酸性多糖的混合丁酸 - 甲酸酯、 其制备方法及其作为皮肤 化妆品的用途 本发明公开了酸性多糖的混合丁酸 - 甲酸酯以及通过在丁酸酐和碱的存在下从 甲酰胺生成甲酸酯来制备其的方法、 通过透析和冷冻干燥对其进行纯化和回收的方法以及 其作为弹性增强剂和保湿剂用于化妆品和护肤的用途。
现有技术 鉴于它们的化学 - 物理学以及生物学性质， 氨基葡聚糖 (GAG) 是一种在应用领域 备受关注的产品， 它们在人体的特定部位起非常重要的作用并且通常以蛋白多糖的形式存 在于所述的部位。 所述蛋白多糖分子是一个复杂的系统， 其中， 多糖链可以以共价或非共价 的方式与蛋白结合。 它们具有多种生物学功能， 包括调节组织中的水分、 作为细胞外基质中 的离子扩散调节剂、 调节细胞活动性和其它功能， 以及在生殖系统中作为支撑结构。
受到研究以及进行化学修饰最多的 GAG 是透明质酸 (HA)。
通常， 对透明质酸的修饰涉及使用新的衍生物， 主要是在生物医药领域， 例如生物 材料、 药物控释、 粘弹性补充产品、 手术后防粘结装置等。在化妆品中， HA 主要以用特定分 子量表征的未修饰的天然形式用作保湿剂。
根据文献记载， 近期所进行的大量研究均集中在对透明质酸进行交联以获得具有 特定生物学特性 ( 粘弹性 ) 的新的生物相容性分子 ； 例如， EP 341745 记载了通过将透明质 酸自交联获得的用于通过粘弹性补充来进行关节内治疗以及作为手术后的防粘结装置的 产品。
其它专利例如 US 4582865 和 US 4713488 要求保护使用外源性分子作为交联剂。
EP 216453 记载了透明质酸的羧基的酯衍生物在生物材料和药物控释领域的应 用。
关于透明质酸与有机酸的羟基酯的专利非常少。例如， US 5679657 要求保护一种 乙酰化的透明质酸， 其取代度为 0.6 至 3.6， 由低粘度和低分子量的透明质酸制得， 在化妆 品中用作成膜剂 ； US 6017901 要求保护利用透明质酸的半琥珀酸酯衍生物来向多糖链中 进一步引入负电荷。
EP 941253 公开了在碱性环境下用丁酸酐来合成透明质酸衍生物， 以获得在羟基 功能基上酯化的产物。
就申请人所知， 没有将其它 GAG 进行功能化以用于皮肤病学 / 化妆品领域的记载。 也没有任何文献提到过由本文所用的合成方法所产生的同时存在丁酸酯和甲酸酯基团。
发明描述
本发明涉及酸性多糖的衍生物， 其中， 在所述酸性多糖的游离羟基上被丁酸和甲 酸部分或完全酯化， 并且所述酸性多糖属于氨基葡聚糖 (GAG) 家族， 特别是透明质酸、 硫酸 软骨素、 硫酸皮肤素、 硫酸肝素和硫酸角质素。本发明还涉及其制备方法。
本发明的产物可用于局部 ( 化妆品或药物 ) 制剂， 所述制剂具有保湿、 增强弹性、 皮肤营养、 抗衰老和抗痤疮活性， 并可用作皮肤损伤例如炎症、 溃疡以及由于辐射例如由
UV、 X 射线和 γ 射线引起的体温过高损伤的治疗辅助剂。
各多糖单体的羟基的取代度 (DS) 可以变化， 在丁酸酯的情况下， 取代度在 0.01 至 1*N 之间， 优选在 0.01 至 0.2*N 之间， 其中 N 是重复单元中存在的游离醇基团的数量， 而聚 合物羟基的甲酸的酯化度在 0.01 至 0.2 之间 ( 即 1％至 20％之间 )。
酯化度是可以调节并且可以重现的， 并且可以根据原料多糖的性质和所用的反应 条件而改变， 例如多糖底物、 所用的催化碱和丁酸酐之间的化学计量比。
任何未酯化的羧基功能基可以以酸的形式存在或者与碱金属、 特别是钠成盐。 3 7
酸性多糖的分子量通常在 10 至 10 道尔顿之间 ； 如果多糖是透明质酸， 分子量优 4 6 选在 10 至 10 道尔顿之间。
在透明质酸的情况下， 在聚合物羟基的丁酸的酯化度优选在 0.01 至 0.8 之间， 而 在聚合物羟基的甲酸的酯化度在 0.01 至 0.20 之间。
通过改变各个成分的酯化度， 本发明衍生物的化学 - 物理学以及流变学性质可以 发生变化， 并且可将其用于局部的治疗用组合物， 用作保湿剂、 弹性增强剂、 皮肤营养剂、 抗 衰老剂或抗痤疮剂， 或用作皮肤损伤例如炎症、 溃疡、 伤口、 皮炎以及由于辐射引起的皮肤 温度过高的治疗辅助剂。 本发明还涉及制备所述衍生物的方法。
所述方法包括 ：
a) 通过在 60℃至 120℃、 优选在 95℃加热将与钠或其它碱金属成盐的酸性多糖溶 解在甲酰胺中 ；
b) 将丁酸酐在室温下、 在有机碱的存在下加入到形成的溶液中 ；
c) 将均匀、 粘稠的反应混合物用 NaCl 水溶液稀释并中和至 pH6-7.5 ；
d) 将稀释的反应混合物通过透析或切向流过滤进行纯化 ；
e) 将纯化的多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥或喷雾干燥回收产物。
有机碱是包含至少一个三取代的氮原子的芳香族或脂肪族碱， 优选二甲基氨基吡 啶或三乙胺。
与例如天然的 ( 未修饰的 ) 市售透明质酸相比， 本发明化合物的一个优点是， 修饰 的聚合物上所存在的丁酸和甲酸酯取代基可以防止组织中存在的透明质酸酶的酶降解。 本 发明化合物的所述新的特性通过以下实验进行说明。
在实验中使用市售的透明质酸钠盐和按照实施例 2 和 4 的描述制备的样品。
在加入酶之前， 将多糖的母液 (10mg/ml) 在 37℃下通过机械搅拌温和地搅拌 1 小 时。从所述溶液开始， 制备含有 0.1mg/ml 酶 ( 牛睾丸透明质酸酶 1060U/mg) 的 10ml 稀溶 液 (1mg/ml)。用低 10 倍的酶剂量制备第二种稀释液。将两种溶液在 37℃下保温。以固定 的间隔取 0.6ml 样品并将其置于 100℃的水浴中 5 分钟， 过滤除去酶然后冷冻。
通过 HP-SEC-TDA 色谱法测定重均分子量分布
将样品进行尺寸排阻色谱， 采用四种检测器的组合 ( 在 90°和 8°光散射、 折射率 和粘度计 )。对色谱图进行处理可以确定分子量 Mw( 重均分子量 ) 的分布。
