植物基因组的修饰 本发明涉及对植物细胞进行转化和植物基因组修饰的领域。
当前的植物转化技术普遍依赖抗生素或除莠剂抗性基因为转化的细胞提供其在选择试剂中的选择性生长优势，从而允许转基因组织的产生。转化通常被看作细胞/组织/植物获得由一种核酸分子所编码的性质的过程，该核酸分子是通过，但不限于，显微注射、提高细胞膜的通透率、微粒导入(biolistics)或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)感染的方法被引入细胞内。
该新引入的核酸不仅包含一段编码表现所需获得性性质的蛋白质的编码区域，还包含附加的调控序列如启动子，即一种核苷酸序列，通常位于编码区域上游(5’)，通过提供对RNA聚合酶和/或在正确位置上起始转录所需的因子的识别而控制该编码区的表达；一种聚腺苷酸化信号或终止子，其为一种核苷酸序列，通常位于编码区下游(3’)，控制多聚腺苷酸的增加以及转录的终止，或者是一种控制转录起始、延长和终止的调控性核苷酸序列。
存在于转化后的植物中地标记物或其残留物通常是不受欢迎的。从另一个角度来说，消除使用的标记物是非常必要的，因为转基因植物中存在的特定标记性基因阻碍了在随后对该植物的修饰过程中使用相同的标记基因。理论上，使用多个所需基因联合转化某种植物可以解决这个问题，该方法需要对未来市场进行准确的预测。然而，可以想象，技术人员希望以后能够将附加的性状引入已经成功的转基因的农作物中。不过，可供选择的标记物是有限的。
使用来自噬菌体P1中的位置特异性重组Cre/lox系统切除一段(标记物)基因是有关标记物去除系统的最早报告的例子之一(Odell等，1990；Dale和Ow 1991；Srivastava等，1999)。在该系统中，当lox重组位点以同一方向位于标记物的两侧翼时，通过Cre重组酶的作用可精确而保守地切除该标记物和该侧翼重组位点中的一个。该方法一大的缺点是需要额外将重组酶引入该转基因植物中以除去一段(标记物)基因。这就导致了必须以包含重组酶基因的构建体利用对第二种标记物的选择进行第二次转化，或者具有目标标记物的第一轮转化后得到的转基因植物，必须与包含该重组酶基因的转基因植物发生杂交。即使取得成功，该转化或杂交产生的后代仍然需要自体授粉或与一株非转化的植物杂交，以分离两种独立的转基因基因座，并找出只包含具有所需转基因的修饰后的T-DNA的植物。
另外一种方法涉及转座介导的重新定位(re-positioning)以及随后自转基因番茄中消除标记物基因(Goldsbrough等，1993)。在该系统中，Ds元件位于其侧翼的标记物被顺式(in cis)提供的Ac转座酶从所需的转化基因中分离出来。如果转座产生的第一次和第二次的插入位点之间的基因距离足够，二者间的重组通过自交和远交可能产生出不含有标记物的后代。因此，这两种方法似乎都不适合无性繁殖的农作物，因为必要的有性杂交会导致基因组的混杂(Flavell等，1992)。然而，在第二种方法中，不进行杂交分离标记物和目的基因也是可能的，因为Ds有时候不会再整合，但这只占转座事件的10％。
Ebinuma等(1996；1997a)在一种双功能标记物方法中使用了ipt基因，最先表明标记物可由位点特异地重组系统被去除，而不必依靠杂交、双重转化或流产转座事件(abortive transposition event)。在其多个自动转化(Multi-Auto-Transformation(MAT))方法的第一阶段，外植体上生成的转化枝条可通过其矮小的表型与未发生转化的枝条区分，该表型是由于位于T-DNA上的ipt基因过度表达产生过量的细胞因子引起的。由于枝条再生培养基中细胞因子的缺乏，未经转化的细胞的再生减少，至少在那些其再生需要该激素的种类中如此。转移至新鲜的培养基后，正常的枝条通过重组酶活性丢失其标记物后，从这些茂密的枝条中显现出来。
值得注意的是，R重组酶基因和标记物都位于同一T-DNA上，该重组酶基因的产物去除标记物和重组酶，使该系统可被反复利用。较早的在植物中应用这些系统的报告一直是在转化的第二个阶段或通过杂交而单独并以反式提供重组酶(见上文)。Ebinuma等(1996)采用的方法与其他方法的另一不同之处在于其也将ipt基因作为阴性选择的标记物。标记物的丢失使正常生长的枝条可以从周围其他的枝条中被区分出来。
最早的以SR1重组酶为特征的MAT系统中，其活性为组成型表达，但明显地，其活性几乎不能达到足以去除重组位点侧翼内的目标的水平。在最近的关于MAT系统的描述中，R重组酶上游的CaMV 35S启动子被除草剂安全剂诱导型GST-II-27启动子替代，导致ipt选择性枝条外植体的频率增加(Sugita等，2000)。但矛盾的是，上述方法的成功依赖于低重组酶活性。
Gleave等(1999)描述了另一种生成不含标记物的植物的方法，该方法不需要杂交或自交。在该方法中，植物首先经一种构建体进行转化，该构建体中待去除的DNA片段的侧翼为lox重组酶位点。随后，两种单拷贝的转化子由含有携带Cre重组酶的构建体的土壤杆菌进行转化。然而，该构建体并非是要得到稳定的整合，而是应该瞬时产生足够的重组酶活性以引起位点特异性重组。因此，并未使用双态质粒中的hpt标记物，并从再生培养基中去除潮霉素。由于以lox作为侧翼的DNA片段包括胞嘧啶脱氨酶基因，通过氟胞嘧啶耐受性(FC；Stougaard，1993)即可评价去除情况。结果表明，对经重组酶介导的去除进行测验的枝条中仅有0.25％耐受FC；其中大部分是由整合的Cre重组酶所引起的。
并非所有的标记物去除系统都需要辅助蛋白如重组酶来诱导去除事件。Zubko等(2000)报告在噬菌体λ中的attp区域之间进行染色体内重组可产生不含标记基因的转基因烟草。然而，该切除的精确度和频率都是低的。
本发明提供了一种特征在于去除标记物基因的转化系统，其对于植物生物技术总体上来说是极其重要的，因为其可以降低对其他标记物的需要，这些标记物每种都各有特性，并且须经特定的改变以适应转化的需要。本发明还提供了一种获得基本上不含有标记物的转化的植物细胞、植物或其部分(如根、枝条、分生组织、或胼胝物质)及其后代的方法，并提供了所述的基本上不含标记物的转化的植物或其部分。
在本发明提供的一种优选的方法中，重组酶的活性受到严格控制，而且诱导很快引起立即去除(所有)插入的选择性标记物和重组酶基因的高活性，而过去诱导重组酶活性的尝试则不具有这些优势。例如，在WO0136595中，重组酶的活性不受配体结合域(LBD)调控(更不可能是翻译上的融合)，也进行阴性选择来获得不含有标记物的植物或植物细胞。此外，在Lyznik等(Plant Journal 8：177-186，1995)等的文章中，不恰当地使用了FLP重组酶，并且是该FLP基因的一种野生型而不是适合植物的类型。重组酶的活性也不受(翻译融合)配体结合域的调控，因此基本上没有进行阴性选择以获得不含标记物的植物(细胞)，而且重组酶的基因也未随标记物基因一起被去除。
在Sugita Koichi(Plant Journal 22：461-469，2000)等人的文章中，重组酶活性被化学诱导的启动子所控制，且R重组酶是一种野生型而不是适合植物的类型，使得该方法不适于去除抗生素/除莠剂抗性的选择性标记物，该方法依赖于因标记物的存在对异常表型的诱导以及在丢失该特定的标记物的植物中正常表型的恢复。换句话说，的确存在一种缺乏标记物时的阴性选择。
在Zuo Jianri等(Nature Biotech19：157-161，2000)的文章中，重组酶的活性不受翻译融合配体结合域的调控。而LBD在翻译水平上与一种人工转录激活子融合。在这种情况下，加入诱导剂会激活转录因子，引起该重组酶基因的转录。本发明提供一种通过LBD调控重组酶活性的方法，该方法是直接的，即翻译后的；又是间接的，即转录调控的(如在Zuo等的文章中)，基本上排除了为获得不含标记物的植物(细胞)进行的阴性选择，例如，其可被植物细胞中的植物雌素所激活。
在EP0716147中，重组酶的活性(虽低，但是)受到一种35S的启动子的组成型控制，从而使该方法不适于去除具有抗生素/除莠剂抗性的选择性标记物，该方法依赖于因标记物的存在对异常表型的诱导以及在丢失该特定的标记物的植物中正常表型的恢复，因此，缺乏标记物时的确存在一种阴性选择。
