。
图9.描述免疫印迹，其显示抗聚组氨酸抗体和鸡抗-APGA与通过IPTG诱导表达的蛋白质和未诱导的(对照)、包含在pTrcHisB中的56kDacDNA克隆的细菌的反应性。作为另外的阴性对照，检验转化不含插入片段的pTrcHisB质粒的细菌。最后，将天然APGA用作与抗APGA抗血清的印迹的阳性对照。指出了蛋白质标记带的大小。箭头显示41kDa重组体以及56和82kDa天然蛋白质的位置。
图10.描述考马斯染色的凝胶和来自包含pTrcHisB-82kDa cDNA克隆质粒的细菌的蛋白质的免疫印迹。免疫印迹显示在诱导后的不同时间，在IPTG诱导和未诱导的条件下抗聚组氨酸，鸡抗-APGA以及未感染鸡(阴性对照)的血清与82kDa重组蛋白质的反应性。作为阴性对照，还使用以不含插入片段的相同质粒转化的细菌进行实验。作为阳性对照，还使用天然APGA。箭头显示82kDa重组蛋白质的位置。在左边显示蛋白质标记带的大小。
图11.描述通过双向SDS PAGE分离的、未形成孢子的巨型艾美球虫卵囊的全裂解物的免疫印迹。将凝胶印迹到薄膜滤器上并用针对APGA产生的抗血清探测。用箭头显示强烈反应的30kDa斑点。这是从凝胶上切割并用于序列分析的斑点。
图12.描述230kDa cDNA巨型艾美球虫克隆与来自专利WO90/00403的同源DNA序列的DNA序列对比，其显示60％的同源性(SEQ.ID.Nos.26-27)。
图13a.描述克隆pEM 250/14的开始293个核苷酸的DNA序列。显示编码序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.Nos.28-29)。图13b描述克隆pEM 250/14的最后196个核苷酸的DNA序列。显示编码序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.Nos.30-31)。
图14A&B.重组形式的56kDa和82kDa配子母细胞抗原的鸡免疫原性试验的ELISA结果。所有血清样品是在1∶1000的稀释度下检验的。A)包被抗原：检验抗APGA血清的APGA；纯化以检验取自用PBS，FIA和两剂量r56免疫的鸡的血清的r56。B)包被抗原：检验抗APGA血清的APGA；r82纯化的蛋白质，以检验取自用PBS，FIA和两剂量r82免疫的鸡的血清。
图15.来源于250kDa无性阶段蛋白质的表达蛋白质片段的DNA和编码的氨基酸序列(SEQ.ID.Nos.32-33)。
图16.250kDa无性阶段蛋白质的重组片段的小鼠免疫原性试验。显示对于三次连续放血每组的平均值，显示标准误差条线(error bar)。所有的血清样品在1∶1000的稀释度下检验。包被抗原是来自阳性对照APGA组的血清的100ng APGA，或阴性对照PBS和PBS/FIA组的100ng重组蛋白质和2个重组蛋白质剂量(r0.5μg和r5μg)。
图17.250kDa无性阶段蛋白质的重组片段的鸡免疫原性试验。显示对于3次连续放血的每组的平均值，显示标准误差条线。所有的血清样品在1∶1000的稀释度下检验。包被抗原是来自阳性对照APGA组的血清的100ngAPGA，或阴性对照PBS和PBS/FIA组的100ng重组蛋白质和2个重组蛋白质剂量(1μg和r10μg)。
图18巨型艾美球虫中的配子母细胞和壁抗原的抗-r56识别。
图19巨型艾美球虫中的配子母细胞和壁抗原的抗-r82识别。
图20卵囊壁蛋白质的N-末端序列与56kDa和82kDa配子母细胞抗原(SEQ.ID.Nos.34-42)的对比。
发明详述
本发明提供分离的核酸或核酸的互补序列，所述核酸包含编码来自巨型艾美球虫配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，多肽具有图4所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.3)。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少50％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少60％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少70％的同一性。
在一个附加的实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少75％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少93％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.3所示序列的多肽具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与图4所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)具有至少50％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少60％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.1所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核酸是DNA分子。
在还有另一个实施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在一个附加的实施方案中，核酸具有图4所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)。
在另一个实施方案中，核酸是RNA分子。
在一个实施方案中，将分离的核酸有效地连接到RNA转录的启动子上。
本发明还包括一种包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的载体，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体包含具有图4所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)的核酸。
在另一个实施方案中，载体是质粒。
在另一个实施方案中，质粒包含具有图4所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)的核酸。
在另一个实施方案中，质粒包含分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在还有另一个实施方案中，质粒是命名为56TRCHisb1质粒的质粒(澳大利亚政府分析实验室(Australian Government Analytical Laboratories)保藏号NM01/22400)。
本发明还包含宿主细胞，其包含载体，所述载体包含分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含具有图4所示在核苷酸号103起始和在核苷酸号1529终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)的核酸。
在另一个实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞；植物细胞；昆虫细胞；和哺乳动物细胞。
本发明另外提供包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，转化细胞是在细菌中命名为克隆56TRCHisb1的转化细胞(澳大利亚政府分析实验室保藏号NM01/22401)。
