透明质酸钠的纯化方法 本发明涉及透明质酸钠的纯化方法和由该纯化方法获得的透明质酸钠。
目前已知的有不含链球菌溶血素的无溶血性的透明质酸钠(特公平3-78116)；对于人多形核白细胞的趋化性低且在家兔的眼内给与时对细胞的侵害性低的透明质酸钠(特公平6-8323)；不含热源物质的高纯度透明质酸钠(特开昭62-501471)等。
透明质酸钠的工业制法已知有纯化鸡冠提取物的方法，以及纯化由链球菌属的菌株得到的发酵液而获得透明质酸钠的方法。
作为除去透明质酸钠中作为杂质存在的热源物质等高分子量化合物的方法，已知有以下几种方法：用三氯乙酸、氯仿-异戊醇处理；酶处理的方法(特开昭60-24194)；离子交换树脂处理法(特开昭63-12293)；吸附树脂处理法(特开平2-103203)；十六烷基氯化吡啶鎓(特开昭60-133894)；用大量的水溶性有机溶剂等有选择地使透明质酸钠沉淀的方法(特开平2-268765)；将2-6万厘沲粘度的溶液在pH6-10地溶液中通过带正电的过滤器从而除去热源物质的方法(特开平6-199656)等。
上述这些方法虽然能够提供无溶血性、无化学趋化性、热源试验呈阴性的透明质酸钠，但为除去热源物质必须要进行繁杂的操作。
因此目前希望开发一种能够容易地从透明质酸钠除去热源物质的纯化方法。
本发明的目的在于提供一种容易地获得热源物质含量低的高纯度透明质酸钠的纯化方法以及由该纯化方法获得的透明质酸钠。
本发明提供一种透明质酸钠的纯化方法及由该纯化方法获得的透明质酸钠，其特征在于，在含有透明质酸钠的透明质酸钠溶液中加入盐和水溶性有机溶剂，使透明质酸钠析出·沉降，抽出上清液，从而除去热源物质。
另外，本发明还提供另一种透明质酸钠的纯化方法和由该纯化方法获得的透明质酸钠，其特征在于将含有透明质酸钠的透明质酸钠溶液通过带正电的过滤器，再用与上述相同的方法除去热源物质。
另外，本发明还提供另外一种透明质酸钠的纯化方法和由该方法获得的透明质酸钠，其特征在于将由上述方法获得的透明质酸钠用50％(v/v)以上的水溶性有机溶剂洗涤，成为粉末状后再进行真空干燥，由此进一步降低热源物质。
本发明中使用的透明质酸钠可以来自微生物、动物等，与透明质酸钠的分子量无关。
透明质酸钠例如可以举出由玻璃体、脐带、关节液、鸡冠等分离得到的物质，以及由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、马链球菌(Streptococcus equi)、Streptococcus equismilis、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、兽瘟链球菌(Streptococcuszooepidemicus)等微生物生产的物质。
透明质酸钠溶液优选是含有0.001-1％(w/v)透明质酸钠的水溶液，用于溶解透明质酸钠的水，其中的热源物质优选低于0.01EU/ml。
为除去该透明质酸钠溶液中的杂菌或不溶物，也可用0.2-0.5μm的过滤器进行过滤处理。
另外，为除去透明质酸钠溶液中的热源物质，也可以使用在特定的pH范围带正电的过滤器进行过滤处理。
上述过滤器只要是在pH3-10的水溶液中带正电的过滤器即可。优选使用膜过滤器。
作为上述的过滤器，优选是由尼龙-66等聚酰胺树脂作为一种成分组成的共聚物形成的膜孔径为0.20-5.0μm的过滤器。该过滤器的具体例子可以举出日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)、プロフアイルIIプラス(商品名)等。
使用该过滤器进行过滤处理时，为提高过滤速度，可以添加盐或升高透明质酸钠溶液的液温。
所说的盐，其中的碱成分是由锂、钠、钾等碱金属离子，镁、钙等碱土金属离子等，以及铵离子等构成的阳性成分，其中的酸成分是由氯、溴等卤素离子，硫酸、硝酸等无机酸，以及甲酸、乙酸等有机酸的酸根构成的阴性成分，优选钠盐。盐可以单独或组合使用。
具体的盐例如可以举出氯化钠、硫酸钠、醋酸钠等。
相对于透明质酸溶液添加0.1-30％(w/v)的盐。
透明质酸溶液的液温可以升温至80℃。
在进行了上述过滤器过滤处理的透明质酸钠溶液中或在未进行该处理的透明质酸钠溶液中加入盐和水溶性有机溶剂。
可以单独使用或组合使用上述记载的盐。
相对于透明质酸溶液，优选加入1-30(w/v)的盐。
水溶性有机溶剂的添加量是要使透明质酸钠的最终浓度为30-90％(v/v)，这样可以使透明质酸钠析出。
作为水溶性有机溶剂，只要是可溶于水的有机溶剂即可使用，具体可以举出甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等醇类，丙酮等酮类，二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二噁烷等醚类，乙腈等。这些水溶性有机溶剂可单独或混合使用。另外，使用的水溶性有机溶剂优选热源物质含量低的。
