防治鸡传染性法氏囊病的中药合剂 一、技术领域
本发明一种防治鸡传染性法氏囊病的中药合剂，定名为芪蓝抗毒饮，属于防治鸡传染性法氏囊病的新型中兽药。
二、技术背景
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)，自1957年在美国东海岸特拉华州的甘布罗镇首次发现以来，已呈世界性流行。据调查，美国鸡群的血清阳性率几乎近100％，南美洲约90％，荷兰88％，意大利76％，日本约75％，德国61.5％。我国1979年在广州发现本病，1980年周蛟等在北京从进口的鸡群中分离到IBD-CJ801株，从而证实了本病在我国的存在。
IBD是危害幼鸡的急性、高度接触性传染病。其最大的危害是破坏鸡的免疫中枢器官——法氏囊，使携带SIgM标志的B淋巴细胞变性和坏死，导致严重的、长期的免疫抑制，使机体对其它疫苗的免疫反应降低、对其它细菌和病毒等病原体的易感性增加。其发病突然，传播迅速，通常在感染第3天开始死亡，5～7天达到高峰，以后很快停息。病死亡率一般在15％～50％，超强毒感染死亡率可达70％以上。近年来IBD流行出现了一些新特点，表现为发病日龄范围扩大，从3日龄雏鸡到180日龄成年鸡均可发生，而且非典型病例、混合感染或者综合征增多，死亡率高者可达90％。
由于IBDV在外界环境中较为稳定，常规的消毒和隔离措施已不能控制本病。主要的预防措施是接种疫苗。近年来由于超强IBDV的出现以及各种血清型和变异株之间抗原的差异性，使疫苗免疫难以取得理想效果，有时反而会引发其它病，给养鸡业造成巨大的经济损失。
对IBD迄今无特效地西药治疗。有人使用地塞米松和复方炔诺酮治疗，但只能减轻症状或缓解病情，不能降低死亡率。对早期病鸡，用高免卵黄抗体或高免血清有一定疗效，但两者均易受到制备、保存和运输等条件的影响，效果不稳定或存在传播其它疾病的危险。
高免卵黄和血清的制备来源于商品鸡和蛋，由于免疫鸡个体差异或批间抗体水平不一，使产品抗体效价不稳定。两者均为高蛋白物质，营养丰富，在生产过程中极易污染细菌；并可能带有其它病原，如减蛋综合征、禽白血病、支原体等，对养禽业存在潜在的威胁。卵黄抗体含有大量卵黄磷蛋白、脂肪等抗原性物质，易对病鸡的免疫产生干扰；其蛋白质及脂肪的分子量都很大，肌肉注射不但难以吸收，还会引起局部肿胀、出血、坏死，甚至引起机体应激和过敏反应。抗体怕热，必须低温保存和运输，尤其在夏天极易腐败变质而不能使用。因此，从中草药中寻找一种新的更为有效的治疗药物势在必行。
三、发明内容
技术问题 本发明针对现有技术中急需绿色药品的问题，提供一种防治鸡传染性法氏囊病的纯中药制剂。达到药效可靠，无毒副作用，无药残，保障食品安全的目的。
技术方案 一种防治鸡传染性法氏囊病的中药合剂，其特征在于，
每1000ml药液的处方量药材为：黄芪300g，板蓝根200g，大青叶200g，生地200g，赤芍100g。
生产每1000ml药液的工艺流程为：用水提法。将以上五味药，加水煎煮两次，每次1小时，过滤，合并滤液，浓缩至1000ml，加入4g苯甲酸钠，搅匀后静置，过滤或离心，去除沉淀，无菌分装入灭菌瓶。
有益效果
2000～2001年，本研究室在江苏省“三药工程”项目的资助下，开展中药治疗鸡传染性法氏囊病新制剂的研究。首先运用细胞培养的方法筛选出抗鸡传染性法氏囊病毒作用较强的黄芪作为主药，然后根据中兽医学理论和鸡传染性法氏囊病的病理，采取不同原则拟订三个方剂，通过反复试验比较，最后筛选出效果最好的一个方剂，定名为芪蓝抗毒饮。
攻毒治疗比较试验证明(表1～表3)，芪蓝抗毒饮的疗效优于其他两个方剂、稍优于卵黄抗体，该药处理组的死亡率最低(18.97％)，低于卵黄抗体对照组(21.03％)，极显著低于不治疗对照组(46.7％)；病鸡器官出血阳性率最轻，轻于卵黄抗体对照组，显著(胸肌、腿肌)或极显著(脾脏、法氏囊)轻于不治疗对照组；增重效果最显著，总增重和均增重高于卵黄抗体对照组，极显著高于不治疗对照组。攻毒预防试验证明(表4～表9)，本方无论单用还是与疫苗同用，均能降低病鸡死亡率、提高特异性抗体水平。通过数群临床病鸡的治疗验证，保护率均达90％左右。