色谱条件
仪器 ： Viscotek 泵， VE1121 型 ； 在线双通道脱气仪， Gastorr 150。
柱： 2x GMPWXL 混合床柱， 7.8mm ID x 30cm， Viscotek ； 温度 40℃。
流动相 ： 0.1M NaNO3。
流速 ： 0.6ml/min。
检测仪 ： Viscotek 302TDA 型， 装配有折射率测定仪、 毛细管粘度计和在 90° 和 8°测定的光散色， 温度为 40℃。
注射体积 ： 100μl。
图 1 和 2 显示了从与酶一起保温的聚合物溶液中以 0-4 小时的间隔取样的样品的 分子量 Mw 值。与本发明的用丁酸 / 甲酸部分酯化了的样品相比， 含有天然未取代的透明质 酸的样品显示较快的降解速率。天然聚合物达到稳定状态时的解聚程度也更大。可以通过 丁酸酯 / 甲酸酯中的取代度来对这两种作用进行调节。
当聚合物∶酶的比例为 10 ∶ 1 时 ( 图 1)， 具有高酯化度的实施例 4 的化合物在实 验结束时 (4 小时 ) 的聚合比率比天然聚合物高大约 10 倍。 当聚合物∶酶的比例为 100 ∶ 1 时 ( 图 2)， 本发明的化合物完全不解聚， 而天然 HA 的分子量降低了约三分之二。
在健康志愿者中的体内效力评估
在健康志愿者中进行的体内实验中， 本发明的酸性多糖酯显示出很强的弹性增强 活性。
以下给出用于说明本发明的一个例子。
制备含有 0.1％按照实施例 2 的描述制得的透明质酸钠盐的混合丁酸 / 甲酸酯、 去 离子水 (98.35％ ) 以及赋形剂、 即增稠剂 (0.5％ ) 和防腐剂 (1.05％ ) 的凝胶。
使用具有相同组成， 含有相同浓度 (0.1％ ) 的市售透明质酸钠盐以及相同的赋形 剂的凝胶作为对照。
实验的目的是评估含有本发明化合物 ( 处理组 A) 与未修饰的市售透明质酸钠盐 ( 处理组 B) 相比的凝胶形成效力， 用仪器测量保湿性和弹性。
24 名志愿者 ( 平均年龄 49.8 岁 ) 每天两次将各产品涂抹在脸部的一半， 共四周。
在试验期开始 (To) 和四周的处理结束 (Tf) 时， 通过仪器在涂抹产品的部位测定 眼周皮肤的保湿性和弹性。在用仪器测定前 3 个小时， 志愿者用水将产品彻底洗去。
用皮肤水分测量仪 ( 一种用于测定皮肤表面湿度水平的仪器 ) 来测量脸角质层的 湿度水平， 皮肤弹性则通过弹性吸引法利用皮肤弹性仪 ( 一种用于测定被吸入到测量探针 中的皮肤表面变形情况的仪器 ) 来测定。在与皮肤接触的探针内部产生 1 秒钟 350 毫巴的 恒定负压。实验由三次吸 / 释放循环组成， 以测定皮肤的变形情况作为弹性的特征， 用参数 R2 表示。
获得的结果总结在下表中 ：
皮肤弹性的测定 ( 参数 R2)
表中的数据表明， 对于按照本发明获得的制剂 (A 组 ) 而言， 参数 R2 有非常显著的 增加 ( 生物学弹性 )， 而对照产品 (B 组 ) 对参数 R2 没有任何显著的影响。
关于湿度参数， 各个处理组在时间 To 和 Tf 之间均没有显著差异 ； 该结果可以通过 采用的实验方案类型来解释， 在所采用的方案中， 在用仪器测量前三个小时就洗掉了制剂。
对通过辐射进行热刺激的皮肤的缓解作用的评估
8 名乳腺癌患者 ( 平均年龄 52 岁 ) 用 γ 粒子直线加速器进行放疗。
治疗周期包括 15 次治疗， 每次治疗施用 2Gy 的剂量， 每周 5 天， 总施用剂量为 30Gy。
研究的目的是评估进行全部所需治疗周期的可能性、 对产品的耐受性及其保护效 力。
将按照实施例 9 的描述制得的软膏每天涂抹在照射部位， 每天 3 次， 每两次涂抹之 间间隔 8 小时， 通常在放疗前 2 小时开始并在放疗结束后持续 5 天。在此时对照射的皮肤 部位进行评估。
所有患者均可耐受计划的治疗周期 (30Gy)， 表明了所用制剂的出色的保护作用以 及耐受性。 通过对受照射皮肤的不良反应进行评分来对治疗的效果进行评估。具体地讲， 采 用如下评分方法 ：
0： 无反应
1： 轻微的红斑
2： 中等的红斑
3： 严重的红斑
4： 脱皮。
8 名患者中有 1 例出现了脱皮， 有 1 例出现了中等的红斑， 1 例出现了轻微的红斑， 有 5 例无反应。
总之， 用本发明的霜剂进行的初级试验显示了良好的耐受性和对放疗引起的皮炎 的出色的局部保护作用。
这些发现清楚地表明， 本发明的衍生物可有利地用作局部组合物的活性成分与皮 肤学可接受的惰性载体混合。
本发明衍生物的含量可以为 0.05％至 5％重量。适宜的组合物包括霜剂、 软膏、 凝 胶、 亲水液体、 含水或水 - 醇洗剂、 油 / 水或水 / 油乳剂。
在以下实施例中描述了酸性多糖的混合丁酸 / 甲酸酯的制备。
实施例 1 ： 透明质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07005)
将 5.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 100mL 甲酰胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 503.3mg 4- 二甲基氨基吡啶的 5mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 1.67mL/min。15 分钟后， 加入 734μl 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且高 度粘稠的反应混合物转移至 1.2L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 2.5L。
将产物通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。