在2001年6月26日将编码56kDa抗原的质粒保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22400。在2001年6月26日将用56kDa抗原转化的细菌细胞保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22401。两个保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约进行。
在一个附加的实施方案中，转化细胞另外包含来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或所述多肽的同源物。
本发明另外包含生产重组的来源于巨型艾美球虫配子母细胞的56kDa多肽的方法，其包含培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞并分离重组的来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。本发明也包含通过该方法生产的重组多肽。
本发明还提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，或布氏艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一个实施方案中，分离的核酸是质粒。
另外，本发明提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，或布氏艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含重组的来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，该重组多肽是通过培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞并分离重组的来自巨型艾美球虫配子母细胞的56kDa多肽来生产的，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸和本发明的重组多肽的混合物组成。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸，本发明的重组多肽和包含所述分离的核酸的质粒组成，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa多肽的核苷酸序列。
在一个附加的实施方案中，疫苗另外包含第二种抗原。
在一个实施方案中，第二种抗原选自编码来自巨型艾美球虫的抗原的核酸，包含该核酸的质粒，和由该核酸编码的多肽。
在另一个实施方案中，第二种抗原选自在N-末端具有如SEQ.ID NO.35，或SEQ.ID NO.42所示的氨基酸序列、来源于巨型艾美球虫配子母细胞的30kDa蛋白质，或在N-末端具有如SEQ.ID NO.37，SEQ.ID NO.39，或SEQ.ID NO.41所示的氨基酸序列、来源于巨型艾美球虫配子母细胞的14kDa蛋白质。
在还有另一个实施方案中，第二种抗原是一种核酸，其具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列，包含该核酸的质粒或由该核酸编码的多肽。
在另一个实施方案中，疫苗另外包含第三种抗原。
本发明还提供一种疫苗，其中第三种抗原是来源于巨型艾美球虫的230kDa子孢子/裂殖子抗原。
230kDa抗原是从纯化的巨型艾美球虫的子孢子中分离，子孢子存在于形成孢子的卵囊中(参见上述生活周期)。分离方法涉及从形成孢子的卵囊中提取蛋白质和在DEAE-sephacel阴离子交换柱上分离提取的蛋白质。接着进行峰级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹法以鉴定230kDa抗原。另外，使用来源于接种的母鸡和子代鸡的保护性母体抗血清来证实纯化的抗原的同一性。最后，从PVDF薄膜滤器上分离230kDa蛋白质，用于进行蛋白质测序和克隆。
将230kDa抗原的氨基末端和胰蛋白酶肽消化产物测序。将来自胰蛋白酶消化的序列用来设计简并PCR寡核苷酸引物。将引物用于RACE(cDNA末端快速扩增)PCR以扩增部分基因产物。从这些产物的序列，设计基因特异性引物并用于RACE PCR以确定mRNA的3′和5′末端。然后使用针对5’和3’末端设计的基因特异性引物通过PCR扩增编码抗原的全长7kb cDNA克隆。该克隆被完全测序并且当与天然蛋白质N-末端的氨基酸序列相比时显示其5’末端包含正确的DNA序列。因此，该核酸序列编码保护性的230kDa子孢子/裂殖子抗原并且现在可以用来生产用于鸡接种以抗球虫病的重组抗原。
在2001年6月26日将编码230kDa抗原的质粒保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22396。在2001年6月26日将用230kDa抗原转化的细菌细胞保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22397。两个保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物存放的国际认可的布达佩斯条约进行。
先前认为来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的抗原是230kDa的抗原。然而，我们随后的研究已经显示抗原实际上是巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa抗原。
在另一个实施方案中，第三种抗原是具有图12所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.26)的核酸，包含该核酸的质粒，或由该核酸编码的多肽。
在还有另一个实施方案中，疫苗另外包含第四种抗原。
在一个实施方案中，第四种抗原是来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的多肽，其具有230kDa-270kDa的分子量，编码该多肽的核苷酸序列，或包含所述核苷酸序列的质粒。
在另一个实施方案中，抗原包含一种多肽，其在它的5′末端具有图13a所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.29)或者在它的3′末端具有图13b所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.31)。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用本发明的疫苗的步骤。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
在一个实施方案中，施用步骤包含将疫苗喷雾到患者的鼻孔中。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
在另一个实施方案中，施用是在卵内(in ovo)进行。
在另一个实施方案中，施用是针对卵的气囊，因此使胚胎与疫苗接触。
本发明还包含来自鸟类物种的受精卵，其具有用本发明的疫苗接种的气囊，所述疫苗能够在孵化前或孵化后即刻在胚胎中诱导免疫应答以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的有毒力形式。
在一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
本发明另外提供分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，多肽具有图5所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少50％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少60％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少70％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少75％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少80％的同一性。