与现有技术相比还具有如下优点：
1.西药疗法有使用地塞米松和复方炔诺酮治疗，但只能减轻症状或缓解病情，不能降低死亡率。对早期病鸡，用高免卵黄抗体或高免血清有一定疗效，但两者均易受到制备、保存和运输等条件的影响，导致效果不稳定或存在传播其它疾病的危险，而且注射麻烦，也易引起病鸡的应激反应。本药由纯中药制成，药效显著，安全可靠，可克服以上弊端。
2.该药剂根据中兽医学理论，以补气的黄芪加清热解毒、凉血滋阴、活血化瘀中药制成，现代药理研究表明，黄芪能增强免疫功能，改善病鸡的免疫抑制，其有效成分黄芪多糖和方中清热解毒药有抗病毒作用，滋阴药能改善病鸡的脱水状态，活血化瘀药能改善血液循环，减轻病理出血，诸药相合，补气托毒、标本兼治，组方新颖合理。
3.雏鸡发病鸡后大多拒食喜饮，而其他同类中药大多为散剂，通过拌料混饲法给药，不但药物的摄入得不到保障，即使摄入后也有消化吸收过程，使药效不能及时发挥；本药为提取制备的口服液剂型，通过混饮法给药，能保证药物的摄入量，并尽快发挥疗效。
4.该药无毒副作用，无药残，符合绿色药品要求，能保障动物源食品安全；生产过程无三废，对环境无污染。
本发明提供了一种防治鸡传染性法氏囊病的纯中药制剂，已通过江苏省新兽药审评，达到了专利中所要求的创新性、科学性和实用性的标准。
四、具体实施方式
芪蓝抗毒饮每1000ml药液的处方量药材为：黄芪300g，板蓝根200g，大青叶200g，生地200g，赤芍100g。
生产每1000ml药液的工艺流程为：用水提法。将以上五味药，加水煎煮两次，每次1小时，过滤，合并滤液，浓缩至1000ml，加入4g苯甲酸钠，搅匀后静置，过滤或离心，去除沉淀，无菌分装入灭菌瓶。
(一)芪蓝抗毒饮药效试验
本发明攻毒治疗比较试验证明，与不治疗对照组、卵黄抗体治疗对照组和其他两个方剂治疗组相比，本方处理组的疗效最好、病理出血最轻、增重效果最显著。攻毒预防比较试验证明，本方无论是单用还是与疫苗同用，均能降低死亡率、提高特异性性抗体水平；通过数群临床病鸡的治疗验证，保护率均达90％左右。
1.芪蓝抗毒饮治疗试验
试验方法 4批试验共用21日龄非免疫罗曼蛋仔公鸡1043羽(南京汤泉鸡场提供)。实验前观察饲养48h，每批试验随机抽出35羽翅静脉采血，用琼脂扩散法检测IBDV母源抗体阴性后，随机分成7组。第7组104羽，隔离饲养，不作任何处理；其余6组(鸡数见表1)分别称取总重，计算均重；然后用刷肛法攻毒。24h后，鸡群出现精神萎靡、乍毛打堆、水泻、零星死亡等IBD典型症状时投药治疗。
I～III组，中药实验组，依次饮服方1、方2、方3(芪蓝抗毒饮)；IV组，单味主药对照组，饮服黄芪，以上4组的剂量均为1ml/羽，每天给药1次，连续3d；V组，卵黄抗体对照组，胸肌注射卵黄抗体1ml/羽，1次；VI组，不治疗对照组。
观察指标及数据处理 (1)死亡率：每天记录各组死亡数，至攻毒后第7d停止死亡时计算死亡率。(2)器官出血阳性率：死亡鸡逐只剖检，统计胸肌、腿肌、脾脏和法氏囊出血占死亡数的百分率。(3)增重：观察至鸡群停止死亡、临床基本康复后，分别称取各组存活鸡总体重，计算总增重和每羽均增重。以上3项指标的数据用t检验各组与不治疗对照组的差异性。
试验结果 (1)死亡率(表1)：以方3组为最低，其次是方1、方2、卵黄抗体、单味主药组，各组均与不治疗对照组有显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)差异。方3组与不治疗对照组的差异最为显著(P＜0.005)、大于卵黄抗体组。表明芪蓝抗毒饮的疗效最好，稍优于卵黄抗体，复方的效果优于单味主药。
