对幽门螺杆菌具有消毒作用的食品或饮料产品 本发明的详细描述
本发明所属技术领域
本发明涉及对幽门螺杆菌(He1icobacter pylori，本文有时下称H.pylori)具有消毒作用和/或防止幽门螺杆菌感染的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，本文有时下称L.gasseri)，以及含该乳酸菌的食品或饮料产品。现有技术
自从1983年瓦伦(Warren)等人发现幽门螺杆菌是作为在胃中存活的细菌以来[Lancet,I.1273(1983)]，关注的重点放在其与慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡之间的关系。最近已经证实：受幽门螺杆菌感染的蒙古沙鼠在没有给予任何致癌物的情况下出现了胃腺癌[Watanabe等人，胃肠病学(Gastroenterology),115；642(1988)]，而且幽门螺杆菌与胃癌的关系也已经被认为是作为一种病原细菌。
同时，对患消化性溃疡和幽门螺杆菌呈阳性的病人进行幽门螺杆菌消毒能够抑制消化性溃疡的复发，因此，幽门螺杆菌的活性消毒疗法已在欧洲和美国运用。就幽门螺杆菌的消毒方法而论，常用的有抗菌素(β-内酰胺，氨基糖苷，大环内酯，四环素类等)和抗溃疡剂相组合的方法；例如，临床采用三种药物的结合治疗方法，即两类抗菌素(6-甲氧基红霉素-甲硝唑或阿莫西林)加上一种抑制胃酸分泌的质子泵抑制剂(proton pump inhibitor)。但是，为消毒治疗目的而施用抗菌素之类的药物最严重的缺点是：由于高剂量药物的多重组合，增加了幽门螺杆菌抗药发生频率，以及产生严重的副作用，如腹泻和过敏等。
为了代替抗菌素达到在胃中对幽门螺杆菌消毒地目的，已经检查试验过如下方法：包括乳铁传递蛋白给药的方法(JP-公开130164/1998)，采用由脲酶和幽门螺杆菌鞭毛作为抗原对鸡进行免疫获得的特殊抗原的方法(JP-公开287585/1998)，包括采用特殊单一短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株和/或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株(JP-公开241173/1997)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株(JP-公开98782/1994)的各种活细菌给药的方法，这是作为使用乳酸菌的方法。然而，没有令人满意的方法见诸报道。
另一方面，由于乳酸菌可产生香味物质，并能够产生象乳酸和细菌素一类的抗菌物质，故乳酸菌是在世界范围内以发酵乳品等形式的传统食品中非常安全的微生物。因此，可以说利用乳酸菌的抗菌作用对幽门螺杆菌消毒是简单而有效的方法，同时没有副作用。
在现有发明中，实现了对乳酸菌菌株的选择，特别是短乳杆菌菌株和/或唾液乳杆菌(JP-公开241173/1997)，但这些发明不仅没考虑到作为幽门螺杆菌的目标场所的胃的环境特性(要耐低PH环境)，而且没有注意到作为使用该乳酸菌菌株制备的食品如发酵乳品的性能(乳酸菌菌株的存活率，风味及物理特性)。此外，一项报道说明临床试验所用的嗜酸乳酸菌是无效的[Bazzoli等人，胃肠病学(Gastroenterology),102,No.4,A38,(1992)]。再则，JP-公开98782/1994所述的嗜酸乳酸菌菌株培养物上清液显示了对幽门螺杆菌的消毒可能性，但从未证明该作用可以得以保持[Michetti等人，胃肠病学(Gastroentero1ogy),108,No.4,A166,(1995)]。如上所述，为了制备适于消毒幽门螺杆菌的目标组合物，现有的乳酸菌需要在很多方面进行改进。本发明要解决的问题