本发明的系统的重要性对那些消耗大量精力却难以实现转化的顽固的农作物而言更为有意义，更不用说每一步都有不同方案的多重转化了。本发明提供的转化系统允许在连续的转化过程中反复使用同一种标记物，并均可在同一方案下进行(除非先前的转基因影响转化)。换言之，一旦一种适合顽固农作物的转化系统开始起作用，就不必为获得新的转化子而对标记物和选择性试剂的新的、附加的组合的最佳条件进行长期反复研究了。
在一种实施方式中，本发明提供了一种深入的观点，即植物中位点特异性的重组酶的诱导型激活允许在对转基因植物进行选择后将选择性标记物诱导型去除。换言之，重组酶基因，(可选择的)标记性基因和任何其他的基因或基因碎片(其存在在某种意义上说不必要，并且根据本发明优选地位于所述的特定重组酶基因或片段之间的重组位点上)，利用诱导所述的重组酶的活性，自转化后的植物细胞中被去除，从而形成本发明的基本上不含标记物的转化植物细胞(以及由此产生的植物和其后代)。
Ebinuma等(1996)描述的相对成功的MAT系统依靠相对较低的重组酶活性，因为高活性会造成标记基因活性提前丢失，从而使转化效率大大降低。然而，在本发明所提供的使用严格控制的或诱导型重组酶表达或定位的系统中，高酶浓度利于获得有效的重组。MAT系统中R重组酶相对较低的表达很可能由其相对较高的A+U含量引起的不利该系统的密码子的使用以及可能的隐匿植物调节信号所致。例如，对一种具有高A+U偏向性的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIA(b)毒素基因的研究表明，需要对编码序列进行完全修饰以在转基因番茄和烟草植物中获得强效表达(Perlak etal.，1991)。优化密码子、缺乏ATTTA的序列和潜在的植物聚腺苷酸化位点的合成基因可以产生比野生型基因高100倍的蛋白质水平。其他具有高A+U偏向性的和在植物细胞中低水平表达的基因的例子如编码T4溶菌酶和克雷伯肺炎环糊精糖苷转移酶的基因，表明低表达并非是苏云金杆菌基因[16，39]特有的。
本发明提供了一种转化植物细胞的方法，包含为所述的细胞提供诱导型的位点特异性重组酶活性。通常每种位点特异性重组酶催化两个相同的酶特异性重组位点的重组，换言之，每种重组酶都具有其特定的作用位点。此外，除天然的位点以外，很多重组酶还能利用变异的重组位点，如噬菌体P1中的Cre/lox系统、酿酒酵母中的FLP/FRT系统、醤油酵母中的R/RS系统。LBD编码序列可自动物糖皮质类固醇、雌激素或雄激素受体基因中获得。此外，本发明提供的一种方法进一步包含为所述细胞提供一种编码选择性标记物的核酸，该核酸的侧翼为所述的重组酶特异性重组位点。优选地，所述的重组酶特异性重组位点位于编码该重组酶基因或其片段的核酸和/或编码可诱导或提高重组酶的活性的多肽的基因片段的侧翼，产生基本上不含有标记物的转化的植物细胞，该细胞可用于再生成只含有所需性状的转化的植物或其子代。选择性标记物的例子由在此所附的非穷举性标记物列表中提供或为本领域已知。
在本发明的一个优选的实施方案中，为了最大程度地进行表达，再合成的重组酶基因G+C的含量增加，如从41％增至49％，所需的XXC/G型密码子的频率由41％增至63％，并优选地未改变其氨基酸序列。例如，在具体实施方式中所述，产生的合成基因与一个配体结合区域或细胞核转运信号多肽融合。
本发明提供了一种产生植物细胞DNA的诱导型位点特异重组的方法，以及由该方法获得的转化的植物细胞。所述的细胞例如首先具有一个如上所述的配体诱导型的位点特异性重组系统。一个位点特异的重组系统通常包括两个要素：一对DNA序列(重组位点)和一种特异性的酶(位点特异性重组酶)。该位点特异性重组酶只催化两个特定的重组位点之间的重组反应。根据重组位点的定向，在相应的重组酶的作用下，连接重组位点的序列或被切除，或被倒转。切除的DNA片段被环化，在重组酶存在的条件下可被重新整合。然而，如果重组酶的表达被限制，这种在热力学上可能性最小的双分子结合反应就会减少。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种转化植物细胞的方法，包括为所述的细胞提供配体诱导型的位点特异性重组酶活性，其重组酶的活性由在转录水平融合的配体结合域调控。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供一种观点，即通过融合重组酶和类固醇受体的配体结合域(LBD)可几乎完全控制其活性。因此，该重组酶仅在特定配体存在时具有活性。该特性使该重组酶及DNA序列被引入所述的植物细胞中，其中DNA序列编码至少两个由一个选定的DNA片段分隔开的重组位点，而不受该选定的DNA片段提前切除或倒转的影响。
细胞在根据标记物设置的特定的选择性压力下被选择出来。随后的切除由使所述植物细胞丧失其配体诱导型重组酶活性控制，包含诱导所述的活性，并在其特异性重组位点将该DNA构建体切除，由此切除所含的标记物序列和编码诱导型重组酶活性的核酸。优选地，所述的配体包含类固醇，在一个优选的实施方案中，本发明提供通过一种由植物细胞摄入特定的类固醇诱导的植物细胞中位点特异的重组的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供一种观点，即植物中的位点特异性重组酶的激活允许在选择转基因植物的选择后选择性标记物的诱导性去除，也可通过(暂时地)将细胞溶胶(cytosol)中大部分重组酶活性转移至核内实现。在另一个实施方案中，可通过为重组酶提供一种核转运肽，特别指核输出信号肽来实现该过程。使用如细霉素B(leptomycineB)处理表达与所述的核转运信号肽结合或相连的重组酶的植物细胞，导致重组酶自核的输出降低以及核内重组酶活性的升高，从而允许并促进DNA构建体在其特定的重组位点的切除，并切除含有标志物的序列和编码具有涉及的转运信号肽的重组酶的核酸。换言之，另一种控制重组酶作用的方法是使其位于胞浆内，直至需要其作用的时候释出。为了促使可诱导的胞浆-胞核转移，核输出信号与合成R重组酶的C末端融合，并由如细霉素B处理的含有重组酶构建体的转化细胞来实现转移过程。在一个优选的实施方式中，所述的重组酶具有番茄核输出信号(NES)，如具体实施方式中所述。
本方法提供了例如用两个含有重组位点的DNA序列对植物细胞进行转化，以使得所述的DNA序列被插入不同的基因组位置。或者，一段选定的DNA片段连接所述的含有重组位点的两个DNA序列。此外，第三个DNA序列也可能通过转化被导入植物细胞中，该序列包含一段编码位点特异性重组酶的基因，该基因在翻译水平上与一段编码类固醇受体的配体结合域(LBD)或核转运信号肽的基因片段融合。该重组酶须为特异的，至少对被导入的作为第一和第二个DNA序列的重组位点具有选择性。在植物细胞中起作用的一些位点特异的重组酶系统包含但不限于噬菌体P1中的Cre/lox系统，如噬菌体P1中的Cre/lox系统、酿酒酵母中的FLP/FRT系统、酱油酵母中的R/RS系统。编码LBD的序列可自动物糖皮质类固醇、雌激素或雄激素受体基因中获得。
本发明还提供了一种植物转化载体，该载体包含编码具有重组酶活性的多肽的第一种核酸和编码包含配体结合域的多肽的第二种核酸的构建体，该配体结合域来自胞核中的激素受体或与核转运信号肽具有等价功能的一种肽，所述的载体包含至少两个位于适用于本发明的方法的所述构建体的侧翼的重组酶特异性重组位点。具体地，本发明涉及一种载体，其中第二种核酸编码一种多肽，该多肽包含一个配体结合域或信号肽，其C或N末端与载体中编码具有重组酶活性的多肽的第一种核酸相连。优选地，该配体结合域或核转运信号肽在翻译水平上与该重组酶融合，形成一种杂交蛋白质。自一个优选的实施方式中，所述的第一种核酸至少部分来源于酱油酵母(Araki等1992)中的R重组酶基因。为促进最大程度地表达，本发明优选地提供一种载体，其中所述的第一种核酸含有至少45％的G+C含量，更为优选地为至少48％。作为优选的配体结合域，本发明涉及的载体具有一个类固醇结合区域。