在一个附加的实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少93％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少95％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少97％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示的序列的多肽具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如图5所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)具有大于50％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有大于60％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在还有一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核酸是DNA分子。
在还有另一个实施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在另一个实施方案中，核酸具有如SEQ.ID.NO.4所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，核酸是RNA分子。
在一个实施方案中，将分离的核酸有效地连接到RNA转录的启动子上。
本发明还包括一种包含分离的核酸或核酸的互补序列的载体，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体包含具有图5所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一个实施方案中，载体是质粒。
在另一个实施方案中，质粒包含具有图5所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一个实施方案中，质粒包含分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在还有另一个实施方案中，质粒是命名为82TRCHisb8质粒的质粒(澳大利亚政府分析实验室保藏号NM01/22398)。
本发明还包括包含载体的宿主细胞，所述载体包含分离的核酸或核酸的互补序列，该分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含具有图5所示在核苷酸号100起始并在核苷酸号1886终止的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一个实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞；植物细胞；昆虫细胞；和哺乳动物细胞。
本发明另外提供包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，转化细胞是在细菌中命名为克隆82TRCHisb8的转化细胞(澳大利亚政府分析实验室保藏号NM01/22399)。
在2001年6月26日将编码82kDa抗原的质粒保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22398。在2001年6月26日将用82kDa抗原转化的细菌细胞保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22399。两个保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物存放的国际认可的布达佩斯条约进行。
在一个附加的实施方案中，转化细胞另外包含来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或所述多肽的同源物。
本发明另外包含生产重组的来自巨型艾美球虫配子母细胞的82kDa多肽的方法，其包含培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞并分离重组的来自巨型艾美球虫配子母细胞的82kDa多肽，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。本发明还包含通过该方法生产的重组多肽。
本发明还提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一个实施方案中，分离的核酸是质粒。
另外，本发明提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含重组的来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，该多肽是通过培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞并分离重组的来自巨型艾美球虫配子母细胞的82kDa多肽来生产的，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸和本发明的重组多肽的混合物组成。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸，本发明的重组多肽和包含分离的核酸的质粒的混合物组成，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的82kDa多肽的核苷酸序列。
在一个附加的实施方案中，疫苗另外包含第二种抗原。
在一个实施方案中，第二种抗原选自编码来自巨型艾美球虫的抗原的核酸，包含该核酸的质粒，和由该核酸编码的多肽。
在另一个实施方案中，第二种抗原选自在N-末端具有如SEQ.ID NO.35，或SEQ.ID NO.42所示的氨基酸序列、来源于巨型艾美球虫配子母细胞的30kDa蛋白质，或在N-末端具有如SEQ.ID NO.37，SEQ.ID NO.39，或SEQ.ID NO.41所示的氨基酸序列、来源于巨型艾美球虫配子母细胞的14kDa蛋白质。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用本发明的疫苗的步骤。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
在一个实施方案中，施用步骤包含将疫苗喷雾到患者的鼻孔中。
在另一个实施方案中，施用是在卵内进行。
在另一个实施方案中，施用是针对卵的气囊，因此使胚胎与疫苗接触。
本发明还包含来自鸟类物种的受精卵，其具有用本发明的疫苗接种的气囊，所述疫苗能够在孵化前或孵化后即刻在胚胎中诱导免疫应答以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的有毒力形式。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
本发明还提供一种重组多肽，其中氨基酸序列如SEQ.ID NO.3所示。