最后， 将溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 4.03g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.13， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.07。
实施例 2 ： 透明质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07002)
将 5.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 100mL 甲酰胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 0.76g 4- 二甲基氨基吡啶的 5mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 1.67mL/min。15 分钟后， 加入 1.0ml 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且非常 粘稠的反应混合物转移至 1.2L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 2.5L。
将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。 最后， 将多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 4.90g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.23， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.07。
实施例 3 ： 透明质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07004)
将 5.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 100mL 甲酰胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 1.26g 4- 二甲基氨基吡啶的 8mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 1.67mL/min。15 分钟后， 加入 1.7ml 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且高度 粘稠的反应混合物转移至 1.2L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 2.5L。
将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。
最后， 将多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 4.79g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.50， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.06。实施例 4 ： 透明 质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07001)
将 5.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 100mL 甲酰胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 1.67g 4- 二甲基氨基吡啶的 10mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 1.67mL/min。15 分钟后， 加入 2.25ml 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且高 度粘稠的反应混合物转移至 1.2L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 2.5L。
然后将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9 ％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用去离子水彻底纯化。
最后， 将多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 5.15g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.69， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.04。实施例 5 ： 透明 质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07007)
将 23.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 0.46L 甲酰 胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 5.47g 4- 二甲基氨基吡啶的 20mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 2.0mL/min。15 分钟后， 加入 7.3ml 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且高度 粘稠的反应混合物转移至 2.5L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 8.0L。