如需对(可去除的)标记物进行选择，本发明涉及的载体还包含一种核酸，该核酸编码一种可选择的标记物如单功能的阳性标记物(positivemarker)，一种单功能阴性标记物(negative marker)和/或一种双功能标记物。优选地，该载体中的单功能阴性标记物或双功能标记物产生胞嘧啶脱氨酶活性，优选地，其中的双功能标记物含有新霉素磷酰转移酶II和胞嘧啶脱氨酶活性。原则上，不含标记物的细胞的阴性选择包括由诱导型启动子控制的毒性蛋白/肽的生成。实际上，必要地使用诱导型蛋白控制所述的毒性蛋白有效地破坏了在与阳性标记物(抗生素抗性)的融合中使用阴性标记物。阳性标记物只有受到诱导后才具有活性，即无法实现转基因细胞的选择。本发明提供的用于单功能负向或双功能标记物中的胞嘧啶脱氨酶(codA)基因允许使用组成型启动子，因为只有在无毒的底物经过酶的作用转化为毒素时，编码的蛋白质才对细胞有毒。
优选地，待去除的DNA片段不包括杂合重组酶-LBD基因，或杂合重组酶-信号肽基因。在一个实施方式中，该载体包含一种编码例如一种重组酶-LBD杂合子或重组酶-信号肽基因的核酸序列连接的同一方向的两个重组位点，并进一步包含促进植物细胞中杂合基因的表达的启动子和一种聚腺苷酸化信号。控制杂合基因表达的启动子和终止子均位于以重组位点作为侧翼的区域之外。本发明中位点特异的重组引起连接两个重组位点的第三种DNA序列的去除。如果相同的DNA序列连接相反方向的两个重组位点，位点特异的重组将导致编码由植物细胞中的活性启动子驱动的杂合基因和一种聚腺苷酸化信号的DNA序列的倒转。
在另一个实施方式中，连接两个相同方向重组位点的DNA片段不仅编码上述的杂合基因及其启动子和终止子，还包含编码在以后的阶段中被去除的标记物或特征物的第二种基因。启动子和终止子均不必须为连接重组位点的序列的一部分。第二种基因的表达由一种植物启动子控制，转录则由一种聚腺苷酸化信号终止。位点特异性重组可引起这两种基因或其他位于两个重组位点间的序列的切除。
更为优选地，引入细胞的DNA片段不仅包含重组酶-LBD杂合子或重组酶-信号肽基因，一种标记基因及其各自的同向的重组位点侧翼调控序列，而且包含一种或更多种编码农业或植物学上的重要的特征的基因，其调控序列位于以重组酶位点作为侧翼的区域之外。典型的标记基因对潮霉素、卡那霉素、博来霉素、硫脲胺和PPT均具有抵抗性。根据不同的标记物选择针对不同选择性培养基的抗性获得转化细胞。该转化细胞在用于目的为激活重组酶的处理(例如潮霉素B处理)之前，可以再生成植物的器官或整个植物。另外，未分化的转化细胞将与转化载体中使用的LBD的特异性配体发生作用。
在一个优选的实施方式中，LBD来自大鼠的糖皮质类固醇受体或核信号肽(NES)来自番茄核输出信号，激活重组酶处理时使用的起始材料是一种转基因植物，该植物包含所需的特征。地塞米松或细霉素B可以多种途径使用。
【附图说明】
图1为pBERL-GUS的图示。Enh＝CaMV 35S增强子；35S＝CaMV35S启动子；Rs＝重组位点；IVS-AMV＝苜蓿花叶病毒翻译增强子，位于马铃薯微粒结合淀粉合酶基因(gbss)内含子5之后；重组酶＝合成R重组酶；LBD＝大鼠糖皮质激素受体配体结合区域；T＝nos终止子；nptII＝新霉素磷酸转移酶II；GUS＝β-葡糖醛酸糖苷酶；LB和RB＝左右边界。
图2所示为经Eco RI消化的基因组DNA的southern印迹，该DNA来自未处理(条带C)和经DEX处理(条带1.1至1.6)的pBERL-GUS转化的马铃薯家系，使用的探针为DIG标记的GUS片段。
图3为RCNG构建体的图示。Enh＝CaMV 35S增强子；35S＝CaMV35S启动子；Rs＝重组位点；IVS-AMV＝苜蓿花叶病毒翻译增强子，位于马铃薯gbss内含子5之后；重组酶＝合成R重组酶；LBD＝大鼠糖皮质激素受体配体结合区域；T＝nos终止子；npt II＝新霉素磷酸转移酶II；GUS＝β-葡糖醛酸糖苷酶；hpt＝潮霉素磷酸转移酶；LB和RB＝左右边界。
图4为pMRECNESG构建体的图示。Enh＝CaMV 35S增强子；35S＝CaMV 35S启动子；Rs＝重组位点；IVS-AMV＝苜蓿花叶病毒翻译增强子，位于马铃薯gbss内含子5之后；重组酶＝合成R重组酶；NES＝核输出信号肽；T＝nos终止子；cod A＝胞嘧啶脱氨酶；npt II＝新霉素磷酸转移酶II；GUS＝β-葡糖醛酸糖苷酶；hpt＝潮霉素磷酸转移酶；LB和RB＝左右边界
图5＝表1
图6＝表2
【具体实施方式】
构建体
pBIN35Snos。通过将一种双重CaMV 35S启动子和一种胭脂氨酸合酶基因(nos)终止子(Bevan，1984)引入BIN19中，产生可插入重组酶和GUS基因的植物转化载体。两个包含来自pBI221的nos终止子的SacI-EcoRI片段被克隆入Sad消化的pMTL23(Chambers etal.，1988)。BamHI-EcoRI对该克隆的双重消化产生出一种含有连接于用相似方法消化的pBIN19的nos终止子的片段，得到pBIN19nos。含有双重增强子区域的CaMV 35S启动子通过如下方法获得：来自pRokl的CaMV 35S启动子被克隆pUC19中生成pPCaMV(Baulcombe等1986；Yanisch-Perron等1985)。通过将pBI121中的HindIII-EcoRV片段亚克隆至pBluescript SK+中(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)产生pCaEH(Kay etal.，1987)，获得35S启动子的增强子片段。将相应的经HindIII-EcoRI消化的pCaEH的片段和EcoRI-XbaI消化的pPCaMV的片段连接入HindIII-XbaI消化的pBI121，从而将含有增强子的片段的与完整的启动子结合形成增强的启动子。增强的35S启动子由HindIII-BamHI双重消化从该构建体中分离出来，并被克隆至pBIN19nos内，形成pBIN35Snos。
pAMV-1。pAMV-1是pMTL23的衍生物，包含被克隆至BglII-和NcoI位点中的苜蓿花叶病毒(AMV)的翻译增强5′未翻译区(UTR)(Jobling and Gehrke，1987)。由被T4多核苷酸激酶磷酸化的寡核苷酸5′-GATCTGTTTTTATTTTT-AATTTTCTTTCAAATACTTCCAC-3′和5′-CATGGTGGAAGTATTTGAAAGAAAAT-TAAAAATAAAAACA-3′组成的双链被连接入BglII-NcoI消化的pMTL23，由此获得pAMV-1。产生的载体中有一个突变，即划线的胞嘧啶(C)残基被一个腺嘌呤残基(A)取代。
PIVSAMV。利用PCR自马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种Bintje中分离马铃薯颗粒结合淀粉合酶基因中的内含子5，其中使用了以下的寡核苷酸：5′-CTGGAAGATCTGGACAATCAACTTAG-3′和5′GCTACGGATCCAATTCAAAACT-TTAGG-3′(Van der Leij等，1991)。经纯化的片段经BamHI和BglII的切割并被克隆入BglII消化的pAMV-1中(Rouwendal等1997)。使用ALF系统(Pharmacia Biotech)的双脱氧测序法检验克隆的内含子的序列。