本发明还提供一种重组多肽，其中氨基酸序列如SEQ.ID NO.6所示。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的30kDa蛋白质，其在N-末端具有如SEQ.ID NO.35所示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的30kDa蛋白质，其在N-末端具有如SEQ.ID NO.42所示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有如SEQ.ID NO.37所示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有如SEQ.ID NO.39所示的氨基酸序列。
本发明还提供来源于巨型艾美球虫的配子母细胞的14kDa蛋白质，其在N-末端具有如SEQ.ID NO.41所示的氨基酸序列。
可以将上述蛋白质和它们对应的核苷酸序列以和以上所述相同的方式用于56kDa和82kDa蛋白质，包括用来免疫受试者，将包含编码蛋白质的核苷酸序列的质粒结合到宿主细胞中。
本发明还提供给予新生的鸟类物种受试者以母体免疫(抗体)以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便由此在新生的受试者中通过母体免疫给予保护以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的步骤。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供减少在来自新生的鸟类物种受试者的粪便中艾美球虫属卵囊排出量的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便诱导免疫应答和将母体抗体传递给新生儿以使来自新生儿的卵囊排出量减小的步骤。
在另外的实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用活疫苗的步骤，所述活疫苗包含表达来源于巨型艾美球虫配子母细胞的56kDa或82kDa多肽的活的非毒性微生物或活病毒。
在一个实施方案中，活病毒是痘病毒。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者给料植物的步骤，所述植物的细胞表达来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa或82kDa的多肽。
在一个实施方案中，植物是小麦。
在另一个实施方案中，植物是玉米。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用包含分离的核酸或核酸的互补序列的质粒的步骤，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的配子母细胞的56kDa或82kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明核酸的同源物是编码与该核酸编码的多肽具有基本上相同生物活性的多肽的核酸。在此使用的术语“同源物”指互补性的程度。可能存在部分同源物或完全同源物(即，同一性)。部分互补序列是至少部分抑制相同的序列与目标核酸杂交的序列；使用功能术语(functional term)“基本上同源”来表示。使用低严格条件下的杂交试验(DNA印迹或RNA印迹，溶液杂交等)可以检验与靶序列完全互补的序列的杂交的抑制。在低严格条件下基本上同源的序列或探针将竞争和抑制完全同源的序列或探针与靶序列的结合(即杂交)。这不是说低严格条件是这样的以致允许非特异性的结合；低严格条件要求两个序列的彼此结合是特异性(即选择性的)的相互作用。通过使用甚至缺少部分程度的互补性(例如小于30％同一性)的第二种靶序列可以检验非特异性结合的缺乏；在不存在非特异性结合时，探针将不与第二种非互补的靶序列杂交。
如在本领域已知，可以使用众多等价条件以包含低或高严格条件。考虑因素如序列的长度和性质(DNA，RNA，碱基组成)，目标的性质(DNA，RNA，碱基组成，存在溶液中或固定等)，和盐的浓度以及其它组分(例如，甲酰胺，葡聚糖硫酸酯和/或聚乙二醇的存在或缺乏)，并且可以改变杂交液以产生与上面列出的条件不同但相当的低或高严格条件。
本发明的目的是提供编码来源于巨型艾美球虫配子母细胞的56和82kDa抗原的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。具体例举的编码序列在图4和图5中与推断的氨基酸序列一起给出。关于例举的氨基酸序列的所有同义编码序列都在本发明的范围内。
本发明另一个目的是提供功能上等价的编码和蛋白质序列，包括来源于艾美球虫属其它物种的等价序列。来源于巨型艾美球虫配子母细胞的功能上等价的56和82kDA抗原编码序列与具体鉴定的编码序列理想地是约50％-约80％的核苷酸序列同源性(同一性)，并且编码序列与具体例举的编码序列约80％-约95％，理想地约95％-约100％相同。
特别严格的杂交条件提供给来自其它物种的编码序列同源物的鉴定和变体序列的鉴定，其中那些同源物和/或变体序列具有至少(包括在内)50-85％，85-100％的核苷酸序列同一性，90-100％，或95-100％的核苷酸序列同一性。每个整数和每个指定范围的每个子集规定为在本发明的范围内。
本发明的编码序列和方法包括在除了巨型艾美球虫以外的物种中的同源编码序列。可以使用方法从其它生物分离相应的编码序列(例如，从cDNA)，所述生物包括但不限于其它物种，例如在使用本文公开的序列和本领域众所周知的实验技术的本发明方法中有用的柔嫩艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫和布氏艾美球虫。
特别包括在本发明中的是来源于除了在此例举的那些的其它物种的序列，该序列与公开的序列在严格条件下杂交。严格条件指在本领域对于给定的探针长度和核苷酸组成理解的条件，能够在严格条件下杂交意指在标准条件下(即高温和/或低盐含量)与被试核苷酸序列，或它的互补链退火，标准条件往往不利于无关序列的退火。
“高严格条件”意指65℃-68℃，0.1xSSC和0.1％SDS(显示大约95-100％的核苷酸序列同一性/相似性)的杂交和漂洗条件。在Sambrook等(1989)Molecular Cloning，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.中进一步描述杂交试验和条件。如这里使用，适中(中等的)严格的条件是50℃-65℃，1xSSC和0.1％SDS的杂交和漂洗条件(其中阳性杂交结果反映大约80-95％核苷酸序列的同一性)。低严格条件典型地是40-50℃，6xSSC和0.1％SDS的杂交和漂洗条件(反映大约50-80％核苷酸序列同一性)。
本发明多肽的同源物是具有与多肽基本上相同的核苷酸序列和生物活性的多肽。因此，同源物可以通过添加，缺失，或替换一个或多个非必需氨基酸残基而不同于本发明的多肽，条件是产生的多肽保留多肽的生物活性。使用确定的和众所周知的方法，本领域的技术人员可以容易地确定可以添加，缺失，或替换(包括该替换可以用哪个氨基酸进行)哪个氨基酸残基，所述方法包括例如设计和制备DNA序列，其编码本多肽的细菌表达的多肽同源物，通过定点诱变技术修饰cDNA和基因组序列，构建重组多肽和表达载体，细菌表达多肽，和通过常规生物化学测定测量多肽的生物化学活性的常规方法。
同源物的实例是包含少于在本多肽中规定的所有残基的缺失同源物，其中用其它残基替代一个或多个规定残基的替换同源物，和其中将一个和多个残基添加到多肽的添加同源物。所有的这些同源物共有本发明多肽的生物活性。
在此将“基本上相同的多肽”限定为包含在多肽的氨基酸序列的N-末端缺失，添加或替换少于4个氨基酸。另外，在序列中可以存在不消除多肽的生物活性的缺失，添加或替换。该修饰对于本领域的技术人员是已知的。例如，根据由例如Lehninger，Biochemistry，第2版，Worth出版社，纽约(1975)；Creighton，蛋白质结构，实用方法，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(1989)；和Dayhoff，Atlas of Protein Sequenceand Structure，1972，National Biomedical Research Foundation，Maryland(1972)描述的同源或等价基团，替换可以包含高达10个残基。