在目前这种工业状况下，要求针对抗胃炎和抗十二指肠病症建立一种消毒幽门螺杆菌和防止幽门螺杆菌感染的体系，本发明人从安全和口服角度出发再次将注意力转向了乳酸菌，并且已打算利用乳酸菌开发一种消毒幽门螺杆菌和防止幽门螺杆菌感染的体系。
更具体地说，本发明要解决的问题是选择一种乳酸菌菌株，该菌株在胃中具有高存活率和高繁殖特性，在动物实验中具有明显的抗幽门螺杆菌活性和用于食品如发酵乳品中的显著性能(乳酸菌菌株的成活率，风味及物理特性)，以及利用该乳酸菌提供一种为消毒幽门螺杆菌和防止幽门螺杆菌感染的价廉且可每日摄取的新食品或饮料产品。附图简要说明
图1显示了加氏乳杆菌OLL2716基因组DNA的ApaⅠ消化模式(脉冲场电泳)。解决问题的手段
本发明的目的是解决上述问题。为了筛选所需的乳酸菌，本发明人设立了下述标准并尽努力进行筛选工作。更具体地说，本发明人已通过研究从人肠道派生的大量乳杆菌中筛选出具有以下性质的一种细菌菌株：1．高耐胃酸性；2．在低PH条件下生长良好；3．对幽门螺杆菌附着到人体胃癌细胞MKN45具有高抑制能力；4．在混合物中进行幽门螺杆菌培养时具有对幽门螺杆菌生长的高抑制能力；5．对受幽门螺杆菌感染的试验鼠给药剂时，具有高消毒能力；6．当用于食品时，具有高存活率、良好的风味和物理特性。本发明人已发现加氏乳杆菌OLL 2716作为细菌菌株可以满足这些条件(细菌菌株的保藏号是FERM BP-6999，保藏机构是国立生命科学和人体技术研究所，通商产业省。该细菌菌株的细菌学特性如下：
1．形态学特征
细胞形态：杆状菌
泳动度(mobility)：无
存在或不存在胞子：不存在
革兰染色：阳性
2．生理学特性(阳性：+；阴性：-；弱阳性：W)
过氧化氢酶 -
产气 -
15℃生长 -
葡萄糖酸的吸收 -
乳酸的旋光性 DL
需氧生长 +
3．碳水化合物的发酵性能(阳性：+；阴性：-；弱阳性：W)
树胶醛醣 -
木糖 -
鼠李糖 -
核糖 -
葡萄糖 +
甘露糖 +
果糖 +
半乳糖 +
蔗糖 +
纤维二糖 +
乳糖 +
海藻糖 +
密二糖 -
密三糖 -
松三糖 -
淀粉 w
甘露醇 -
山梨醇 -
糊精 w
4．遗传特征
DNA中鸟嘌呤(G)和胞核嘧啶(C)的含量是36.4％。另外，根据泰诺克(Tannock)等人的方法[微生物生态健康分布(Microbial.Ecol.Health Dis.),8:79-84,1995；环境应用微生物学(Appl.Environ.Microbiol),62:4608-4613]；培养加氏乳杆菌OLL 2716；该细菌固定在琼脂糖栓(plug)上然后溶解；基因组DNA用限制性核酸内切酶(ApaⅠ)进行消化，经过脉冲场凝胶电泳处理(CHEF-DRⅡBIO-RAD)重新获得图1所示的带形图案。该图中A表示加氏乳杆菌菌株OLL 2716；B表示尺寸标记。
5．胃酸耐受性
胃酸耐受性实验按以下方式进行。即，1毫升(ml)加氏乳杆菌OLL2716菌株的细菌悬浮液在MRS液体培养基(DIFCO)中经活化作用进行两次培养(37℃,18小时)，用生理盐水清洗两遍，该细菌悬浮液加入到9ml人造胃酸液中[0.2％NaCl,0.35％胃蛋白酶(1∶5000)溶于蒸馏水中]，其PH为2.0，经过滤灭菌，于37℃下有氧接触2小时；然后取1ml加入到9ml、PH6.5的磷酸盐缓冲溶液中(67mM)以终止反应。初始细菌数量和接触人造胃酸液后的细菌数量通过MRS琼脂计数来计算存活比例。在人体肠道派生出的乳杆菌(150种菌株)中，加氏乳杆菌菌株OLL 2716的胃酸耐受性最强，与其他细菌菌株的胃酸耐受性相比，加氏乳杆菌菌株OLL 2716的胃液耐受性最强(表1)。
[表1]