pREC。构建合成重组酶基因的策略建立在以24个长的寡核苷酸作为起始材料的重叠延伸PCR方法的基础上(Ho etal.，1989)。第一步包括12个扩增反应，使用配对准确组合(pair-wise combination)的重叠有义(奇数：1-23)和反义(偶数；2-24)寡聚物(oligo)，每种的平均大小为81nt(Rouwendal etal.，1997)。该反应按如下步骤进行：在标准Pfu DNA聚合酶缓冲液中，在94℃下反应30s，45℃反应15s，72℃反应15s的方式进行十轮，其中寡聚物的浓度均为20pmol，且25微升终体积中含有0.5uPfu。反应产物经Qiaquick extraction(QIAGEN GmbH)提纯后溶于10mMTris-HCl pH 8.0，0.1mM EDTA(TioEo.i)中。在第二步中，大约20％的双链反应产物在下列条件下再次由PCR重叠伸展法耦合：在AdvantageKlenTaq DNA聚合酶缓冲液(Clontech)中，94℃反应30秒，35℃反应一分钟，72℃反应45秒，进行25个循环。该缓冲液中含有10pmol寡聚物，1加4(片段A；位置1-275)，5加8(片段B；位置256-527)，9加12(片段C；位置508-779)，13加16(片段D；位置760-1031)，17加20(片段E；位置1012-1283)及21加24(片段F；位置12641489)，最后的体积为25uL并含有0.5 aL Advantage KlenTaq。得到的产物经Qiaquick extraction纯化，再溶于T10E0.1中。随后将3’腺苷酸插入pGEM5Zf衍生物中完成PCR产物的克隆，该衍生物的3’突出端由XcmI消化产生(Schutte etal.，1997)。此6个片段中的一些独立的克隆均被测序，以发现一个没有错误的片段。这种方法对于除片段B外的所有的片段都有效。片段B中的两个错误由重叠伸展与巨引物诱变法(megaprimermutagenesis)(Sarkar和Sommer，1990)修正。由针对短末端特异性的寡聚物的PCR克隆其余的5个片段，所有6个PCR片段均在Pwo DNA聚合酶的作用下，通过一系列重叠伸展反应融合在一起。产生的全长产物经NcoI和BamHI的消化后，被克隆入pAMV-1中。对3种不同克隆的测序表明一种只有一个错误的克隆。该错误可由重叠伸展突变法矫正，其产物由NcoI和BamH消化并被克隆入pIVSAMV。再次用双脱氧测序法检测其中错误。
pLBD。用重叠伸展突变法处理2个PCR片段从克隆6RGR中获得大鼠GR LBD(氨基酸残基512-795)，其中的PCR片段由以下引物生成：5′-CTCTAGATCTACAAAGAAAAAAATCAAAGGGATTCAGC-3′和5′-CTGGGAAC-TCAATACTCATG-3′以及CTTAGGGATCCAGTCATTTTTGATGAAACA-GGAG-C-3′和5′-CATGAGTATTGAGTTCCCAG-3′(Miesfeld etal.，1986)。突变去除了一个EcoRI位点。得到的产物被克隆入pMTL23，由双脱氧测序法验证。
pCODNPT。由PCR法自JM109菌株中分离该大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(codA)，引物为：5GTGAACCATGGCTAATAACGCTTTACAAACAA-3′和5′-GCAGTGGATCCACGTTTGTAATCGATGG-3′。NcoI和BamHI消化后，该PCR产物被克隆入pIVSAMV中的NcoI和BamHI位点。利用PCR法从pBIN19中分离Nptll基因，引物为5TCGCAGATCTGAACAAGA-TGGATTGCACG-3′和5′GCTCAGGATCCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3′。该PCR片段经BglII和BamHI消化后被克隆入pMTL23中的BglII和BamHI位点。在继续构建杂合基因之前通过测序对该两个克隆的序列进行验证。将包含gbss内含子的BglII-BamHI片段、AMV增强子和codA基因克隆至nptII基因上游的BglII位点，由此产生融合基因。
pMCODNPT。由杂合codA-nptII基因组成的BglII-BamHI片段及其表达增强5′UTR被插入至pMOG-EGUSn的BamHI位点。最终的构建体pMCODNPT通过电穿孔引入根癌土壤杆菌LBA4404(Nagel等，1990)。
p35S。用引物5’-GCGACAGATCTAATGCTAACCCACAGATGG-3’和5’-GCGACGGATCCCCTCTC-CAAATGAAATGAAC-3’，通过PCR自pBIN35Snos分离CaMV35S启动子。经BglII和BamHI消化，将该片段克隆入经BglII-BamHI消化的pMTL23。测序以检查PCR错误。
pNOSt。采用PCR法获得Nos终止子，以pBIN35Snos为模板，引物为5’-GTGACAGATCTCGAATTTCCCCGATCGT-3′和5′-CCAGTGGATCCCCGATCT-AGTAACATAG-3’。BglII-BamHI消化的片段被克隆入BglII-BamHI消化的pMTL23。
pRsRECLBDnosRs。将鼠GR的LBD作为BglII-BamHI片段插入BamHI消化的pREC，使其在翻译水平上融合入合成的R重组酶基因中。PCR可以发现包含正确方向的LBD的克隆，并以pRECLBD消化之。融合使得重组酶C端和LBD的N端增加了两个氨基酸残基。以pBIN35Snos为模板由PCR法获得该nos终止子，引物为5′GTGACAGATCTCGAATTTCCCCGATCGT-3′和5′-CCAGTGGACCCCGATCTAGTAACATAG-3′。生成的片段经BglII-BamHI消化并克隆入pRECLBD中的BamHI位点。PCR可鉴定出方向正确的nos终止子克隆，并以pRECLBDnos标记。该Rs亦可由PCR法分离，引物为：5′-AGGCGAGATCTTATCACTGT-3′和5′GTCACGGATCCACGATTTGATGAAAG-AAT-3′。生成的短PCR产物经BglII-BamHI消化并被克隆入pRECLBDnos。PCR选择出含有正确方向的Rs的构建体。BglII-BamHI消化的Rs PCR产物用于将Rs序列插入重组酶-LBD杂和基因上游的BglII位点。双脱氧测序可鉴定Nos终止子和Rs序列，并检测Rs序列是否正向重复的。
pBERL-GUS。重组酶-LBD杂合基因及其侧翼的Rs序列由BglII-BamHI的消化自pRsRECLBDnosRs中分离出来，并被克隆入pCeGN中的GUS上游的BamHI位点。pCeGN是一种pBI221衍生物，其中的CaMV 35S启动子被其pBIN35Snos的加强型所取代(Jefferson，1987)。插入方向正确的构建体由PCR选择出来。下一步使用EcoRI处理该克隆，切去位于重组酶-LBD杂和基因上游的增强子和CaMV 35S启动子与位于该重组下游的原始pUC19多克隆位点末端位点之间的限制位点。包含启动子、杂合基因和GUS的片段被分离出来并插入EcoRI消化的pBIN35Snos中，其中含有启动子和nos终止子的片段均被消化去除。大片段的正确插入由PCR和限制性消化证实。终产物pBERL-GUS由电穿孔法被引入根癌土壤杆菌LBA4404(Nagel etal.，1990)。
pMOG-EGUSn。该pBIN35Snos载体由EcoRI部分消化并由HindIII完全消化。生成的片段包括增强的35S启动子和nos终止子，并被克隆入HindIII-EcoRI消化的pMOG22中，pMOG22是一种与pBIN19相似的载体，其植物选择性标记物为CaMV 35S驱动的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因，而不是nptII基因(由MOGEN international b.v.提供)。
pTOPORs。重组位点Rs由PCR法自酱油酵母中分离出来，引物为5′-AGGCGAGATCTTATCACTGT-3′和5GTCACGGATCCACGAT-TTGATGAAAG-AAT-3′。该短PCR产物通过一种TA克隆试剂盒(Invitrogen)被直接克隆入pCR2.1，生成的产物经过测序。