在此使用的术语“生物活性的”指具有天然存在分子的结构，调节，或生物化学功能的多肽。同样，“免疫活性的”指天然的、重组的、或合成的多肽，或其任何寡肽部分在动物或细胞中诱导特异性免疫应答和与特异性抗体结合的能力。
“基本上相同的生物活性”指与天然存在的分子相同的生物活性，在程度或水平上可能稍微不同，其仍可以被熟练的技术人员认为是相同的生物活性。
在此使用的术语“部分”，与多肽结合(如在“给定多肽的一部分”中)指多肽的片段。片段可以在大小从四(4)个氨基酸残基到减去一个氨基酸的整个氨基酸序列的范围内变化。在此使用的术语“部分”，与核酸结合(如在“给定核酸的一部分”中)指核酸的片段。片段可以在大小从十二(12)个核苷酸残基到减去一个核苷酸的整个核酸序列的范围内变化。
在此使用的“缺失”指氨基酸或核苷酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸或核苷酸残基。
在此使用的“插入”或“添加”指氨基酸或核苷酸序列的改变，与天然存在分子相比，其分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加。
在此使用的“替换”指分别用不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。
本发明提供两种具有56和82kDa分子量的主要的巨型艾美球虫配子母细胞抗原的重组克隆和测序。
本发明还提供使用质粒pTrcHis在大肠杆菌表达系统中表达这些重组抗原。
本发明还提供一种抗球虫病的疫苗，其包含重组56kDa抗原。另外，本发明提供一种抗球虫病的疫苗，其包含重组82kDa抗原。
本发明提供两种具有56和82kDa分子量的主要的巨型艾美球虫配子母细胞抗原的克隆和测序。
按比例增加配子母细胞的生产以便分离足够的配子母细胞抗原来对56和82kDa糖蛋白它们自身进行氨基酸测序(即毫克量的特异性抗原)。这种按比例增加生产本身是非常困难的任务，需要感染几千只鸡以便提供足以进行序列分析的材料。在实现该目标后，可以生产足够的亲和纯化的配子母细胞抗原(APGA)以开始大规模分离两种糖蛋白。
通过双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的配子母细胞抗原糖蛋白。在通过染色分析双向凝胶后，通过转移至PVDF薄膜滤器和用针对APGA的抗血清免疫检测来确定56和82kDa抗原的位置。在鉴定和从滤器移去56及82kDa抗原后，进行它们的N-末端以及从胰蛋白酶肽获得的内部蛋白质序列的氨基酸测序。基于其合成小的，特异性的寡核苷酸探针，这些肽序列被用于预测DNA序列。
将特异性的寡核苷酸探针用于RACE PCR(cDNA末端的快速扩增)，从编码56和82kDa抗原的配子母细胞RNA中制备cDNA分子。该方法能够生产从mRNA分子中特异性扩增的全长cDNA分子，所述mRNA分子它们内部包含编码所需的肽的RNA序列。然后将该cDNA产物完全测序，证实以上测序的各种肽的存在。意外地，我们发现我们获得的cDNA克隆与在Wallach等，美国专利号5,932,225中描述的那些无关。因此，似乎是在Wallach等中，当用抗体筛选cDNA文库时出现假象(artifact)，分离的被认为编码56和82kDa抗原的克隆实际上不编码这些抗原。
最后将两个新的cDNA克隆用作DNA和RNA印迹实验中探针，以鉴定编码56和82kDa抗原的特异性的基因和mRNA分子。尽管先前在印迹上未能获得清晰的带型(美国专利号5,932,225)，清楚地辨别出编码两个抗原的基因片段和mRNA转录物的数量和大小。
本发明另外提供将56和82kDa抗原克隆到包含聚组氨酸标记(帮助重组抗原的纯化)的细菌表达载体，pTrcHis中的方法。然后通过加入特异的诱导物分子(异丙基-α-D-硫代吡喃半乳糖苷)在大肠杆菌中表达两个基因，接着通过蛋白质印迹鉴定重组的56和82kDa抗原蛋白质。这些印迹的结果显示，56和82kDa重组抗原具有正确的大小，其是基于通过质谱法的测量，并被针对组氨酸标记的抗体以及针对天然56和82kDa配子母细胞抗原产生的保护性抗血清所识别。这些结果证实，克隆的同一性，并显示这些重组抗原可以用来替换在抗鸡球虫病的基于母体的疫苗中的天然抗原。
本发明进一步描述56kDa配子母细胞抗原和30kDa卵囊蛋白质之间的关系。通过免疫印迹显示，该卵囊蛋白质与针对56和82kDa配子母细胞抗原的抗血清强烈反应。通过将30kDa卵囊蛋白质的氨基末端测序，我们发现存在与56kDa抗原的氨基末端的精确匹配。因此得出结论，56kDa抗原在来自配子母细胞的卵囊的发育期间被加工成30kDa蛋白质。
通过下列实施例进一步举例说明本发明，所述实施例决不应该被认为是进一步限制。本领域的技术人员将容易地理解，讨论的具体方法和结果只是本发明的举例说明，在其后接着的权利要求中更充分地描述本发明。实验细节
实施例1
巨型艾美球虫配子母细胞的大规模纯化
为了生产非常大量的配子母细胞，用10,000个形成孢子的巨型艾美球虫卵囊感染4,000只重种(heavy breed)鸡，然后在感染后第6天(大约134小时)处死。去除鸡肠，用PBS洗涤并纵向切开。然后将它们切成1cm的长条并放入包含0.5mg/ml透明质酸酶(III类，来源于Sigma，700单位/mg)的SAC缓冲液(170mM NaCl，10mM Tris pH 7，10mM葡萄糖，5mM CaCl2，1％奶粉)。将肠条在37℃下温育20分钟，之后将它们放在网状滤器之上。用大量SAC缓冲液漂洗肠条并收集产生的滤液。然后将这滤过17微米的polymon滤器(Swiss Silk Bolting Cloth Mfg.Co.Ltd.，Zurich，Switzerland)，然后将产生的滤液滤过10微米的滤器。从10微米滤器的上部收集配子母细胞，检查并显微镜计数，放于离心瓶中，在800xg下旋转10分钟。然后用SAC缓冲液洗涤配子母细胞2次，并-70℃冷冻。
实施例2
56，82和230kDa配子母细胞抗原的纯化
冷冻的配子母细胞在室温下解冻，如先前所述(Wallach 1995)提取蛋白质。通过让它在琼脂糖4B柱上流动从蛋白质提取物中分离56和82kDa配子母细胞抗原，所述琼脂糖4B柱包含针对56kDa抗原产生的单克隆抗体1E11-11。使配子母细胞抗原的复合物与附着在树脂上的单克隆抗体结合，使用缓冲液洗去非特异性的物质，从柱上洗脱亲和纯化的配子母细胞抗原(APGA)。冷冻干燥纯化的APGA。通过SDS-PAGE分析少量APGA样品，其中清楚地显示56和82kDa天然抗原(图1)。
实施例3
APGA的双向凝胶电泳和主要的56和82kDa抗原的分离
从APGA分离56和82kDa配子母细胞抗原。如实施例2所述制备冻干的APGA，并溶于水中。然后通过双向SDS-PAGE分离蛋白质(图2)，并使用多克隆鸡抗-APGA抗体通过免疫印迹鉴定，所述抗体识别56和82kDa蛋白质。在鉴定和在双向SDS-PAGE凝胶上确定它们的位置后，然后将蛋白质转移至PVDF薄膜滤器，并用考马斯蓝染色(图3)。同时进行免疫印迹，比较2个印迹以清楚地鉴定56和82kDa蛋白质。将对应于56和82kDa配子母细胞抗原的斑点从膜上切下，并将每个抗原的氨基末端测序。
实施例4
来源于56和82kDa抗原的氨基末端以及内部胰蛋白酶肽的氨基酸测序将56和82kDa蛋白质的氨基末端测序：
56kDa蛋白质的氨基末端：VPSTTPVENQVHPY-EM
(SEQ.ID.NO.7)
82kDa蛋白质的氨基末端：-PTVLDTTTG-QVEDT
(SEQ.ID.NO.8)
为了确定56和82kDa蛋白质的内部胰蛋白酶片段的蛋白质序列，首先通过单向SDS-PAGE将APGA制剂分离，并用考马斯蓝染色。然后将蛋白质从凝胶上切除，用胰蛋白酶消化并测序。