然后将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9 ％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。 最后， 将多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 22.26g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.41， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.07。实施例 6 ： 透明 质酸钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07008)
将 23.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 0.46L 甲酰 胺， 机械搅拌约 1 小时。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 7.71g 4- 二甲基氨基吡啶的 35mL 甲酰胺溶 液， 滴加速率为 3.5mL/min。15 分钟后， 加入 10.3ml 丁酸酐并反应 40 分钟。将均匀且高度 粘稠的反应混合物转移至 7.0L0.9％ NaCl(w/v) 中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用 0.9％ NaCl 溶液 (w/v) 稀释 至终体积为 8.0L。
然后将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9 ％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。
最后， 将多糖溶液冷冻并通过冷冻干燥回收产物。得到 23.50g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.54， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.10。
实施例 7 ： 透明质酸的丁酸和甲酸酯钠盐的合成 (BUT07014)
将 150.00g 分子量约为 300kDa 的透明质酸钠在 95℃及氮气流下溶于 3L 甲酰胺， 机械搅拌 1 小时 45 分钟。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 滴加 32.00g 4- 二甲基氨基吡啶的 200mL 甲酰胺 溶液， 滴加速率为 20.0mL/min。15 分钟后， 加入 43.0ml 丁酸酐并反应 45 分钟。将均匀且 高度粘稠的反应混合物转移至 4.0L 超纯水中。
将溶液在减压下滤过烧结的玻璃滤器， 然后进一步用超纯水稀释至终体积为 30.0L。
然后将样品通过切向流过滤用孔隙为 10kDa 的滤膜进行纯化， 首先用 0.9 ％ NaCl(w/v) 纯化， 然后用超纯水彻底纯化。
然后将溶液在压力 (2 巴 ) 下通过 0.22μm 的滤膜进行灭菌， 最后冷冻。
通过冷冻干燥回收产物。得到 140g 白色冷冻干燥物。
将冷冻干燥物通过 1H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.32， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.07。实施例 8 ： 硫酸 软骨素钠盐的丁酸和甲酸酯的合成 (BUT07015)
将 201.9mg 分子量约为 20kDa 的硫酸软骨素在 95℃及氮气流下溶于 1mL 甲酰胺， 机械搅拌约 20 分钟。
将得到的多糖溶液冷却至室温， 加入 49.2mg 4- 二甲基氨基吡啶的 0.5mL 甲酰胺 溶液。15 分钟后， 加入 65μl 丁酸酐并反应 40 分钟。
通过用 20 体积的丙酮沉淀来回收产物， 用丙酮洗涤 3 次然后在低压下干燥。 1
得到 180.0mg 白色固体。将样品通过 H NMR 进行分析。
丁酸酯取代度 (DS 丁酸 ) ： 0.50， 甲酸酯取代度 (DS 甲酸 ) ： 0.03。
实施例 9 ： O/W 增弹霜剂的制备
以下给出本发明的一个非限制性实施例， 其举例说明了含有本发明的丁酸 / 甲酸 酯之一的霜剂的制备。
O/W 霜剂包含浓度为 0.1％的实施例 2 所述的化合物作为弹性增强剂和保湿剂， 适当地与皮肤化妆品中常用的赋形剂例如乳化剂、 增稠剂、 油、 润湿剂、 胶凝剂、 防腐剂等混 合。
该方法的概述如下 ：
将约 600ml 去离子水 ( 相当于总配方重量的约 60％ ) 加入到涡轮乳化器中并在搅 拌下、 在约 70℃下加入预先融化脂肪相。将混合物乳化并缓慢冷却至 35-40℃。在该温度 下加入热不稳定及挥发性成分， 然后加入溶于适量水中的实施例 2 所述的透明质酸钠盐的 丁酸 / 甲酸酯。 将混合物缓慢搅拌直至温度达到 25-30℃， 然后将最终产品装入到适宜的容 器中。
得到具有如下组成的霜剂 (％ W/W) ：
透明质酸钠盐的丁酸 / 甲酸酯 ( 实施例 2) 0.1
油 ( 棕榈酸 / 辛酸甘油酯 - 甘油三酯 ) 12
非离子型乳化剂 6
鲸蜡醇 2
聚二甲基硅氧烷 4
硅酸镁铝 2
甘油 3
木糖醇 2
对羟基苯甲酸酯类 0.7
H2O 适量至 100