通过向透明质酸钠溶液中加入水溶性有机溶剂，从析出、沉降的透明质酸钠中高效率地除去热源物质，为使透明质酸钠充分地沉降，通常在添加水溶性有机溶剂后放置2小时以上，使透明质酸钠沉降。此时，沉降的透明质酸钠成为凝胶状的比容小的半透明状态。
从透明质酸钠沉降后的溶液中除去上清液，从而除去热源物质。
另外，除去上清液后残留的透明质酸钠，可利用以下方法进一步除去热源物质。
在除去上清液的凝胶状的上述透明质酸钠中添加50-100％(v/v)的水溶性有机溶剂，洗涤。利用该操作使上述透明质酸钠从凝胶状成为粉末状。根据需要，在该粉末状的透明质酸钠中再加入50-100％(v/v)的水溶性有机溶剂，洗涤后真空干燥，获得热源物质含量为0.0015-0.003EU/mg以下的透明质酸钠。
热源物质的测定如下进行，将透明质酸钠溶于热源物质含量低于0.006EU/ml的水中，使透明质酸钠的浓度为2g/l，使用トキシカラ-系统(生化学工业社制)，按照附带的操作手册进行比色分析。
以下给出本发明的实施例。实施例1
将热源物质含量0.02EU/mg的透明质酸钠25g溶于热源物质含量低于0.01EU/ml的10升水中，用0.45μm的微孔过滤器进行进行过滤处理，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠使氯化钠的浓度达到58.5g/l，之后加入乙醇使乙醇的浓度为50或44％(v/v)。
上述溶液放置5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
用80％的乙醇水溶液洗涤上述沉降物，之后再用100％乙醇洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到20g纯化的透明质酸钠。
表1给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质的含量。
表1析出时乙醇浓度(v/v％)热源物质含量(EU/mg)500.005440.003以下实施例2
将热源物质含量0.02EU/mg的透明质酸钠25g溶于热源物质含量低于0.01EU/ml的10升水中，之后用0.45μm的微孔过滤器过滤，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠使氯化钠的浓度为58.5g/l，之后加入丙酮使丙酮浓度为50、44或41％(v/v)。
上述溶液放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
用80％丙酮洗涤上述沉淀物，用100％丙酮洗涤。
表2给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质含量。
表2析出时丙酮浓度(v/v％)热源物质含量(EU/mg)500.010440.003410.003以下实施例3
将兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)NCTC7023[J.Gen.Microbiol.，15，485-491(1956)]用脑、心脏浸剂肉汤琼脂培养基(日水制药社制)在37℃下培养16小时，得到的菌体接种到300ml种培养基(pH7.0)上，所说的种培养基由1％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、1％玉米浸渍液、0.3％谷氨酸一钠、0.2％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁、0.1％硫代硫酸钠、2％碳酸钙组成，37℃下振荡培养16小时。
将上述种培养液150ml接种到装有3升发酵培养基(pH7.2)的容积为5升的发酵罐中，所说发酵培养基由2.5％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、0.5％玉米浸渍液、0.2％磷酸氢二钾、0.005％硫酸镁、0.1％硫代硫酸钠组成。接种后在37℃、通气量0.3vvm、pH7.0条件下培养26小时，得到透明质酸培养液。
将上述透明质酸培养液3升用去离子水稀释至20升，加入200g碳，室温搅拌1小时后，用努采漏斗过滤，得到20升碳处理液。
使上述碳处理液以5升/小时的流速连续流过大网络型阴离子交换树脂Diaion HPA-75(三菱化学社制)2.5升和凝胶型强酸性阳离子交换树脂SK1B(三菱化学社制)1.25升，得到20升色谱处理液。