各种乳杆菌对人造胃酸液的耐受性细菌菌株经2小时处理后 的存活率 (％)加氏乳杆菌OLL 2716 0.53嗜酸乳杆菌JCM 1132 T 0.48鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(ATCC 53103) 0.018唾液乳杆菌WB 1004(FERM P-15360) 0.004短乳杆菌WB 1005(FERM P-15361) 0.18
6．低PH值条件下的生长
10微升(μl)加氏乳杆菌菌株OLL 2716在MRS液体培养基(37℃,18小时)中经活化作用进行两次培养，该乳杆菌接种到改性的MRS液体培养基上[0.2％NaCl,0.35％胃蛋白酶(1∶5000)溶于MRS液体培养基中，并将PH值调至4.0]，在37℃下进行需氧培养。从开始培养9小时后，测量培养基的浊度(OD650)作为生长程度。结果，加氏乳杆菌OLL 2716在低PH值条件下的生长度最大(表2)。
[表2]
各种乳杆菌在低PH值条件下的生长情况细菌菌株 培养9小时后的OD650加氏乳杆菌OLL 2716 0.255嗜酸乳杆菌JCM 1132 T 0.030鼠李糖乳杆菌GG(ATCC 53103) 0.222唾液乳杆菌JCM 1231 0.116
7．对人体胃癌细胞(MKN 45)的附着力
根据格拉纳托(Granato)等人的方法，加氏乳杆菌OLL 2716和嗜酸乳杆菌CNCM I-1225对人体胃癌细胞MKN 45的附着力已作过测定[环境应用微生物学(Appl.Environ.Microbiol.),65(3),1071-1077,(1999)]，格拉纳托等人测定了乳酸菌在人体大肠癌细胞上的附着力。采用10ml含10％FCS的RPMI 1640培养基(RPMI，Nissui Pharmaceuticals),MKN 45在37℃下培养3天。经培养后，该细胞被剥落并用RPMI冲洗，再将其悬浮于RPMI中使得细胞最终浓度为5×104细胞/毫升(cells/ml)，然后在96-井(池)微量培养板中分成0.1毫升/井(ml/well),37℃下又培养3天后，附着到微量培养板上的MKN 45用0.1M、PH 6磷酸盐缓冲液冲洗以制备MKN 45单层。在MRS液体培养基(DIFCO)中培养后悬浮在0.1M、PH6磷酸盐缓冲液中使之达到109℃FU/ml的0.1ml加氏乳杆菌0LL2716或嗜酸乳杆菌CNCM I-1225的悬浮液加入到该单层上；形成的混合物在37℃下培养(恒温)30分钟。用0.1M、PH6磷酸盐缓冲液将MKN 45单层冲洗三遍；将从未附着的乳酸菌除去。附着在MKN 45上的乳酸菌进行革兰染色并且通过显微镜计数。结果发现附着在MKN45上的加氏乳杆菌0LL 2716的细菌数量比嗜酸乳杆菌CNGM I-1225的细菌数量要大。换言之，这证明了加氏乳杆菌0LL 2716具有对人体胃癌细胞的高附着力(表3)。
[表3]
加氏乳杆菌菌株OLL 2716对人体胃癌细胞的附着力每100个MKN 45细胞附着的细菌数量(平均值±标准偏差)加氏乳杆菌菌株OLL 2716 560±55**嗜酸乳杆菌CNGM I-1225 234±30**：p＜0.01(Student实验，n=4)
加氏乳杆菌菌株0LL 2716被选择作为一种细菌菌株，该菌株在人体胃环境中具有高的胃酸耐受性，在低Ph值条件下生长良好，通过以药剂(抗胃炎剂，抗溃疡剂)或食品(发酵乳品，液体，糊体，干产品)形式施用该细菌菌株的活细菌能够对幽门螺杆菌消毒并防止主体受幽门螺杆菌的感染，从而防止胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡的发作或复发。因此，加氏乳杆菌菌株OLL 2716的抗幽门螺杆菌活性，其酸牛奶产品性能(货架寿命，风味和物理特性)，以及受幽门螺杆菌感染的试验鼠给予药剂时加氏乳杆菌菌株OLL 2716对幽门螺杆菌的消毒作用都将参照实施例作详细描述，但本发明不受这些实施例的限制。