从两个蛋白质都获得几个胰蛋白酶肽序列，结果在表1中总结。
表1：从56和82kDa抗原分离的胰蛋白酶肽的氨基酸序列
肽56kDa抗原82kDa抗原SEQ.ID.NO
A VQDV(L/I)VDA(L/I)WAS(L/I)R ATGFSEEEVMR 9，10
B VTEMMDM(L/I)SNR TGGLFDQACNDAPPSR 11，12
C Q(L/I)Q(L/I)QDQMMR TGP(L/I)STTGATGATTGPVAA(L/I)R 13，14
D AAEEF(L/I)HR P(L/I)THVE 15，16
E R(L/I)AAVPGTTAGT 17
F D(L/I)QEY(L/I)STAFNWA- (L/I)AEGAEPRPVMPPAAATAAANLR 18，19
ENQSTAYTR
G RQTAAWMDRTA(L/I)EQEETT 20
H MNAAMDSSNE(L/I)MTT 21
I KFPET(L/I)F 22
获得的氨基酸序列与其它任何已知的蛋白质未显示任何同源性。
实施例5
编码56和82kDa抗原的基因的RACE PCR克降和测序
使用SMART RACE PCR技术(Clonetech)从配子母细胞的cDNA扩增56和82kDa蛋白质的基因。从巨型艾美球虫配子母细胞分离RNA，并使用Dynal beads(Dynal)纯化mRNA。使用逆转录酶Powerscript(Clonetech)，按照制造厂商的说明书的方案合成SMART准备(ready)cDNA。使用在SMART RACE PCR手册中描述的方案，DNA聚合酶，Advantage Taq(Clonetech)，一种高保真度的酶混合物，进行5′和3′末端扩增。
已从鸡肠中分离配子母细胞，如实施例1所述多次过滤并充分洗涤。担心剩余的鸡肠物质仍存在于该制剂中。因此，使用针对56和82kDa基因的氨基末端设计的简并引物和针对内部胰蛋白酶肽片段设计的简并引物进行PCR，在从纯化的配子母细胞和未感染的鸡细胞制备的cDNA样品中都产生条带。在该情形中，纯化在琼脂糖凝胶上用溴化乙锭强烈染色的PCR条带，克隆到pGEMT-Easy(Promega)中并测序(SUPAMAC测序服务，悉尼，澳大利亚)。在一些情形中，当观察到重排或者克隆的片段难以测序时，直接从PCR产物获得序列。如果将来自PCR产物的DNA序列数据翻译成胰蛋白酶肽的氨基酸序列中的任何一个，PCR产物是来源于寄生虫的，测序继续。
分别在图4和5中显示56和82kDa蛋白质的全长序列。在图12中表示230kDa蛋白质的全长序列。
56配子母细胞抗原的胰蛋白酶肽和N-末端的氨基酸序列与产生于相应克隆的DNA的推断的氨基酸序列匹配。
对于56kDa蛋白质将9条胰蛋白酶肽测序(表1)。除了1条，sb56i以外，全部肽可以被定位到对应于56kDa蛋白质的克隆的基因(图4)。该胰蛋白酶片段可以对应于存在于样品中的污染条带。详细地：
-胰蛋白酶肽sb56a，sb56b，sb56c，sb56d，sb56f和sb56h与通过克隆DNA预测的推断的氨基酸序列精确地匹配。
-胰蛋白酶肽sb56g不与通过克隆DNA预测的推断的氨基酸序列精确地匹配。重新分析胰蛋白酶片段的序列，新的序列与来源于克隆DNA的预测序列更紧密地匹配。
胰蛋白酶肽sb56g的原序列：
RQ--TAAWMDR-TA[L/I]EQEETT (SEQ.ID.NO.23)
重新分析的sb56g序列：
RGVQTAAWMDGVTA I EKEETT (SEQ.ID.NO.24)
从DNA推断的氨基酸序列：
RGVQTAAWMNGVTA I EKEETT (SEQ.ID.NO.25)
在该肽中在氨基酸10处仍存在差异，其中蛋白质序列显示D而DNA序列预测N。将该DNA片段测序4次，每次预测N。
82配子母细胞抗原的胰蛋白酶肽和N-末端的氨基酸序列与来源于相应的克隆DNA的推断的氨基酸序列匹配。
对于82kDa蛋白质将7条胰蛋白酶肽测序(表1)。除了两条，sb82d和sb82e以外，全部肽可以被定位到对应于82kDa蛋白质的克隆基因。该胰蛋白酶肽片段可能对应于样品中存在的污染条带。详细地：
-胰蛋白酶肽sb82a，sb82b，sb82c，sb56d和sb82f与通过克隆DNA预测的推断的氨基酸序列精确地匹配。
-胰蛋白酶肽sb82d和sb82e不与通过克隆DNA预测的推断的氨基酸序列匹配。
除了上述序列信息以外：
1)编码成熟形式的82kDa蛋白质的ORF的预测大小为64,275Da，其与通过质谱法测定的62,236Da的天然蛋白质的真实大小相符。
2)编码成熟形式的56kDa蛋白质的ORF的预测大小为51,407Da，其与通过质谱法测定的52,450Da的天然蛋白质的真实大小相符。
最后，两个蛋白质和DNA序列与其它任何已知基因或蛋白质未显示任何同源性。
实施例6
使用56和82kDa cDNA克隆的探针的DNA和RNA印迹
通过首先用多种限制性内切酶切割DNA并在琼脂糖凝胶上分离产生的DNA片段进行使用巨型艾美球虫和鸡DNA的DNA印迹法。接着将DNA转移至硝化纤维素纸，使用p32标记的关于56(图6)或82(图7)kDa抗原的cDNA探针探测并进行放射自显影。该结果显示对于56和82kDa抗原似乎存在两个不同的单拷贝基因，其编码两种蛋白质。
通过在琼脂糖凝胶上分离RNA分子，将它转移至硝化纤维素滤器并用p32标记的56和82cDNA克隆探测来进行使用巨型艾美球虫和鸡RNA的RNA印迹法。结果显示56kDa mRNA具有大约1.9KB的分子量，82kDamRNA具有大约2.4KB的分子量(图8)。这些大小与从DNA序列预测的那些非常类似。
实施例7
使用pTrcHis载体在大肠杆菌中表达重组56和82kDa抗原并使用抗天然APGA的血清分析它们
使用基因特异性引物从巨型艾美球虫配子母细胞的cDNA扩增编码82kDa蛋白质的全长基因，所述基因特异性引物携带末端限制酶切位点以促进直接克隆于表达载体pTRCHisb(Invitrogen)中。全长基因包括成熟蛋白质氨基末端的编码区和直到但不包括终止密码子的序列(575aa)。使用携带末端限制酶切位点的基因特异性引物，从巨型艾美球虫配子母细胞的cDNA扩增编码56kDa蛋白质的基因的部分片段。这包括蛋白质的氨基末端和另外的323个氨基酸的序列，比全长的成熟蛋白质短133个氨基酸。将两个基因克隆到可商购的载体pTrcHisb(Invitrogen)中。
1)在pTrcHis B中表达56kDa基因
用1mM IPTG诱导转化的细菌，通过1D-SDS PAGE和免疫印迹分析细菌裂解物(图9)。针对重组蛋白质His融合标记的可商购抗组氨酸抗体在诱导条件下识别预测大小为40kDa的条带(该克隆缺乏133个氨基酸的编码区)。在非诱导条件下也存在与该条带的低水平的反应性，说明存在某种程度的基因表达泄漏。然后使用鸡多克隆抗-APGA抗体通过免疫印迹评估重组56kDa蛋白质的识别。免疫印迹显示抗-APGA抗体识别经过单向SDS-PAGE的天然形式的蛋白质，以及重组蛋白质，清楚地证明克隆的基因产物确实编码56kDa蛋白质。
2)在pTrcHis B中表达82kDa基因
用1mM IPTG诱导转化的细菌，通过1D-SDS PAGE和免疫印迹分析细菌裂解物(图10)。针对重组蛋白质His融合标记的可商购抗组氨酸抗体在诱导和非诱导条件下识别预测大小为82kDa的条带。然后使用鸡多克隆抗-APGA抗体通过免疫印迹评估重组82kDa蛋白质的识别。该抗体是通过用分离自纯化的配子母细胞的天然APGA免疫鸡产生的。免疫印迹显示抗-APGA抗体识别经过1D SDS-PAGE的天然形式的蛋白质，以及重组蛋白质，清楚地证明克隆的基因产物确实编码82kDa蛋白质。
基于上述结果，加上在实施例5中描述的序列分析，我们得出结论，上述两个cDNA克隆是编码56和82kDa抗原的真正基因。另外，与针对天然抗原产生的抗血清的强烈反应性显示这些重组蛋白质目前可以用于替代APGA用于鸡抗球虫病的免疫。
实施例8
56kDa抗原与来源于巨型艾美球虫卵囊的30kDa抗原的同源性