将上述处理液用氢氧化钠调节pH为7.0，加入200g碳，室温下搅拌1小时。
搅拌后用努采漏斗过滤，得到的滤液用0.45μm的微孔过滤器过滤，得到20升的滤液。
该滤液的热源物质含量相对于透明质酸钠为0.04EU/mg。
在上述滤液中加入1.2kg氯化钠，加入14升丙酮。放置约5小时使透明质酸钠析出沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
上述沉淀物用80％丙酮洗涤后用100％丙酮洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到11.5g纯化透明质酸钠。
表3给出上述获得的透明质酸钠中的热源物质含量。
表3析出时丙酮浓度(v/v％)热源物质含量(EU/mg)410.003以下实施例4
将来自鸡冠的热源物质含量为0.02EU/mg的透明质酸钠25g溶于热源物质含量低于0.01EU/ml的10升水中，之后用0.45μm微孔过滤器过滤，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠使其浓度达到58.5g/l，然后加入丙酮使丙酮浓度为41％(v/v)。
上述溶液放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。该沉降物用80％丙酮洗涤后再用100％丙酮洗涤。
真空干燥上述洗涤物，获得20g纯化透明质酸钠。
表4给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质含量。
表4析出时丙酮浓度(v/v％)热源物质含量(EU/mg)410.003以下实施例5
将热源物质含量0.02EU/mg、分子量230万的透明质酸钠25g溶于10升热源物质含量0.01EU/ml以下的水中。
在上述溶液中加入氯化钠使其浓度达到10g/l。
使用在pH3-10的范围带正电的微孔过滤器[绝对过滤精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)]，过滤温度25℃，过滤处理上述透明质酸溶液，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到58.5g/l后，加入乙醇，使乙醇浓度为44％(v/v)。
该溶液放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
用80％乙醇的水溶液洗涤上述沉降物后，用100％乙醇洗涤。真空干燥该洗涤物获得20g的纯化透明质酸钠。
表5给出获得的透明质酸钠中的热源物质含量。
表5 热源物质含量(EU/mg)溶液0.020膜过滤器滤液0.005透明质酸钠0.0015以下实施例6
将热源物质含量0.02EU/mg、分子量60万的透明质酸钠50g溶于10升热源物质含量低于0.01EU/ml的水中。
在上述溶液中加入氯化钠，使氯化钠的深度达到10g/l。
使用在pH3-10的范围带正电的膜过滤器[绝对过滤精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)]，过滤温度25℃，过滤处理上述透明质酸溶液，得到滤液。
在该滤液中加入氯化钠，使氯化钠浓度达到58.5g/l，之后加入乙醇，使乙醇浓度达到44％(v/v)。
该溶液放置约5小时使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
用80％乙醇洗涤上述沉降物后用100％乙醇洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到40g纯化透明质酸钠。
表6给出上述获得的透明质酸钠中的热源物质含量。
表6 热源物质含量(EU/mg)溶液0.020膜过滤器滤液0.005透明质酸钠0.0015以下实施例7
将兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)NCTC7023[J.Gen.Microbiol.，15，485-491(1956)]在脑、心脏浸剂琼脂培养基(日水制药社制)中于37℃下培养16小时，所得菌体接种到300ml种培养基(pH7.0)中，37℃下振荡培养16小时，上述种培养基由1％葡萄糖、1.5％胨，0.5％酵母提取物、1％玉米浸渍液、0.3％谷氨酸一钠、0.2％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁、0.1％硫代硫酸钠、2％碳酸钙组成。