pRCNG。将大鼠GR中的LBD作为一种BglII-BamHI片段自pLBD中分离出来，并插入BamHI消化的pREC中，使其在翻译水平上与合成R重组酶的C端融合。含有方向正确的LBD由PCR选择并命名为pRECLBD。该融合使得重组酶C端和LBD的N端之间增加了两个氨基酸残基。含有来自pNOSt的片段的nos终止子经BglII-BamHI的消化被克隆入pRECLBD中LBD下游的BamHI位点。包含方向正确的Nos终止子的克隆由PCR鉴定，并命名为pRECLBDnos。用于控制杂合CODNPT标记基因的CaMV 35S启动子由BglII-BamHI的作用自p35中切除，并被可隆入pRECLBD中的nos终止子下游的BamHI位点。再次应用PCR鉴定包含所需方向的插入克隆。类似地，将BglII-BamHI片段插入CaMV35S启动子下游的BamHI位点，该片段包含来自p CODNPT的CODNPT基因并包含由AMV翻译增强子组成的5′UTR和一段植物内含子序列。来自pNOSt的经BglII-BamHI消化的nos终止子被再次插入标记基因下游的BamHI位点。自pTOPORs中分离的BglII-BamHI片段被插入到两个重组位点，一段被插入重组酶-LBD基因上游的BglII位点，另一段被插入nos终止子下游的BamHI位点。两个位点的定向均由PCR测定。将含有重组酶基因和以Rs序列作为侧翼的标记物基因的大BglII-BamHI片段插入pMOG-EGUSn中的BamHI位点形成PRCNG载体。
植物转化和组织培养
马铃薯转化。转化实验所需的马铃薯枝条(Solanum tuberosum cv.Saturna或Bintje)和产生的转基因植物由以下组织培养法获得：23℃下经16小时的光照/8小时的避光处理于MS培养基中培养，(Murashige和Skoog，1962)该培养基中含有维生素，0.8％(w/v)琼脂，和3％(w/v)蔗糖。转基因马铃薯在含100mg/L的卡那霉素(kanamycin)和200mg/L的头孢特新(cefatoxim)的相同培养基中生长(Murashige and Skoog，1962)。基本上按照Edwards等(1991)所述的方法，使用双态载体中的根癌土壤杆菌菌株LBA4404转化无菌生长的马铃薯的茎外植体，其中用茎代替了叶盘(leaf disk)，用头孢特新cefatoxim(200mgL-1)代替了奥格门汀(augmentin)。
草莓转化。在含有MS培养基的增殖培养基中培养4至6周获得转化实验所需的草莓(Fragaria x ananassa cv Calypso)，该MS培养基含有维生素(2.2g/L)，3％(w/v)蔗糖，0.9％(w/v)琼脂，以及浓度均为0.1mg/L(pH5.8)的BAP和IBA，并在培养箱中在25℃下培养16小时(见光)/8小时(避光)。直径在7毫米的叶盘将被用于转化，并被切下置于含有共同培养基的培养板中培养，该共同培养基含以下成分：02.2g/L MS培养基(包含维生素)，3％蔗糖，0.4％植物胶，0.2mg/L NAA，1.0mg/LTDZ和100μM乙酰丁香酮，pH 5.8)。菌株悬液的制备包含将双态质粒的根癌土壤杆菌AGLO置于含有10ml的LB的培养基的50mL的试管中，在28℃下摇振过夜，该LB培养基含有卡那霉素(50mg/L)和利福平。该细菌在2500g下离心，抛弃上清，并重新悬浮于40mL MS培养基(2.2g/L)中，该培养基含有3％葡萄糖和100μM乙酰丁香酮(pH 5.2)，并进行计数。将20mL土壤细菌悬液倒入Petri盘中进行转染，该盘中的共同培养基上含有叶盘组织。10-20分钟后，将叶盘置于滤纸上干燥，并在上方覆盖Whatman滤纸片(1级，直径8.5cm)，覆盖Petri盘中的共同培养基。在21℃下避光共同培养4天后，叶盘被转移至再生培养基中，即在共同培养基中加入头孢特新cefotaxim(250 mg/L)和卡那霉素kanamycin(100mg/L)并置于25℃下培养16小时(见光)/8小时(避光)。每4天将叶盘置于新鲜的培养基中，新生的枝条被置于含MS培养基(4.4g/L)的罐中进一步进行繁殖，该培养基包含3％蔗糖和0.9％琼脂以及卡那霉素(50mg/L)和头孢特新cefotaxim(250mg/L)。生长良好并在该培养基内生根的枝条再次被转移至同样的培养基中，但该培养基不含卡那霉素和头孢特新。
基因组DNA的分离和分析
马铃薯基因组DNA由Nucleon Phytopure植物DNA提取箱从1g组织培养生长植物样品中提取出来，并在Sorvall SS34转子中(转速30,000g)离心45分钟，纯化第一次离心的上清液。EcoRI消化的DNA由0.8％琼脂糖凝胶分离，并由前述的Southern印迹法分析(Allefs etal.，1990)。在DIG(digoxigenin)DNA标记的含有dATP，dGTP，Dctp各100μM和65μMdTTP，35μMDIG-11-dUTP(Roche Molecular Biochemicals)的混合液中，以特定引物由PCR对探针进行标记。与10ng/mL DIG标记的探针的杂交按制造商的说明(Ambion)，在42℃下Ultrahyb缓冲液中过夜进行。第二天，室温下，在2×SSC，0.1％SDS中两次洗脱染色点，每次5分钟，并在65℃下，在0.5×SSC，0.1％SDS中再洗脱两次，每次15分钟。染色点经DIG洗脱和固定即可用于检测抗-DIG-AP介导的杂交子。实际观察与DIG标记的杂合子结合的碱性磷酸酶结合抗生素时，使用CDP-Star(RocheMolecular Biochemicals)和Berthold NightOWL来检测荧光。
根据Haymes(1996)报道，将用于PCR分析的草莓基因组DNA自培养的草莓的叶组织中分离出来。分析法中的引物对如下：a)nptII基因的检测：5′TGGGCACAACAGACAATCGGCTGC-3′和5TGCGAATCGGGAGCGGCGATACCG-3′；b)GUS的检测：5′-CTGTAGAAACCCC-AACCCGTG-3′和5′-CATTACGCTGCGATGGATCCC-3′；c)virG的检测：5′-GCC-GGGGCGAGACCATAGG-3′和5′CGCACGCGCAAGGCAACC-3′；d)重组事件的检测：5′CCACTATCCTTCGCAGACC-3′和5′-TATCTGCATCGGCG-AACTGA-3′。
结果
修饰的R重组酶基因的设计与合成
有效操作条件性重组酶介导的DNA切除系统需要较高的酶水平。以往对Z.rouxii野生型R重组酶基因的研究表明其在植物中的表达不高(Onouchi etal.，1991，1995)。该现象可能由于该基因中的高A+U偏向性，本发明将其中G+C的含量由41％提高到49％，与编码RuDP羧基羧化酶的小亚单位一样，这一含量非常接近双子叶植物高表达植物基因中该碱基对的值(Rouwendal etal.，1997)。合成重组酶基因的策略与曾用于修饰基因密码子的编码绿色荧光蛋白的基因的使用方法极为相近(Rouwendaletal.，1997)。该过程包括首先耦合长的重叠寡聚物，接着进行重叠伸展扩增。与前面的报告相反，先克隆6个大小为250bp，包含4个长寡聚物的中间产物，并进行测序，然后再继续合成。测序用于检验错误，如有必要可进行修复。选择出的克隆作为模板制备6个正确的PCR片段，组合起来即整个基因。这些括增步骤使用短的寡聚物，而不是最初的反应中使用的长寡聚物，因为大多数错误是由于是用长寡聚物作为起始物所致，而与PCR无关。PCR片段通过一系列重叠伸展反应合成重组酶基因全长。得到的产物被克隆，有些序列还被测序。通过重叠伸展诱变法修正这些克隆中的单个错误，BamHI-BglII消化的重组酶片段被克隆入pIVSAMV载体中，其中马铃薯gbss基因内含子5和AMV翻译增强子位于该片段5′UTR。生成的重组酶中的氨基酸序列在起点部位远离野生型R基因，以便容纳NcoI位点，而且其不含有终止密码子，以使该序列与鼠GR LBD在翻译水平上融合。
构建用于测试类固醇诱导型重组酶活性的植物转化载体
来自类固醇受体家族的不同数目的LBD的C末端与转染的哺乳细胞系融合时，可介导该细胞的条件性重组酶激活。类固醇介导的转化的植物细胞中的转录因子激活通常可以通过大鼠GR中的LBD实现(Lloydetal.，1994；Aoyama and Chua，1997)。Lloyd等还测试了雌激素受体的LBD，但其对融合的转录因子活性的控制力极低。植物雌激素的存在可能引起组成型诱导(Kurzer and Xu，1997)。该雌激素结合域已经较为成功地用于控制转基因植物中的反式激活子的活性(Zuo等(2000))。