(2)死亡鸡器官出血阳性率(表2)：仍以方3组最低，胸肌、腿肌、脾脏和法氏囊出血占死亡数的百分率分别为：15.70％；42.66％；22.15％；50.51％，与不治疗对照组的差异显著(P＜0.05， 胸肌、腿肌)或极显著(P＜0.01，脾脏、法氏囊)。表明方3能显著减轻病鸡的组织器官出血，效果优于卵黄抗体、单味主药和其它复方。
(3)增重变化(表3)：总增重以方3组最高，总增重4.9kg均增重75.5g，单味主药对照组次之，均极显著高于不治疗对照组(P＜0.001)；其余各组总增重均为负数。均增重仍以方3组最高，单味主药组次之，极显著高于不治疗对照组(P＜0.001)。表明方3的产出率最高，经济效益较好。
2.芪蓝抗毒饮预防试验
试验方法 29日龄非免疫罗曼蛋仔公鸡222羽，随机分成5组。I组，中药(芪蓝抗毒饮)组，37羽；II组，疫苗组，38羽；III组，中药加疫苗1组，38羽；IV组，中药加疫苗2组，41羽；V组，病毒阳性对照组，40羽；另设空白对照组28羽，隔离饲养，作观察有无其它传染性疾病感染和正常囊体比用。
各组观察饲养48h后称重、IBDV母源抗体检测方法同试验1。II～IV组用疫苗点眼、滴鼻免疫；III组在疫苗免疫当天、I组和IV组在攻毒前4d饮服中药，剂量为每天每羽1g，连续4d；I～V组在疫苗免疫后14d(45日龄)刷肛攻毒，每羽平均0.2ml；在攻毒当天和攻毒后7、14、21、28、35d每组随机抽取10羽采血，监测抗体效价。
观察指标及数据处理 (1)死亡率、剖检变化：观察记录同试验1。(2)增重率：攻毒后第35d称取存活鸡体重，计算各组总增重率。以上数据用t检验，比较各治疗组与病毒阳性对照组、中药预防组与疫苗组之间差异的显著性。(3)血清IBDV抗体效价监测方法：用AGP方法。(4)囊指数：病死鸡剖检时，同时用天平称取体重，并分离法氏囊称重。并从空白对照组随机抽取鸡3羽称取其体重和法氏囊重量。然后按文献计算囊指数和BBIX。计算公式如下：B/W(囊指数)＝法氏囊重量(g)÷体重(g)×1000；BBIX＝试验组囊指数÷空白对照组囊指数。若BBIX小于0.7，则判为法氏囊萎缩。
试验结果 (1)死亡率：单用中药的I组死亡率最低，与疫苗组及病毒阳性对照组相比差异显著(P＜0.05＝；中药加疫苗的III、IV组的死亡率也低于疫苗组。表明芪蓝抗毒饮有预防IBDV作用，与疫苗联合应用的保护率也好于单纯使用疫苗(表4)。
(2)死亡鸡器官出血阳性率：与疫苗组相比，单用中药组和中药加疫苗1组的腿肌出血显著(P＜0.05)减少；中药组的法氏囊出血极显著(P＜0.01)减少。表明芪蓝抗毒饮能显著减轻病鸡的腿肌和法氏囊出血(表5)。
(3)增重变化：总增重变化顺序依次为IV组＞I组＞III组＞II组＞V组。前3个组极显著高于II组、V组(P＜0.01)。表明芪蓝抗毒饮单用或与疫苗合用均能明显提高增重率，获得较好的经济效益(表6)。
(4)囊指数变化：在攻毒后48h，中药组和中药加疫苗2组的BBIX高于0.7，其余时间各组的BBIX均低于0.7，按文献所述，中药组在72h～120h、疫苗组、中药加疫苗1组在48h～120h、中药加疫苗2组在72h～144h，法氏囊均处于萎缩状态。提示只有中药组和攻毒前4d给药的中药加疫苗2组能在48h内抵抗法氏囊萎缩，减轻由病毒所致的损伤(表7)。
从结果还可看出，除中药加疫苗2组外，其余3组120h时的BBIX比96h时升高，表明法氏囊的损伤已经开始恢复，其中芪蓝抗毒饮加疫苗1组升高幅度最大，说明法氏囊损伤恢复最快。
(5)抗体变化：①抗体阳性率：在攻毒后第7d，中药组最高，为90％，疫苗组为62.5％，中药加疫苗1组和中药加疫苗2组为87.5％；第14d除中药加疫苗2组外，其余3组均为100％(表8)。