更具体地说，本发明涉及对幽门螺杆菌具有消毒作用和/或防止受幽门螺杆菌感染的食品，该食品包含至少一种对幽门螺杆菌具有高消毒能力的属于加氏乳杆菌的乳酸菌，含该乳酸菌的原料和其加工的产品。
含该乳酸菌的原料包括乳酸菌的悬浮液；乳酸菌的培养物(包括该细菌，培养物上清液，培养基组分)；通过从乳酸菌培养物中丢弃固体而制备的乳酸菌培养液；乳酸菌发酵乳品，包括通过发酵乳酸菌制备的食品或饮品，如乳酸菌饮料、酸奶(acid milk)和酸牛奶(yogurt)等等。
加工产品包括乳酸菌浓缩物，含乳酸菌的原料，以及发酵乳；其糊状产品；干品(喷雾干燥产品，冻干产品，真空干燥产品，转鼓干燥产品等)；其液体产品；其稀释产品等。此外，活细菌、湿细菌和干细菌等都可适用作乳酸菌。
本发明的食品或饮品含有至少一种乳酸菌，含该菌的原料和其加工的产品作为有效成分，它可用作健康食品。
要混合的有效成分的量是任意的，可以根据其应用目的(预防、保健或治疗目的)适当地确定。合适的用量范围通常为0.0001-10％。为健康和保健目的或为健康控制目的而长期服用时，该用量可能应低于上述范围；由于该有效成分从安全角度考虑不成问题，它绝对可以按上述用量范围使用。给老鼠喂食10天的准确毒性实验的结果证明：按5000毫克/公斤/天(mg/kg/day)的口服剂量没有发现死亡。
有效成分可直接用于食品或饮品，或者按常规方法与其它食物原料和食物成分适当地组合。使用该有效成分的本发明组合物可呈糊状、液体和悬浮物的任何形式，但该组合物优选通过使用在饮品生产中惯常使用的甜味剂、酸味剂、维生素和其它多种成分将该组合物制备成健康饮品。
根据本发明，加氏乳杆菌菌株OLL 2716的活菌可通过例如发酵乳的形式而摄入，发酵乳主要包括酸牛奶(天然味酸牛奶(plainyogurt)，水果酸牛奶，酸牛奶饮料，和冷冻酸牛奶)，乳酸菌饮料，粉状食品，颗粒食品以及糊状食品等。当加氏乳杆菌菌株OLL 2716用于制备上述发酵乳品时，该菌株在产品性能方面(货架寿命，风味，物理性能)特别优异。因此，以发酵乳形式将加氏乳杆菌OLL 2716给药方法是最理想的。为了制备发酵乳，采用以下菌与加氏乳杆菌菌株OLL 2716一起作为发酵剂的方法是有效的：乳杆菌属中的乳酸菌，链球菌属(Streptococcus)，明串珠菌属(Leuconostoc)，足球菌属(Pediococcus)等，长双歧杆菌属(Bifidobacterium longum)的双歧杆菌，短杆菌(B.breve)，婴儿双歧杆菌(B.Infantis)，双叉杆菌(B.bifidum)等，以及酵母等。另外，制备发酵乳的加氏乳杆菌菌株OLL 2716也可用于按制备原培养物，扩大培养用发酵剂和生产用发酵剂这种顺序的方法中，还可用作较大细菌量的浓缩发酵剂(冷冻产品或冻干产品)，该发酵剂可直接接种成为生产用发酵剂或进行产品生产，而不需要扩大培养用发酵剂的步骤。试验例1
根据卡比尔(Kabir)等人的方法[Gut,41(1)；49-55,(1997)],幽门螺杆菌菌株NCTC 11637在人体胃癌细胞(MKN45)上的附着可由加氏乳杆菌菌株OLL 2716得到抑制。
为了制备幽门螺杆菌菌株CNTC 11637带荧光标记的细菌溶液，首先，幽门螺杆菌菌株NCTC 11637在含5％FCS(小牛胎儿血清)的Brucella液体培养基中和稍有氧条件下经活化作用进行两次培养(37℃,72小时)，然后将其用PBS冲洗并悬浮于一种细胞荧光标记工具PKH-2(Dai-Nippon Parmaceuticals,Co)的稀释液中使终浊度(OD650)为2.0。利用产气袋Aneropack Helico(Mitsubishi GasChemicals,Co.)进行稍有氧培养来培养该螺杆菌。