为了检测植物中类固醇受体域介导的重组酶活性的可应用性，本发明构建了RG构建体，其中重组酶催化的编码该酶的基因的去除会导致GUS的表达。PREC、LBD、nos终止子和Rs做为BglII-BamHI片段依次被加入pREC及其衍生物中的BamHI位点。将第二个Rs序列加入重组酶基因上游的BglII位点后，整个由Rs标记的片段被插入pBIN19衍生的载体中的增强CaMV 35S启动子和GUS基因之间，产生pBERL-GUS(图1)。
测试pBERL-GUS
植物细胞中重组酶-LBD的作用由具有根癌土壤杆菌LBA4404携带的pBERL-GUS马铃薯cv的转化产物测定。从已生根的新生枝条中随机选出五系。对未经处理的叶盘和茎组织进行的GUS染色表明，RG2系和RG5系呈一致的GUS强阳性反应，RG1系和RG3系呈GUS染色弱阳性反应，散在叶盘组织中的的细胞有10％至15％被染成蓝色，而最后的RG4系则呈微弱的GUS阳性。呈GUS强阳性的两系不是由于细菌宿主内的重组酶被提前切除造成，而是因为我们无法在20个克隆中检测出此种随机情况(数据未标明)。因此引起GUS染色的提前切除，可能出现在转基因枝条重生的早期阶段。GUS染色的叶盘(RG1和RG3)中出现的蓝点表明在某种程度上这些系中可能发生了提前切除。未经处理的RG1植物的Southern印迹分析显示了一条非常弱的条带，与重组产生的片段相对应(数据未标明)。同样的Southern印迹分析表明RG4中微弱的GUS信号可能是由于该插入片段的多拷贝特性所致。
使用DEX对RG1列中的叶盘处理24小时，可诱导强而一致的GUS染色，表明已表达该重组酶，并且为DEX可诱导的。进一步地，表明该重组酶也对不具有丝分裂活性的细胞起作用。
将来自RG1马铃薯枝条上的单节插条(single-node cutting)，在含有10μM的MS30溶液孵育过夜，并转移至固体MS30中。腋芽生长成枝条，每个枝条都单独进行繁殖，形成亚系。亚系叶块的GUS染色表明几乎所有的植物都是嵌合的，说明重组不完全。从每个亚系和未经处理的RG1系中分离基因组DNA，标记重组引起的基因组改变的性质和程度。图2清楚的表明GUS染色的同时，有一个2.9kbp大小的片段被去除。该点图表明了重组的程度在不同的亚系中不同，正如3.0kbp大小的EcoRI片段所反应的数量。
含有E.coli codA和Tn5nstII基因的双向选择标记物的评估
杂合codA-nptII基因的构建引起两种反应物编码序列的一些改变。在E.coli codA和Tn5nstII基因中，codA基因中第2位点上的丝氨酸换成了丙氨酸，thenptll基因中的N末端的蛋氨酸和异亮氨酸分别突变成甘氨酸和丝氨酸。
栽培品种Bintje的马铃薯茎的外植体由pMCODNPT转化，转化产物以卡那霉素(kanamycin)或潮霉素(hygromycin)作为选择剂。转化产生很多转基因枝条，在卡那霉素和潮霉素培养基中，25％的外植体长出了一个或更多的枝条。这强烈表明产生了杂合基因C末端编码的NPTII并且其具有活性。
转化产生的枝条对卡那霉素的抗性表明很可能已经产生了杂合蛋白N末端。为检测其活性，切下三个单节并转移至含有和不含有5-FC的培养基中，这些单节随机选自两种选择培养基中的五个互相独立系。
表1中的结果明确表明，所有的转基因列对FC均敏感，表示所有十个转基因系均具有胞嘧啶脱氨酶活性，而未经转化的栽培品种Bintje控制的枝条不具该活性。换言之，杂合标记基因的两种成分均有活性。构建用类固醇诱导型重组酶活性以去除选择性标记物的植物转化载体
目前已知重组酶-LBD杂合基因在植物细胞中具有明确的功能，并对其对于消除转化后植物细胞中的选择性标记物的系统的适合性进行了评估。此外，还鉴别出一种可能适合的双重选择性标记物。新的植物转化载体构建体与pBERL-GUS类似，其中许多成分均为检测标记物的去除所需，如LBD、nos终止子、CaMV 35S启动子、CODNPT、nos终止子和一段Rs序列，按顺序将每部分作为一个BgIII-BamHI片段可隆入以pREC开始的BamHI位点，并续接下一个片段的BamHI位点进行组合。第二个Rs序列插入嵌合的重组酶-LBD基因上游的单BglII位点后，将大的BgIII-BamHI插入片段位于pMOG22衍生在体内的增强CaMV 35S启动子和GUS基因之间，该片段包含重组酶-LBD基因和CaMV 35S控制的标记基因(图3)。
因此，导致重组酶-LBD高活性的启动子驱动杂合基因。重组酶活性的诱导会引起以Rs作为侧翼的DNA片段连同每个Rs的一半被去除。结果是，GUS处于CaMV 35S启动子的直接控制下。
检测pRCNG
草莓栽培品种Calypso作为根癌土壤杆菌介导的构建体pRCNG转化的宿主。土壤杆菌感染四周后，125片刚长出枝条的叶块在含有10μM地塞米松(DEX)的液体培养基中孵育过夜，并转移到含有10μM DEX和150μg/mL氟胞嘧啶(FC)的新鲜新生培养板中。接下去的3到4周中，大多数叶块未能长出任何枝条，只得到4个假定不含标记物的转基因枝条，尽管许多枝条在开始孵育时显示出生长的势头。利用可探测uirG、nptII、GUS和稳定重组产物的底物以PCR对标及物的丢失和这些枝条系的转基因性质以及卡那霉素抗性对照系(KmR)进行分析。如果以Rs序列为侧翼的DNA片段被去除，以35S-GUS引物进行的PCR中只能生成一种(小的)产物。
PCR分析揭示了两系、或三系在FC选择中存活下来的枝条是转基因的，其丢失了标记物并包含所需的DNA序列以及CaMV 35S启动子控制的GUS基因。缺少有virG引物的信号表明阳性信号并非cefatoxim抗性的土壤细菌。因此，可以推断已经获得了不含标记物的转基因植物。
植物细胞可以适应哺乳动物糖皮质激素受体的调节机制的这一事实的发现有重要意义。腺病毒E1A产物的糖皮质激素依赖性活性是第一例类固醇受体家族一员的LBD控制的异系调控因子(Picard等，1988)。几年后，这一调控机制被用于植物，将Arabidopsis中的玉米转录因子R与鼠糖皮质激素受体融合，以控制因子R的活性(Lloyd等，1994)。此外，在一种包含酵母转录因子GAL4的DNA结合域的嵌合转录因子，疱疹病毒蛋白VP16的转激活域和大鼠糖皮质激素受体LBD的基础上，出现了一种新的糖皮质激素诱导的植物转录系统(Aoyama等.，1995；Aoyama和Chua，1997)。类固醇受体是直接的信号转导系统，其中激素信号与LBD的结合后产生了一种可以改变特定基因转录速率的激素激活的形式。受体的分离区域负责信号的接收和随后的DNA结合。在没有激素的情形下，LBD抑制受体的转录活性，其与激素结合并决定激素依赖的转录的激活(for review：Pratt，1993)。已知类固醇受体存在于多蛋白胞浆复合物中，包含hsp90，hsp70，p60和其他蛋白，其中一些的储存量足够解释植物中GR在这些功能性多蛋白胞浆复合物中的聚集(Stancato etal.，1996)。最近对于多蛋白胞浆复合物的研究表明其作用可能作为一种监控机器，包含称为折叠体(foldosome)的一种自聚蛋白折叠结构(Hutchison等1994)。由于含有hsp90的监控系统的蛋白含量丰富，以及该系统广泛存在于动物和植物细胞中，该系统被认为在蛋白折叠，功能并可能在胞浆和核内转运中起重要作用。
我们首先利用融合于RG构建体中的大鼠GR LBD的SR1重组酶检测植物中这种类型的R重组酶调节方式(图1)。叶盘的GUS染色表明即使是没有配体DEX，RG的有些衍生转基因系的叶盘也具有大量的小点。这表示出现了低频率自发和提前的Rs丢失，该Rs位于DNA片段的侧翼，LBD的调节能力也比预想的低。另一方面，最早关于配体调控位点特异的重组的文章称大约1％的背景活性，即没有配体时重组酶-LBD融合后显示的活性大约为未经转化的重组酶的活性的1％。如果时间足够长，这种低水平的活性即可解释观察到的染色模式。