②抗体水平：在攻毒后第7d中药组最高，高于疫苗组1个滴度，中药加疫苗1组和中药加疫苗2组高于疫苗组0.88个滴度。中药加疫苗1组在攻毒后21d达到峰值，而其余4组在攻毒后28d才达到了峰值；在攻毒后第35d，各组的抗体水平开始下降，以中药对照组下降的最快(表9)。以上结果表明，芪蓝抗毒饮组抗体应答的速度快，在最短的时间内使血清抗体达到一个较高的水平。
(二)区域验证
在灌云县杨集镇先后共6群5000余羽15～30日龄的雏鸡发病，均出现鸡传染性法氏囊病的典型症状，剖检确诊为鸡传染性法氏囊病，用芪蓝抗毒饮治疗后，保护率都在90％左右。
(三)芪蓝抗毒饮药效总结
经过攻毒治疗比较试验证明，在六种不同处理组中，芪蓝抗毒饮处理组的疗效最好、病理出血最轻、增重效果最显著。攻毒预防试验证明，本方无论单用还是与疫苗同用，均能降低死亡率、提高特异性抗体水平；通过数群临床病鸡的治疗验证，保护率均达90％左右。
表1.攻毒治疗实验各组死亡数和死亡率
组别
指标
I II III IV V VI
样本数 117 100 195 118 195 199
死亡数 23 20 37 33 41 93
死亡率(％) 19.67±5.51B※ 20.00±0B 18.97±3.31C 27.97±7.78A 21.03±8.96B 46.70±5.84
注：与不治疗组相比，A，P＜0.05；B，P＜0.01；C，P＜0.005；D，P＜0.001。下2表同。
表2.攻毒治疗实验各组死亡鸡的器官出血阳性率(％)
组别
器官
I II III IV V VI
胸肌 26.45±28.80 33.64±3.71 15.70A±6.64 30.24±8.10 44.64±22.94 42.78±13.31
腿肌 86.36±17.37 90.46±0.32 42.66A±7.96 75.76±24.31 83.33±23.57 75.60±22.87
脾脏 81.82±21.43 62.73±16.72 22.15B±11.39 60.66±34.31 62.08±16.68 55.60±29.55
法氏囊 86.36±24.74 76.27±10.93 50.51B±3.99 84.85±5.95 73.69±10.41 82.75±15.66
表3.攻毒治疗实验各组给药前后体重和增重
组别
指标
I II III IV V VI
治疗前总重(kg) 19.41 20.73 37.03 19.46 36.34 36.86
治疗后总重(kg) 18.70 20.23 41.93 20.01 35.42 24.31
总增重(kg) -0.71±0.70C -0.50±0.07C 4.9±2.03D 0.55±0.63D -0.92±1.40C -12.55±1.90
治疗前均重(g) 165.9 207.3 189.9 164.9 186.3 185.2
治疗后均重(g) 198.9 252.8 265.4 235.4 230.0 229.3
均增重(g) 33.0±36.3 45.5±21.2 75.5±57.1B 70.5±1.6A 43.7±20.5 44.1±14.3
表4.攻毒预防实验各组死亡数和死亡率(％)
组别
指标
I II III IV V
样本数 37 38 38 41 40
死亡数 11 17 13 15 19
死亡率 22.81Aa 44.74 34.21 36.59 47.50
注：①与病毒阳性对照组比较，A，P＜0.05；B，P＜0.01；C，P＜0.005；D，P＜0.001。
②与疫苗组比较，a，P＜0.05；b，P＜0.01；c，P＜0.05；d，P＜0.001。以下同。
表5.攻毒预防实验各组死亡鸡的器官出血阳性率(％)
组别
器官
I II III IV V
胸肌 32.00 36.36 23.33 33.33 45.16
腿肌 60.00A 84.85 56.67A 75.76 70.97