向1ml该悬浮液中加入50μl荧光标记染料PKH-2，在室温下反应15分钟；之后，通过离心分离回收该细菌(每分钟3000转(rpm),10分钟(min))，用Hank’s平衡盐水溶液(HGS)冲洗，并悬浮于1mlHGS中；形成的该溶液被指定为荧光标记细菌溶液。然后，0.1ml幽门螺杆菌菌株NCTC11637的荧光标记细菌溶液(OD650=2.0)和0.1ml加氏乳杆菌菌株OLL2716的细菌溶液(OD650=4.0)同时加入到0.8ml MKN45的细胞悬浮液中(1×106cell/ml),37℃下有氧震摇1小时。MKN45的细胞悬浮液单用作空白样(0.8ml MKN45的细胞悬浮液+0.2ml HGS)；加有HGS的溶液代替加氏乳杆菌菌株OLL 2716细菌溶液用作阴性对照样。经震摇后，加入9ml含15％蔗糖的Dulbecco’s PBS[细胞培养技术第6版(Cell Culture Technique(the six edition)),AsakuraShoten,pp.20(1991)]，该细胞通过离心分离(1000rpm,10min)收集，HGS冲洗，再离心分离(1000rpm,10min)；然后将所得细胞再悬浮于1ml HGS中；将250μl所得悬浮液加入到96-井微量培养板中进行荧光化验；其荧光强度(激发波长：490nm，测量波长：530nm)用荧光板读出器测量。
假定幽门螺杆菌菌株NCTC 11637单独在胃癌细胞上的附着率定义为100％，那么在添加加氏乳杆菌菌株OLL 2716的体系中幽门螺杆菌菌株NCTC 11637的附着率为92.8％；因此证明了该细菌菌株对幽门螺杆菌在胃癌细胞上的附着具有抑制作用。试验例2
在加氏乳杆菌菌株OLL 2716抑制幽门螺杆菌菌株NCTC 11637生长的试验中，幽门螺杆菌菌株NCTC 11637和加氏乳杆菌菌株OLL2716在活化作用下培养两次并分别接种在含5％FCS以及终菌落形成单位为106CFU/ml和105CFU/ml的200ml Brucella液体培养基(DIFCO)中，37℃下稍有氧培养。幽门螺杆菌菌株NCTC 11637和加氏乳杆菌菌株OLL 2716的活菌数量从培养开始后0,24和48小时进行计数。为了检测幽门螺杆菌菌株NCTC 11637和加氏乳杆菌菌株OLL 2716，分别采用如下的培养基和培养条件：改性Skirrow培养基[马血(7％),BHI琼脂(52g)三甲氧苄氨嘧啶(5mg/l),多粘菌素B(2500U/ml),万古霉素(10mg/l)，杆菌肽(5mg/l)，蒸馏水(1000ml)](37℃,7天，稍有氧培养)，和MRS琼脂(37℃,48小时，有氧培养)。
结果，幽门螺杆菌菌株NCTC 11637的活菌数量在其单独培养48小时后增加到约5倍，但是在有加氏乳杆菌菌株OLL 2716共存的情况下，该活菌数量减少到约1/10；这证明了加氏乳杆菌菌株OLL 2716具有抑制幽门螺杆菌菌株NCTC 11637生长的能力(表4)。
[表4]
加氏乳杆菌菌株OLL 2716对抑制幽门螺杆菌菌株NCTC 11637生长的作用细菌菌株 0小时 24小时 48小时幽门螺杆菌菌株NCTC 11637 1.5×106 3.3×106 7.9×106幽门螺杆菌生长率(％) 100 220.0 526.7加氏乳杆菌菌株OLL 2716 2.2×105 7.4×107 4.5×l07幽门螺杆菌菌株NCTC 11637 1.9×106 1.2×106 1.8×105幽门螺杆菌生长率(％) 100 63.2 9.5试验例3