Southern印迹法(图2)明确表明植物中也可进行配体调控位点特异的重组，即本发明中的R重组酶和大鼠GR的LBD。该方法还表明经GUS染色叶盘的杂色性质(数据未列出)与两种不同的基因片段的出现之间的关系，这两种片段一种含有重组酶-LBD融合基因而另一种不含。换言之，未经进一步选择的DEX处理的组织有嵌合的倾向，即由混合的组织构成，其中位点特异的重组或发生或不发生。根据已有的知识，这是植物中第一个糖皮质激素调控的重组酶的例子。
前述的通过重组选择性地从一个长片段中去除任意DNA片段的能力的一个主要应用是转基因物质重生后去除其中的选择性标记物。该标记物须插入正向重复的重组位点之间，优选地，与重组酶-LBD基因一起。转基因植物转化并重生后，重组酶活性的诱导会导致重组酶和标记基因的切除，其中一个重组酶位点未经改变，而被转移的DNA的剩余部分则位于侧翼重组位点区域之外。
然而，对RG转移基因的研究表明，即使在最复杂的条件下，如只有单拷贝插入，大部分接收处理的组织仍不能完全转化。换言之，经DEX处理后，不含有标记物的细胞将被保持标记物的细胞包围，或反之，这样就形成了嵌合体组织。阻止生成含有标记物的细胞并获得纯的不含标记物的转基因产物的一个方法是同时使用一种负性标记物，并将其包含于被重组酶去除的片段中。植物中的一些功能性阴性选择标记物据称表现出明显的致死表型(Depicker等1988；Czako and An，1991；Stougaard，1993；Czako和Marton，1994；Dotson etal.，1996)。有趣的是，这些阴性选择性标记物之一——编码胞嘧啶脱氨酶的大肠杆菌基因(codA)——也适用于正向选择标记物，从而导致其双向功能(Wei和Huber，1996)。但是，该系统只能在哺乳动物细胞中起作用，而在植物细胞中却没有作用(未发表的研究)。
动植物中大量的多功能酶表明，在翻译水平上融合常见的阳性和阴性选择标记物的编码区可能是创造一种人工双功能标记基因的简单方法。从而不必为负性标记物单独提供启动子和终止子，但该启动子和终止子与正向选择标记物及其自身控制序列须插入Ac因子中或MAT样转化系统中的重组位点间。至此，我们将新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因与胞嘧啶脱氨酶基因融合(例如来大肠杆菌，但并非必要，优选地为合成的变异体)，并由增强的CaMV 35S启动子控制该杂合基因。优选地，该基因含有杂合标记物，其中nptII基因或功能性片段为N末端酶而非胞嘧啶脱氨酶。
NptII基因过去曾被成功的用于构建杂合基因(Vaeck等1987；Barnes，1990；Datla等，1991)。类似地，过去曾将胞嘧啶脱氨酶作为杂合基因两个组成部分之一，并证明其在植物中表现出对5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine(FC))的敏感性(未发表的研究)。
经pMCODNPT转化的马铃薯产生相等数量的转化子而与使用的选择性抗生素无关，表明两种标记物的作用方式相同，且起作用的nptII基因存在于融合基因中。表2中列出的该结果表明融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶部分仍有活性。
RCNG构建体用于检测重组-LBD介导的标记去除系统中的双功能codA-nptII标记物，这两种基因均存在于以Rs为侧翼的将被从植物细胞中去除的DNA片段。经RG构建体转化的完全GUS阳性转基因产物的存在已经表明转化后在很早阶段就可能提前丢失了Rs侧翼之间的区域。类似地，未经处理的包含RG和RCND的转基因产物也表明了Rs侧翼之间的区域的提前丢失(数据未表明)。这提示即使配体不存在，有时对杂合重组酶的活性的控制也是不充分的。然而，已经在含有卡那霉素的培养基中获得了RCNG转基因产物，提示可能去除了抗生素抗性的提前位点特异性去除，可能只在偶然的情形下发生。另一方面，RCNG转化产物转化后新生培养基中的卡那霉素排除了完全GUS阳性的幼苗出现的可能，这与对经RG构建体转化后的幼苗的观察一致。进一步地，如果不可能同时完全去除所有的拷贝，含有经常出现的多拷贝插入片段的转基因产物就比较强壮。最终，如果植物细胞染色体中标记物的丢失出现在有丝分裂不活跃的细胞中，其危害就会减小，因为随后的闭合环仍能表达标记物并表现抗生素抗性(Ahmad and Golic，1996)。
经RCNG转化后，很早阶段就开始选择不含标记物的草莓，即第一个小枝条出现的时候。经过DEX处理过夜，叶块立刻被转移至含有FC的培养基中。但这并非最佳处理，因为从基因组中切下的附加体闭合环仍然含有一种活跃的双功能标记物，其在FC存在的条件下是有害的，至少是生长抑制性的。更好的办法是推迟转移至含有FC的培养基中，以便发生至少一次，优选为两次或三次细胞分裂。随后，真正不含有标记物的细胞自FC选择培养开始即存活，其也丢失了自染色体中切除的含有标记物的闭合环。然而尽管细胞内部和周围的细胞产生了毒素，一些不含有标记物的细胞至少在开始阶段仍能分裂，并形成不含标记物的FC抗性植物。
PCR分析法用于证实标记物和重组酶的切除。明显地，所检测的大多数被测系不含有标记物。对含有35S和GUS的底物分析证实预测的小片段的存在以及代表nptII基因的片段的缺乏表明不仅发生了重组，而且该重组基本完全。
因此，LBD介导的重组酶活性的抑制一般足以抑制高频率的提前切除，从而使得转基因枝条在选择性条件下重生。更有益的为改良的LBD，其可能进一步降低提前切除的发生频率。如果试验观察到的GUS阳性的位点确实由不能完全控制的高重组酶活性造成，并且高重组酶表达与同一T-DNA上的相邻基因的高表达正相关，就不能排除已经在转化的更早阶段失去了具有最高目的基因表达水平的RCNG转基因物。
如果多重插入发生在同一位点或不同位点，尤其当两种或更多反向T-DNA出现在一个位点时，重组后标记物的去除可以变得非常复杂。后一种情形下，根据重组位点的相互作用，会发生一系列复杂的切除和倒转，其结果完全无法预料。如果两种或更多反向T-DNA以首尾相接的方式出现时，则难以区分重组的最终产物与每个细胞只有一种T-DNA的转基因衍生物。因此，该方法的一个可取之处即其可去除不需要的正向重复的多T-DNA拷贝，而只保留一个拷贝。在不同的两个位点插入单个片段后，不受欢迎的重组结果可能是只去除一种或两种标记物及其伴随的重组酶基因。这种情况可以在例如只有一种或两种重组酶基因活跃以及失活的标记物和重组酶基因通过某种方法逃避切除的情形下发生。
整合于不同位点的T-DNA多重拷贝可引起染色体片段的易位(Qin等1994；van Deursen等1995)。当不同位置上的两种相互作用的重组位点相对于中心粒的方向相同时，易位对双方都有利并可能不受注意。相反，不同位置上的相对于中心粒的方向相反的重组位点发生的重组，由于染色体的丢失，可能有害。当经历过至少一次该方法的转化子再次被同一系统转化时，可以发生易位。极有可能地，包含前次转化留下的重组位点的T-DNA片段很可能位于另一条染色体上，而不是最新的插入片段。因此，在前次转化位置的一个单重组位点和新位置上的一个位点之间可能发生重组。真正发生的可能性与许多因素有关，如两个位置的接近程度、重组酶的浓度和重组酶处理的时间。自发的位点特异性重组很少见于不同的转基因烟草系的子代的杂交中，该转基因烟草系携带位于非同源染色体上的重组位点(Qin等1994)。应用选择性压力后，重组的频率增加。相似地，估计非同源小鼠染色体之间的易位的频率大约为1200至2400个表达Cre重组酶的细胞中有一个(van Deursen等1995)。
降低随后的转化中可能的易位并去除标记物的一个方法是每次转化都使用不同的重组位点(Sauer，1996)。例如loxP，Rs或包含两个或更多个12至13bp的反转重复序列的FRT，这些序列由一个7到8bp的核心分隔，该核即重组酶的结合位点。切割和基因片段的交换出现于核心序列中。非同源核心序列之间的重组则不利。因此，核心序列决定了重组的特异性。具有不同突变核心区域的不同重组位点不能与野生型位点结合，但可以互相结合。然而，并非所有可能的位点都能够进行自组(Hoessetal.，1986)。例如，loxP核中的中心TpA双核苷酸的突变破坏了重组，当核中的A+T含量降低过多时，多位点突变对于FRT位点的重组有害。
