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用配子体克隆培育海带杂种优势苗种的方法
    本发明涉及一种海带育苗方法，特别是涉及一种用配子体克隆培育海带杂种优势苗种的方法。

    海带夏苗自然光培育是目前我国海带全人工养殖通常采用的育苗工艺，它包括选择种海带，室内采孢子及幼苗培育，下海暂养和分苗养殖等步骤。目前，这种育苗方法在我国育苗单位虽然普遍采用，但还存在着以下几个方面的问题：(1)种海带的选种和海上培育管理繁杂、劳动强度和风险较大；在南方，种海带室内低温培育加上育苗阶段长达半年之久，更易加大生产成本和引起病害发生；(2)由于海上自然水温因素的限制，为防止水温升高对种海带发育不利和幼苗下海的适宜水温，因此既要早采苗(采孢子)，又要在育苗前中期控制光、温，致使幼苗期培育时间过长，不仅造成幼苗的非正常生长和发病机会，而且还加大了育苗的生产成本；(3)无法真正实现良种苗培育。海带育苗生产中，种海带用量大(生产5亿株苗需要3万棵种海带)，混采孢子，子代性状分离较大，无法保持纯一。因此，经几个养殖周期后，品种易出现性状退化，产量下降，给海带养殖造成损失。

    本发明的目的是提供一种用配子体克隆培育海带杂种优势苗种的方法，它能弥补现有技术的上述不足。

    一种用配子体克隆培育海带杂种优势苗种的方法，包括幼苗培育、下海暂养和分苗养殖，其特征是在幼苗培育之前，先将雌雄配子体克隆细胞分别扩增培养，再将配子体克隆附着在基质上，然后让雌雄配子体克隆进行杂交。

    本发明把优良品系的雌雄海带配子体克隆分别扩增，进行两系杂交，生产杂种苗，免去了海上培育种海带的过程，缩短了室内育苗时间。把良种培育和良种苗生产合而为一，既可稳定地生产杂种优势种苗，又可大大降低育苗生产成本。

    下面通过实施例进一步说明本发明。

    本实施例用的雌雄配子体克隆是发明人自1978年以来所分离培养的部分材料。其中，雌性克隆有：C11-1(1982)、C15-1(1982)、C26-2(1982)、TPJ-1(1994)；

    先把配子体克隆粉碎成少量的细胞的个体，再进行扩增培养。本发明利用超声波粉碎仪将克隆簇状体粉碎。开始先用400W、30S将大块克隆簇打碎，然后用200W、120S把克隆分解成为5～10个细胞的小段分枝。也可以利用机械粉碎的方法，将克隆粉碎成20～50个细胞的丝状体。

    将粉碎后地克隆细胞加入培养液(总计2L体积)。开始用3L三角瓶培养，水色加深后再移入20L的容器中培养。扩增培养条件是温度：8～18℃；光照强度：40～60μmolm-2s-1(相当于2000～3000Lux)，光照时间12h；培养液：天然海水煮沸消毒，加入营养盐(NO3-N 16mg  /L，PO4-P 1mg/L)；24h充气，充气的目的一是补充CO2，二是防止克隆细胞下沉和堆积。换水：除需倒瓶或称重换水外，一般进行封闭培养，按时加入新培养液，并适量补充营养盐。在关于海带配子体克隆细胞扩增初期的接种量问题，根据日增长速率，从日增重效果比较和节约种源出发，实验初始接种量1～2g(培养液1～2L)是适宜的。

    关于配子体克隆附着在基质上之前的雌雄配子体克隆比例，根据实验，在同样条件下，雌雄克隆的生长速率和日增重效果基本相同，为有利于受精，在配子体克隆附着在基质上之前5～12天就可将雌雄克隆细胞按1∶1的比例混合培养以促进协同发育。

    再将配子体克隆附着在基质上。附着基质采用棕帘或维尼帘两种苗帘。可用配子体克隆直接附着也可使用固化材料促进其附着效果。固定化剂使用3％(w/v)褐藻酸钠溶液和1mol/L的Cacl2溶液。按照雌雄配子体克隆细胞比例1∶1，制成克隆细胞悬液，然后用喷雾器洒在苗帘上，苗帘即移到低温(8～10℃)下培养，保持苗湿度避光放置24h后缓慢加入消毒海水。营养盐(NO3-N16mg/L，，PO-P 1mg/L)，光强20～30μml 1m-2s-1，光周期12h，温度8～10℃。使用前将苗帘浸在60℃的固化剂溶液中，5min后取出，沥干后备用。实验中发现维尼纶帘交织较密且表面光滑，如直接将克隆悬液喷洒到苗帘上，大部分克隆悬液滑落到解剖盘中，较难附着。加过固化剂的维尼纶帘，克隆的附着效果好，但克隆大部分是固着在固化剂表面，这对于克隆育苗后期的孢子固着存在一定隐患。后期使用棕帘加固化剂，超生波粉碎的克隆悬液(3～5个细胞/分枝，细胞密度1.0×105)喷洒到棕帘上，喷洒量在40ml左右(分2～3次喷洒)。发现固定效果较好，可达到×150显微镜下每视野80个分枝的附着效果。且棕帘丝较松散，对后期孢子体附着有一定的作用。

    克隆细胞附着后，在7～20天内配子体克隆细胞发育，形成受精卵及幼孢子体，即得到杂种优势苗种，然后进行幼苗培育，下海暂养和分苗养殖，完成本项目的整个工艺。

    选取C11-1和D4-4进行克隆育苗实验。对照组为静置附苗组(将苗帘放在克隆的细胞悬液中)。在培养的第30天，剪少量棕毛观察，发现喷洒组出现孢子体，只有少量卵，而对照组因细胞附着量过少，无法统计发育率。在实验进行到2000年1月24日，棕帘上海带苗已长到2～3cm，平均6棵/cm，达到了商品苗出库的标准。