已经证明幽门螺杆菌能够在强酸条件下存活，因为幽门螺杆菌有能力降解脲和产生氨。为了测定加氏乳杆菌菌株OLL 2716在脲存在时对幽门螺杆菌菌株NCTC 11637生长的抑制能力，检测了该菌株和嗜酸乳杆菌菌株CNCM I-1225在低PH值条件下对幽门螺杆菌菌株NCTC 11637生长的抑制作用。幽门螺杆菌菌株NCTC 11637和加氏乳杆菌菌株OLL 2716或嗜酸乳杆菌菌株CNCM I-1225在活化作用下培养两次并分别接种在200ml PH为4.0的Brucella液体培养基中于37℃下稍有氧培养，该培养基含有5％FCS,5mM脲和终菌落形成单位分别为105CFU/ml和107CFU/ml。幽门螺杆菌菌株NCTC 11637和加氏乳杆菌菌株OLL 2716或嗜酸乳杆菌菌株CNCM I-1225的活菌数量从培养开始后0,6和12小时进行计数。
结果证明，在脲存在下经过6和12小时培养后，加氏乳杆菌菌株OLL 2716对幽门螺杆菌菌株NCTC 11637的抑制能力比嗜酸乳杆菌菌株CNCM I-1225要高。这亦证明了该细菌菌株即使在脲存在下仍对幽门螺杆菌生长具有高抑制力(表5)。
[表5]
在脲存在下，加氏乳杆菌菌株OLL 2716对抑制幽门螺杆菌生长的作用细菌菌株 0小时 24小时 48小时幽门螺杆菌菌株NCTC 11637 2.0×105 2.0×105 1.8×105幽门螺杆菌生长率(％) 100 100 90.0加氏乳杆菌菌株OLL 2716 1.5×107 4.0×107 1.2×108幽门螺杆菌菌株NCTC 11637 2.0×105 1.5×105 3.0×104幽门螺杆菌生长率(％) 100 75.0 15.0嗜酸乳杆菌菌株CNCM I-1225 1.6×107 2.5×107 8.9×107幽门螺杆菌菌株NCTC 11637 2.0×105 1.9×105 1.0×105幽门螺杆菌生长率(％) 100 95.0 50.0实施例1
使用加氏乳杆菌菌株OLL 2716制备天然味酸牛奶。更具体地，加氏乳杆菌菌株OLL 2716，保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)JCM1002T和嗜热酵母(S.thermophilus)ATCC 19258分别以1％的量接种到10％脱脂乳粉的培养基中，37℃培养15小时制备生产用发酵剂。在经过95℃热处理5分钟的酸牛奶混合物(SNF:9.5％,FAT:3.0％)中接种1％保加利亚乳杆菌JCM 1002T和1％嗜热酵母ATCC 19258的发酵剂以及5％加氏乳杆菌菌株OLL 2716的发酵剂；所得酸牛奶混合物在43℃下发酵4小时。在发酵后立即冷却，之后，加氏乳杆菌菌株OLL 2716，保加利亚乳杆菌JCM 1002T和嗜热酵母ATCC 19258的活菌数量分别为9.0×107CFU/ml,6.4×107CFU/ml,11.0×108CFU/ml,制出的酸牛奶具有良好的风味和物理性能。该酸奶在10□C储存2周后，加氏乳杆菌菌株OLL 2716，保加利亚乳杆菌JCM 1002T和嗜热酵母ATCC 19258的活菌数量分别为3.7×107CFU/ml,2.7×107CFU/ml,10.8×108CFU/ml，加氏乳杆菌菌株OLL 2716的活菌数量只有很少降低。该储存产品的风味和物理性能俱佳。对照例1
使用唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)制备天然味酸牛奶。更具体地说，采用与实施例1相同的步骤，其不同之处在于用唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)代替加氏乳杆菌菌株OLL2716。在发酵并冷却刚刚完成之后，唾液乳杆菌菌株WB 1004，保加利亚乳杆菌JCM 1002T和嗜热酵母ATCC 19258的活菌数量分别为5.3×107CFU/ml,6.0×107CFU/ml,12.5×108CFU/ml，制出的酸奶具有良好的风味和物理性能。该酸牛奶在10℃储存2周后，唾液乳杆菌菌株WB1004，保加利亚乳杆菌JCM1002T和嗜热酵母ATCC19258的活菌数量分别为0.1×107CFU/ml,4.5×107CFU/ml,8.8×108CFU/ml，唾液乳杆菌菌株WB1004(FERM-15360)的活菌数量减小到约1/50。