在上述的试验中，未根据处理时间，DEX浓度或被处理组织的性质将DEX的处理最优化。处理时间的长短可影响重组的效率，如果对组织处理的时间不够长，就会形成嵌合体组织。此外，嵌合体还可能由于切下的DNA重新整合到基因组中形成。由于再整合的双分子性质，其概率可能小于单分子切除。在更晚的阶段，切除的单分子可能消散至核中，并且不大可能被基因组重新捕获。在转基因小鼠中，这种附加体环DNA片段在静止细胞中丢失的速率大约是每月丢失50％(Rohlmann等，1996)。细胞分裂后，如果切下的分子和重组酶在细胞分裂中保留下来，位点特异性再整合可能出现在一个或两个子代细胞中。综上所述，再整合可能受到DEX处理时间的影响这一观点可疑。
当然，DEX的浓度是另一个影响对处理有反应的组织中的细胞比例的另一因素。到目前为止，已发表的有关植物中DEX的试验其诱导糖皮质激素介导的转录的浓度范围在0.1至30μM之间。然而，存在于液体培养基中的幼苗生长培养基的DEX和作为喷剂喷洒到叶盘上的DEX的应用情况很大差别。甚至可以通过给土壤浇水的方式将DEX提供给植物(Simon等1996)。所有这些都表明，植物可吸收DEX并与组织的性质无关。
位点特异的重组似乎不需要分裂活跃的细胞，尽管这样的组织被用于本发明中的马铃薯腋芽和草莓calli的试验中。分别涉及Cre和FLP重组酶的小鼠和果蝇试验表明，重组在主要由静息细胞构成的组织中是可实现的(Kuhn等1995；Ahmad和Golic，1996)。实际上，对来自含有DEX的液体培养基中的马铃薯RG和RCNG转基因产物的生长充分的叶盘进行过夜处理，就足以在第二天实现强的GUS染色。其实该方法也可用来筛选重组力强的转基因列。
在MAT系统中，提前产生的重组酶活性降低了转化的频率，而低的并且失控的重组酶活性只能相对较慢的产生不含标记物的转化产物(Ebinuma等1996)。相反，所述的系统提供了控制重组酶活性和明确选择不含标记物的转基因产物的方法。改良的阴性标记物和降低的重组酶背景活性还可以提高该系统的效率。最后，本发明可以促进一种普遍的去除植物(和细菌)中来自转基因植物的选择性标记物系统的发展，该转基因植物允许在同样的准则下进行多个循环的转化和标记物的去除。构建利用LMB诱导型重组酶活性去除选择性标记物的植物转化载体原料和方法
构建体
pMRECNESG。来自编码HsfA2的番茄(Lycopersicon peruuianum)基因的核输出信号(NES)由如下方法获得：将浓度均为20pmol的反应物5-GTGACAGATCTGTTGTGAAAACACCTGAATGGGGTGAGGAATTACAAGACCTT-3′和5GTGACGGATCCTCAAAGGAAACCAAGTTGATCTACAAGGTCTTGTAATTCCTC-3′在标准Pfu DNA聚合酶缓冲液中混合，其终浓度为25微升中含有0.5单位Pfu。反应条件为：94℃下反应30秒，45℃下15秒，72℃下15秒，进行10个循环。反应产物由Qiaquick(QIAGEN GmbH)提取物纯化，并重新溶于10mM Tris-HCl(pH 8.5)中。将该片段作为BglII-BamHI插入BamHI消化的pREC中，使其在翻译水平上与合成R重组酶的C末端融合。经PCR找到方向正确的NES并由pRECNES标记。Nos终止子以pNOSt为模板经PCR使用如下引物获得：5′-GTGACAGATCTCGAATTTCCCCGATCGT-3′和5′-CCAGTGGATCCCCGATCTAG-TAACATAG-3′。方向正确的nos终止子经PCR鉴定并由pRECNES.标记。控制杂合CODNPT标记物所需的CaMV 35S启动子由BglII-BamHI自p35S中切下，并克隆入pRECNESnos中的nos末端下游的BamHI位点。再次应用PCR鉴定所需定向的插入片段。类似地，含有来自pCODNPT的CODNPT基因并包括5′UTR的BglII-BamHI片段被插入CaMV 35S启动子下游的BamHI位点，该5′UTR由AMV翻译增强子和一段植物内含子序列组成。再次利用来自pNOSt的BglII-BamHI消化的nos终止子片段，将其插入标记基因下游的BamHI位点。两个重组位点作为从pTOPORs中分离出来的BglII-BamHI片段中被插入，一个被插入重组酶-LBD基因上游的BgIII位点，另一个被插入nos终止子下游的BamHI位点。对两个位点进行测序检查其定向。将包含重组酶和以Rs序列为侧翼的标记物基因的大BglII-BamHI片段插入pMOG-EGUSn中的BamHI位点，形成pMRECNESG载体。
结果
控制重组酶作用的另一种方法是将其控制在胞浆内，直到需要其活性为止。为了提供这种可诱导的胞浆-胞核转移，将马铃薯核输出信号(NES)与合成R重组酶融合。该NES结构域与核蛋白的融合可使生成的杂合蛋白定位于哺乳动物CHO细胞和烟草叶肉细胞原生质体中(Heerklotz等2001)。Heerklotz还证实了加入潮霉素B(LMB)可逆转该效应，LMB是一种依赖核输出子1的输出途径的抑制物(Kudo etal.，1999)。近来，一种功能性CRM1/输出子1同系物从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定出来，其表现出对LMB的敏感性(Haasen等，1999)。
检测pMRECNESG
草莓栽培品种Calypso被用于根癌土壤杆菌介导的pMRECNESG构建体的转化。使用含有pMRECNESG的根癌土壤杆菌感染一个月后，200片最先长出小枝条的叶块在含有20ng/mL潮霉素B(LMB)的液体培养基中孵5小时，转移至新鲜再生培养板，并添加150μg/mL氟胞嘧啶(FC)。在随后的几个月中，仅一些叶块产生共10个枝条。利用这些植物基因组DNA的PCR分析确定标记物和重组酶的去除。
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非穷举性标记物列表
应用于转基因植物中的单功能阳性标记物(括号中为选择性试剂)：
□ hpt基因(潮霉素)，
□ npt II基因(卡那霉素)，
□ 枯草杆菌原卟啉原氧化酶基因(复禄芬)，
□ Tn5衍生基因(博来霉素)，
□ als基因(磺脲胺)，
□ pat or bar基因(phosphinothricin)，
□ Aspergillus bsd基因(杀稻瘟菌素)，
□ 小鼠或白色念珠菌dhfr基因(甲氨喋呤)，
□ 磷酸甘露糖异构酶(PMI；可将甘露糖作为碳源生长)
□ 木糖异构酶(可将木糖作为碳源生长)
□ epsps基因(嘉磷塞)odhps基因(磺胺)
□ 细菌腈水解酶基因(溴苯腈)
□ psbA基因(阿特拉津)
□ spt基因(链霉素)
□ 2-DOG-6P磷酸酶(2-脱氧葡萄糖)
应用于转基因植物中的单功能阴性标记物：
□ E.coli胞嘧啶脱氨酶(将5-氟胞嘧啶转化成氟尿嘧啶)
□ 来自自养黄杆菌GJ10的dhlA基因，其编码一种脱卤化作用，可水
解二卤烷如1，2-二氯乙烷(DCE)，形成一种卤化乙醇和一种无机卤化
物
□ HSV-1胸腺嘧啶激酶(更昔洛韦)
□ Barnaseo链球菌细胞色素P450单氧化酶基因(催化一种磺脲胺复合
物R7402脱碱形成细胞毒性磺脲胺)
□ 硝酸还原酶(将氯酸转化为亚氯酸的酶)
□ IaaH或tms2基因(将植物激素前体转化成有活性的植物激素)
□ pehA基因(将抗嘉磷塞甘油酯转化成抗嘉磷塞)
□ ricin(核糖体灭活蛋白)ci白喉毒素A
应用于植物中的双功能标记物：
□ ipto
□ GUS(细胞分裂素葡萄糖醛酸苷结合物，加入培养基中后转化成GUS
阳性细胞中的细胞分裂素，引起ipt过度表达的基因型)
应用于动物中的双功能标记物：
□ HSVtk-hpt融合体
□ HSVtk-npt II融合体
□ HSVtk-bsd融合体