将针对APGA的抗体用来检测卵囊抗原的双向印迹上的同源蛋白质。我们发现与30kDa蛋白质存在极强的反应性(图11)。将该斑点从薄膜滤器上切割下来并将蛋白质的N-末端测序。产生的氨基酸序列与配子母细胞56kDa抗原的N-末端序列精确相符。基于该发现我们得出结论，配子母细胞56kDa抗原被加工成卵囊发育阶段的30kDa蛋白质。
实施例9
gam56，来源于巨型艾美球虫的56kDa配子母细胞抗原的表达
天然蛋白质：Mr 56,000(通过分子筛分(molecular sizing)(MS)测定大小：52,450Da)
来源：寄生虫：巨型艾美球虫
生活周期：大配子母细胞
基因：测序的1,754个碱基对提供超过5个聚合酶链反应(PCR)片段，全部都被克隆到pGEMT-Easy中，除了包括编码区～400bp的基因的最后～600bp以外。
5’UTR(1-102bp)
ORF(103-1,533bp)
3’UTR(1,534-1,731bp)
聚腺苷酸尾(1,732-1,754bp)
pI：4.8，从序列预测(通过2D SDS-PAGE，蛋白质向凝胶的酸性末端迁移)
表达构建体
使用的表达载体：pTRCHisb，pET25b
表达构建体：赠予的p56TRCHisb1
克隆于表达载体中的基因片段：
gam56是使用下列引物对从cDNA扩增的：用于直接克隆到TRCHisb的BamHI/EcorI位点的SB74/SB75(172-1137bp)。扩增区域包括编码成熟蛋白质的氨基末端的序列，不包括起始甲硫氨酸和前导序列。它包含富含酪氨酸-丝氨酸区域并且不包括富含脯氨酸-甲硫氨酸的区域。
克隆的gam56片段的氨基酸组成
存在2个半胱氨酸
克隆到pTRCHisb中的基因片段的氨基酸组成：
S(12.7％) Y(11.5％) A(8.7％) T(8.4％) P(7.2％)
R(6.6％) E(6.0％) M(5.5％) L(5.5％) V(4.6％)
Q(4.3％) N(4.3％) G(3.8％) D(3.5％) W(1.7％)
F(1.4％) K(1.4％) I(1.4％) H(0.9％) C(0.6％)
预测的蛋白质大小：41kDa
产率：0.9-1.4μg/ml(镍琼脂糖纯化的蛋白质/ml培养物)在考马斯亮蓝染色的凝胶上的细菌粗提物中难以看见诱导的蛋白质。
表达条件：
启动子是渗漏的，因此在缺乏IPTG的情况下我们可以获得表达。
使用带挡板的烧瓶，用1mM IPTG 37℃诱导4小时，在0.01MMg2+SOB中0.1mg/ml氨苄青霉素(SOB比LB好)。
通常，在纯化和用银染色法检测后获得～42kDa的一条主要条带。与主要的～42kDa条带一样，在纯化后经常获得一些更高分子量的条带，其可以是聚集体。蛋白质似乎在-20℃和4℃聚集；在纯化后我们脱盐和加入稳定剂(3％乳糖，1％谷氨酸一钠)。
实施例10
重组56kDa(r56)和82kDa(r82)配子母细胞抗原，和250kDa(r250)无性繁殖阶段抗原在鸡中的免疫和攻击试验
免疫
动物
鸡：-84日龄(～12周)澳洲黑小公鸡(Australorp cockerels)
-用含药(罗贝胍(robenidene))的食物喂养
-所有的鸡被个别地标记和记录
抗原
在37℃下，在0.1mg/ml氨苄青霉素的0.01M Mg2+SOB中培养pTRCHisb表达系统中的重组蛋白质，并用1mM IPTG诱导4小时。在Ni-琼脂糖柱上纯化蛋白质，浓缩，脱盐，并与稳定剂(3％乳糖，1％谷氨酸一钠)一起冻干。使用Bradford测定测量对于所有抗原所使用的蛋白质浓度。由M.Wallach提供的亲和纯化的配子母细胞抗原(APGA)制剂被用作试验的阳性对照。
组和剂量
-每组使用9只鸡；总共9组；总共使用81只鸡。
-以下列抗原，每只鸟用0.5ml抗原/弗氏不完全抗原(FIA)混合物(0.25ml抗原/0.25ml FIA)，只在鸡的一侧通过肌内免疫鸡：
组1 仅PBS
组2 佐剂(FIA)/PBS
组3 APGA(2.5g)
组4 r250蛋白质(1.0g)
组5 r250蛋白质(10.0g)
组6 r56蛋白质(0.5g)
组7 r56蛋白质(5.0g)
组8 r82蛋白质(0.5g)
组9 r82蛋白质(5.0g)
免疫程序
免疫1： 第1周
免疫2： 第3周
放血： 第6周
放血： 第8周
放血/处死： 第9周
分析
-采血(～1.5-2ml/鸟)，分离血清并通过ELISA和免疫印迹检验
结果
放血的结果在图14中显示。
攻击
动物和寄生虫
-使用来自基于第1次放血的ELISA的结果，具有最高抗体效价的每组的5只鸡(148日龄；～4.5个月)；在PBS和FIA对照的情形中，使用具有最低抗体效价的鸡
-巨型艾美球虫(品系Houghton)；
-在攻击前1周从饲料中去除罗贝胍
组
下列各组和鸡是取自如上所述的免疫试验，并用于攻击实验中
组1 仅PBS 鸡号码2，3，4，6，8
组2 佐剂(FIA)/PBS 鸡号码12-16
组3 APGA(2.5g) 鸡号码20，22，23，25，27
组5 r250蛋白质(10.0g) 鸡号码37，39，41，44，45
组7 r56蛋白质(5.0g) 鸡号码57，59，60，61，63
组9 r82蛋白质(5.0g) 鸡号码74，75，76，79，80
攻击程序
去除罗贝胍
第6天每只鸟用100个形成孢子的卵囊攻击
卵囊收获和计数程序
感染后第0天
感染后第1天
感染后第2天
感染后第3天
感染后第4天
检查污染另一物种的卵囊排出量
替换塑料片开始收集。
感染后第5天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第6天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第7天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第8天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第9天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第10天收集粪便，并将卵囊计数
表2免疫和攻击试验I组/天p.i. 累积的卵囊数(×106) 6 7 8 9 10 输出(％) 6 7 8 9 10 ％抑制 6 7 8 9 10
1.仅PBS 6.67 17.0 0 26.4 0 27.3 3 27.4 3 100 100 100 100 100 0 0 0 0 0
2.仅FIA 3.20 14.4 0 17.3 0 17.5 0 17.5 0 48 (100) 85 (100) 66 (100) 64 (100) 64 (100) 52 (0) 15 (0) 34 (0) 36 (0) 36 (0)
3.APGA(2.5μg) 2.77 9.35 13.4 8 13.5 8 13.6 1 42 (87) 55 (65) 51 (78) 50 (78) 50 (78) 58 (13) 45 (35) 49 (22) 50 (22) 50 (22)
5.r250(10μg) 0.83 8.35 13.7 2 14.7 2 14.7 2 12 (26) 49 (58) 52 (79) 54 (84) 54 (84) 88 (74) 51 (42) 48 (21) 46 (16) 46 (16)
7.r56(5μg) 0.33 4.53 7.20 8.16 8.53 5 (10) 27 (32) 27 (42) 30 (47) 31 (49) 95 (90) 73 (68) 73 (58) 70 (53) 69 (51)
9.r82(5μg) 4.23 10.3 3 14.7 3 14.9 3 15.0 6 63 (132) 61 (72) 56 (85) 55 (85) 55 (86) 37 (0) 39 (28) 44 (15) 45 (15) 45 (14)
实施例11
250kDa无性繁殖阶段蛋白质的重组片段的表达