将上述种培养液150ml接种到装有3升发酵培养基(Ph7.2)的容积为5升的发酵罐中，所说的发酵培养基由2.5％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、0.5％玉米浸渍液、0.2％磷酸氢二钾、0.005％硫酸镁、0.1％硫代硫酸钠组成。接种后在37℃、通气量0.3vvm、pH7.0的条件下培养26小时，得到透明质酸培养液。
将3升上述的透明质酸培养液用去离子水稀释成20升，加入200g碳，室温下搅拌1小时后，用努采漏斗过滤，得到20升碳处理液。
使上述碳处理液以5升/小时的流速连续流过大网络型阴离子交换树脂Diaion HPA-75(三菱化学社制)2.5升和凝胶型强酸性阳离子交换树脂SK1B(三菱化学社制)1.25升，得到20升色谱处理液。
将上述处理液用氢氧化钠调节pH为7.0，之后加入200g碳，室温下搅拌1小时，用努采漏斗过滤，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠，使氯化钠浓度达到10g/l。
使用在pH3-10的范围带正电的膜过滤器[绝对过滤精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)]，过滤温度25℃，过滤处理该透明质酸溶液，得到18升滤液。
上述滤液中的热源物质含量为0.01EU/mg(相对于透明质酸钠)。
在上述滤液中加入1.1kg的氯化钠，加入14升的乙醇。
放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
将沉降物用80％乙醇洗涤后再用100％乙醇洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到10.0g纯化透明质酸钠。用极限粘度法分析该透明质酸钠的分子量，为20万。
表7给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质含量。
表7热源物质含量(EU/mg)0.0015以下实施例8
将来自鸡冠的热源物质含量为0.02EU/mg、分子量100万的透明质酸钠50g溶于10升热源物质含量为0.01EU/ml以下的水中。
在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠浓度达到10g/l。
使用在pH3-10的范围带正电的膜过滤器[绝对过滤精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)]，过滤温度25℃，过滤处理该透明质酸溶液，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到58.5g/l后，加入丙酮，使丙酮浓度为41％(v/v)。
上述溶液放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
将上述沉淀物用80％丙酮洗涤后再用100％丙酮洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到40g纯化透明质酸钠。
表8给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质含量。
表8 热源物质含量(EU/mg)溶液0.020膜过滤器滤液0.005透明质酸钠0.0015以下实施例9
将热源物质含量0.1EU/mg、分子量230万的透明质酸钠10g溶于10升热源物质含量低于0.01EU/ml的水中。
在上述溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到10g/l。
使用在pH3-10的范围带正电的微孔过滤器[绝对过滤精度0.2μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン过滤器(商品名)]，过滤温度25℃，过滤处理该透明质酸溶液，得到滤液。
在上述滤液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到58.5g/l，之后加入乙醇，使乙醇浓度为44％(v/v)。
上述溶液放置约5小时，使透明质酸钠析出、沉降，除去该溶液的上清液，得到透明质酸钠的沉降物。
用80％乙醇洗涤上述沉降物后用100％乙醇洗涤。
真空干燥上述洗涤物，得到2g纯化透明质酸钠。
表9给出上述得到的透明质酸钠中的热源物质含量。
表9 热源物质含量(EU/mg)溶液0.1透明质酸钠0.0015以下
利用本发明可以提供容易地获得热源物质含量低、高纯度的透明质酸钠的纯化方法，以及由该方法获得的透明质酸钠。