实施例和对照例1的情况可总结为下表。储存活菌数量(×107CFU/ml)酸性(％)PH风味OLL 2716 WB 1004实施例1储存前9.00.904.42优异2周3.71.114.07良好对照例1储存前5.30.874.40优异2周0.11.203.99浓烈酸味试验实施例4
为了测定服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716或唾液乳杆菌菌株WB1004(FERM-15360)活菌在体内对幽门螺杆菌的消毒作用，让无菌老鼠(BALB/c)感染幽门螺杆菌NCTC 11637，剂量为每只鼠1×109CFU；四周后，单独给这些受幽门螺杆菌感染的老鼠服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716和唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)，剂量为每只鼠1×109CFU，第一周喂3次，从第二周至第七周每周喂1次。服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716或唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)八周后，老鼠胃中的幽门螺杆菌数量和加氏乳杆菌菌株OLL2716或唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)数量分别在改性Skirrow培养基和MRS琼脂中进行计数，而血清抗幽门螺杆菌抗体效价(滴定值)(在492nm处的吸收)通过酶联和免疫吸收剂(ELISA)化验方法进行化验。
因此，八周后对照组老鼠(只服用幽门螺杆菌)胃中的幽门螺杆菌数量被检测为105CFU/g，而服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716和唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)活菌的老鼠其胃中的幽门螺杆菌数量被减低至可检出的极限值(103CFU/g或更低).但是，与对照组老鼠相比，服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716的老鼠其抗幽门螺杆菌抗体效价被降低至1/5或更低，与服用唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)的老鼠相比，该效价仍降低至1/4或更低(表6)。因此，证明了加氏乳杆菌菌株0LL 2716对幽门螺杆菌的消毒作用比唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)要高。另外还证明加氏乳杆菌菌株OLL 2716在胃中有繁殖能力，因为在服用加氏乳杆菌菌株OLL 2716八周后老鼠中的该服用细菌菌株被检测为106CFU/g。
[表6]
胃中乳杆菌的繁殖数量和对幽门螺杆菌NCTC 11637的消毒作用老鼠 胃容物中细菌数量(logCFU/g) 抗幽门螺杆 菌抗体效价 A492 唾液乳杆菌 加氏乳杆菌 幽门螺杆菌对照物(N=5，不服用乳酸菌) 未检测 未检测 5.2±0.04 0.488± 0.284*服用加氏乳杆菌菌株0LL 2716(N=6) 未检测 6.1±1.0 ＜3.0 0.086± 0.082*服用唾液乳杆菌菌株WB 1004(FERM-15360)(N=5) 6.1±0.8 未检测 ＜3.0 0.346± 0.276*：P＜0.05(谢夫实验(Scheffe test))试验例5