脾脏 56.00 54.55 76.67 63.64 58.06
法氏囊 56.00Bb 87.88 83.33 90.91 83.87
表6.攻毒预防实验各组给药前后体重和总增重
指标 组别
I II III IV V
给药前总重(kg) 11.73 12.30 11.85 12.25 11.85
给药后总重(kg) 51.95 43.26 50.63 58.83 41.35
总增重(kg) 40.22 30.96 38.78 46.58 29.50
总增重百分率(％) 342.88Bb 251.71 327.26Bb 380.24Bb 248.95
表7.攻毒预防实验各组法氏囊指数的变化
指标
组别 攻毒后时间(h)
体重(g) 法氏囊重(g) B/W BBIX
48 390.7±28.51 0.99±0.36 4.06 1.04
72 378.7±35.40 0.91±0.19 2.40 0.51
I
96 321.6±28.61 0.88±0.17 2.74 0.48
120 310.5±0 0.70±0 2.25 0.50
48 390.1±48.74 0.84±0.17 2.15 0.61
72 384.5±35.36 0.85±0.28 2.20 0.47
II
96 388.1±22.71 1.07±0.22 2.75 0.48
120 337.3±20.91 0.95±0.06 2.82 0.63
48 389.8±27.93 0.65±0.20 1.67 0.47
72 372.8±50.46 0.88±0.19 2.36 0.50
III
96 337.3±16.56 0.70±0.10 2.08 0.36
120 318.3±29.86 0.95±0.26 2.98 0.67
48 432.0±28.69 1.17±0.38 2.70 0.77
72 387.7±37.20 0.95±0.27 2.46 0.52
IV
327.9±54.66 0.93±0.17 2.82 0.49
96
371.0±0 0.80±0 2.16 0.48
120 304.0±0 0.70±0 2.30 0.42
48 341.0±6.36 0.53±0.04 1.55 0.44
72 348.1±65.64 0.78±0.24 2.24 0.47
V
96 356.9±39.94 0.82±0.14 2.28 0.40
120 346.5±50.67 0.97±0.31 2.79 0.62
48 436.7±70.53 1.63±0.51 3.52 -
72 487.0±100.80 2.30±0.36 4.72 -
96 529.2±46.46 3.03±0.90 5.73 -
阴性对照组
120 506.5±27.83 2.27±0.55 4.48 -
144 490.7±59.55 2.70±0.26 5.50 -
168 532.3±64.57 1.82±0.40 3.41 -
表8攻毒预防实验各组AGP抗体阳性率变化(％)
攻毒后时间(d)
组别
7 14 21 28 35
I 90 100 100 100 100
II 62.5 100 100 100 100
III 87.5 100 100 100 100
IV 87.5 87.5 100 100 100
V 77.78 100 100 100 100
表9.攻毒预防实验各组抗体效价变化(log2)
攻毒后时间(d)
组别
7 14 21 28 35
I 2.50 8.50 9.70 10.7 8.56
II 1.50 8.20 8.80 11.00 10.80
III 2.38 8.50 10.13 9.75 9.00
IV 2.38 6.25 8.50 9.88 9.38
V 2.22 8.63 8.75 10.25 9.63