选择编码预测的跨膜区域/胞质尾区和上游亲水区域的250kDa蛋白质的区域用于表达研究(图15)。选择该区域是因为许多原因，如下所述：1)在许多顶复门的微丝蛋白质中已经鉴定了类似的3′亲水尾部区域并似乎对于该蛋白家族是独特的；2)在其它微丝蛋白质中该区域也被鉴定为免疫显性，主要是柔嫩艾美球虫微丝蛋白质1(EtMIC1)和表面抗原5401(EtMIC4)；3)从柔嫩艾美球虫5401抗原(EtMIC4)中表达类似的区域并发现提供针对柔嫩艾美球虫攻击的显著保护(Danforth等，1988)；4)蛋白质的其它区域主要由EGF样和TSP-1样结构域组成。发现这些结构域类型在真核生物中高度保守，因此必须考虑它们诱导自身免疫的可能性。另外因为该结构域类型的普遍性，它们似乎不太可能负责诱导强烈的免疫应答。
设计PCR引物EP006(5′-TTGGATCCCGAATTGCACCCCA TTCC-3′)和EP007(5′-TTGAATTCTGAATGTCGCCGCTGTCG-3′)以从编码250kDa蛋白质的cDNA克隆扩增选择的DNA区域。引物结合BamHI(EP006)和EcoRI(EP007)限制酶切位点以促进克隆于选择的表达载体中。将使用该引物随后产生的PCR产物凝胶纯化并通过测序证实它的同一性。
选择细菌表达载体pTrcHisB(Invitrogen)用于表达研究。用限制酶BamHI和EcoRI消化质粒载体DNA和凝胶纯化的cDNA插入片段，将消化的DNA片段凝胶纯化和连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5a中并接着铺平板和温育，选择产生的克隆，培养并用于质粒制备。通过DNA测序证实选择的重组体的同一性。
为表达作准备，将包含表达构建体的质粒DNA转化到大肠杆菌宿主表达菌株TOP10中。在铺平板和温育后，选择单个细菌克隆并用于建立LB培养基的O/N培养物。还建立仅有载体的阴性对照培养物。然后将每个培养物的等分试样转移至新鲜的LB培养基，并温育直至细胞到达对数中期，在该阶段加入1mM IPTG诱导阶段表达。在诱导后0，1，2，5和24小时后从表达培养物和阴性对照培养物中取样，并离心将细菌细胞沉淀。然后将所有沉淀重悬浮在TE缓冲液中，超声处理并离心以将水溶性级分(上清液)从不溶性级分(沉淀)中分离。在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上分析所有级分并随后用考马斯亮蓝染色。当与阴性对照样品相比时，在可溶性级分中检测到过量表达的蛋白质，其迁移至刚好在45kDa标记之下。使用抗体的可溶性级分的Western分析检测到相同表观分子量的蛋白质条带，所述抗体是与pTrcHis表达产物的6×组氨酸标记反应性的。表达蛋白质的预测大小大约是30kDa，稍微小于在SDS-PAGE凝胶上所观察到的。大小差异可能通过在表达蛋白质中高频率的脯氨酸残基来解释，已知其导致蛋白质以明显高的分子量迁移。
为免疫原性试验作准备，对制造厂商的推荐方案较小修改，使用Ni-NTA琼脂糖带镍(nickel-charged)树脂(QIAGEN)纯化表达的蛋白质。包含6xHis标记的表达蛋白质与树脂结合并被洗脱缓冲液中增大浓度的咪唑替换。简短地，将细胞沉淀重悬浮在包含1mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)中。在冰上将悬浮液超声处理并离心沉淀不溶性物质。然后将包含可溶性的表达蛋白质的上清液与Ni-NTA树脂混合并加至一次性洗脱柱。使淤浆沉降然后用洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤，之后用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱。通过还原的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱级分的纯度。
免疫原性试验的细节是关于56kDa和82kDa试验的。对于小鼠试验，每只小鼠使用0.5μg和5μg剂量的重组蛋白质(6只小鼠/组)。对于鸡试验，每只鸟使用1μg和10μg剂量(9只鸟/组)。对于从小鼠和鸡试验中收集的血清样品的ELISA结果分别在图16和17中表示。
实施例12
艾美球虫属的卵囊壁来源于在寄生虫有性阶段(大配子母细胞)中发现的前体蛋白，其经历加工和二酪氨酸交联以形成寄生虫分泌形式的硬化的，保护性屏障。
编码56kDa和82kDa有性阶段，大配子母细胞抗原的基因已经被克隆和测序。两个基因都显示异常的氨基酸组成，尤其是，两个都含有富含酪氨酸的区域；56kDa蛋白质具有一个富含酪氨酸区域，82kDa蛋白质具有二个富含酪氨酸的区域。富含酪氨酸的蛋白质先前在堆型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的卵囊壁形成中涉及。(Eschenbacher等)因此，在巨型艾美球虫中研究在卵囊壁形成中，在56kDa和82kDa有性阶段抗原中的富含酪氨酸区域的作用。
针对重组形式的56kDa蛋白质的抗体(抗-r56)和针对重组形式的82kDa蛋白质的抗体(抗-r82)识别不形成孢子和形成孢子的卵囊中的～30kDa蛋白质，和在纯化的壁碎片中的～30kDa蛋白质(参见图18和19)。它们还识别在配子母细胞提取物中它们天然形式的配对物。在纯化的卵囊壁片段中被抗-r82kDa抗体识别的～30kDa蛋白质与被抗-r56识别的～30kDa蛋白质不同；它稍微较小。纯化被抗-r56抗体识别的～30kDa蛋白质并N-末端测序。～30kDa蛋白质的N-末端精确地对应于56kDa配子母细胞抗原的N-末端(参见图20a)。
其他的人已经通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示艾美球虫属的卵囊壁是由14kDa和30kDa两个主要的蛋白质组成。使用更好的SDS-PAGE分离技术，我们已经将14kDa蛋白质解析成～10-14kDa的3种组分，将它们命名为14.1，14.2和14.3，其中14.1表示已经在SDS-PAGE凝胶上迁移最慢的蛋白质，而14.3表示最快(参见图18c)。我们已经将所有4种蛋白质的N-末端测序并在图20中显示结果。总之，30kDa蛋白质是一种新的蛋白质，如通过BLAST蛋白质搜索所确定，其未与其它任何先前表征的蛋白质显示任何相似性(参见图20c)。蛋白质14.3的N-末端对应于82kDa蛋白质结构域1中富含酪氨酸区域的开始(参见图20b)，蛋白质14.2的N-末端对应于82kDa蛋白质结构域2中富含酪氨酸区域的开始(参见图20b)，蛋白质14.1的N-末端对应于56kDa蛋白质中富含酪氨酸区域的开始(参见图20a)。
这些结果一起显示，艾美球虫属的卵囊壁来源于在寄生虫有性阶段(大配子母细胞)的成壁体中发现的前体蛋白。通过一些信号机制，它们被蛋白水解加工成几个较短的～30kD和～14kDa的蛋白质。与先前发现相反，我们的数据显示，卵囊壁是由多于两种蛋白质组成。我们的发现提示卵囊壁是由几种在寄生虫中处于不同水平的蛋白质组成，一些蛋白质是高度充足的，它们可以通过SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色来识别，而其它的是以低水平存在，只能通过更灵敏的免疫印迹技术来检测。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶中看见的～30kDa蛋白质与56kDa和82kDa配子母细胞抗原无关，然而，较小的～10-14kDa蛋白质是相关的。我们最近发现，二酪氨酸是以0.00338mmol/mol的级别的可检测水平存在于卵囊中，显示小的富含酪氨酸的蛋白质可能通过涉及二酪氨酸交联的机制被固定在壁中。然而，我们相信并不是所有的蛋白质都以该方式被固定在壁中，当前正在研究这个问题。
参考文献
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