为了证明加氏乳杆菌菌株OLL 2716在人体中的功效，给年龄在40至60岁的30个幽门螺杆菌呈阳性的人(对象)服用含加氏乳杆菌菌株OLL 2716的酸奶。按照实施例l同样方法制备的90克(g)酸奶每天服用2次，共8周。对幽门螺杆菌的作用通过脲呼吸试验，血胃蛋白酶原(Ⅰ)，胃蛋白酶原(Ⅱ)和内窥镜检查(6例)。
由此，作为消毒幽门螺杆菌标记的血胃蛋白酶原(Ⅰ/Ⅱ)之比在30人中有26人得到改善；在脲呼吸试验中，发现28人中有21人得到改进。另外，对参加内窥镜检查的6人作了胃细胞中的幽门螺杆菌数量计数；结果表明在所有6人中幽门螺杆菌的数量都减少到服用前的1/10至1/100。参考例1
加氏乳杆菌菌株OLL 2716接种到5升(L)MRS液体培养基(DIFCO)中，37℃静置培养18小时。培养结束后，该培养物在7000转/分(rpm)下离心分离15分钟，获得体积为液体培养物体积1/50的细菌浓缩物。该细菌浓缩物然后与等体积的含10％重量脱脂乳粉和1％重量谷氨酸钠的分散培养基混合，并将PH值调至7，所得混合物随后进行冻干。该冻干产物粉碎后过60目筛，得到冻干细菌粉。参考例2
根据第13次修订版《日本药典指南》的“通用药物制备规则中‘粉剂’的规定”，400g乳糖(根据JP。)和600g土豆淀粉(根据JP.)加入到上述实施例所获得的1g加氏乳杆菌菌株OLL 2716的冻干细菌粉中，并均匀混合制备成粉剂。实施例2
脱脂奶在80℃至85℃灭菌20至30分钟，然后均质、冷却。向所得均浆中加入2％至5％的细菌菌株(FERM BP-6999)的纯培养物作为发酵剂，37至40℃下发酵16小时得到乳酸含量为2％的酸奶(在一种脱脂乳的培养基中的一种培养物)。破坏所形成的凝块后，该酸奶冷却至5℃，即为所指定的酸奶。
另一方面，制备含有15％蔗糖和适量酸味剂，风味剂及染料的糖溶液，将其均质，70℃至80℃灭菌20至30分钟，冷却至5℃，即为所指定的糖溶液。
将所得的糖溶液和酸奶按65∶35的比例混合，制备出酸奶饮料。实施例3
40g实施例1获得的在脱脂乳粉的培养基中的细菌菌株培养物的冻干产品中加入40g维生素C或40g等量维生素C和柠檬酸的混合物，100g砂糖，以及60g等量玉米淀粉和乳糖的混合物，然后充分混合。该混合物装入包装袋中制备出150袋、每袋1.5g的粘稠型营养保健食品。参考例3
基于以下组合物制备一种抗溃疡剂：(1)50g脱脂乳粉的培养基中的细菌菌株培养物的冻干产品；(2)90g乳糖；(3)29g玉米淀粉；和(4)1g硬脂酸镁。
首先，将(1)，(2)和(3)(这里用17g)混合，再与由(3)(这里用7g)制备的糊状物一起造粒。向所得颗粒中加入(3)(这里用7g)和(4)，所得混合物进行完全混合；该混合物再通过压片机制备成100片药片，每一药片含40mg活性组分。本发明的优点
根据本发明，可以有效地实现对幽门螺杆菌的消毒和/或防止幽门螺杆菌感染，而且没有副作用。本发明的组合物绝对不存在安全性方面的问题，可以随意地以乳品和各种其他食品或饮品形式制备，因此，健康人以及小孩和婴儿，老人，虚弱者以及恢复期病人等都可长期摄取该组合物，该组合物可以提供特别优异的对胃炎和胃溃疡等病的预防和/或治疗作用。
根据细则第13-2条有关保藏微生物的情况
1．加氏乳杆菌OLL 2716
1)微生物进行保藏的保藏机构名称及地址
名称：国际贸易和工业部，工业科技代理处，国家生命科学和人类技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry)
地址：1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan(305-8566)
2)在保藏机构的保藏日期
1999年5月24日
3)保藏时由保藏机构给予的保藏号
FERM RP-6999