细胞培养生产紫杉醇的方法 本发明涉及一种通过细胞培养而生产紫杉醇的方法，具体讲是以植物细胞培养技术为手段，通过在细胞生物反应器内进行的东北红豆杉大规模细胞培养生产紫杉醇的方法。本发明属于生物制药领域。
紫杉醇(Taxol)作为治疗肿瘤的有效药物之一，其巨大的市场需求与其原料来源的匮乏，使得运用植物细胞大规模培养技术分离提取药用成份紫杉醇的产业化生产研究，成为近些年来新药研究的重要课题之一。自1971年国际上首次出现从红豆杉树皮中分离出紫杉醇至今，由于其天然含量极低，紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的关键所在。为此，除天然提取方法外，化学半合成和全合成研究亦取得进展，而运用植物组织细胞培养技术研究开发紫杉醇一直是现代高技术医药领域研究的核心问题。
与其它化合物不同，紫杉醇及其紫杉烷类化合物是迄今为止仅见于裸子植物红豆杉科(Taxaceae)的红豆杉属(Taxus)中。红豆杉是一种生长极其缓慢的古老木本植物，在我国属一类保护植物，是优良树种之一，同时也是园林绿化及观赏树种。红豆杉属植物在世界上有11种1变种，在我国分布有4种1变种，即西藏红豆杉(Taxus Wallichiana zucc)，云南红豆杉(T.yunnanensis cheng et L.K.Fu)，东北红豆杉(T.cuspidate sieb et zucc，又称日本紫杉，Japanese yew)、红豆杉(T.Chinensis(pilger)Reid)和南方红豆杉(T.Chinensis uar mairei(Lem’ee et ievel)Cheng et L.K.Fu)。树皮提取紫杉醇是唯一商业来源。从干树皮中提取1g紫杉醇需3-6棵60龄大树，而要提取1kg紫杉醇则要砍伐1000-2000棵树。要满足治疗一个患者，则需要1-2g的紫杉醇。现今国际市场对紫杉醇年需求量为500kg，并且这一需求正日益增加。紫杉醇市场需求量大，靠剥取树皮或砍伐树木提取已相当困难。即使将全部天然资源采伐，也只能满足短期临床需要，且会造成对森林和人类自下而上环境及生物多样性不可弥补损失。由于天然树皮中紫杉醇含量极低，约占干重的0.01～0.02％，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的最为关键因素。围绕这一问题，国内外在下述几方面开展了研究工作：化学合成或半合成，天然种植和组织与细胞培养等方面。
化学全合成是另一个获得紫杉醇的途径，但全合成需20-25步，紫杉醇化学合成方法已取得初步成果，年总产率仅4-5％，成本高。
此外，随着10-脱乙酰浆果赤霉素III(BaccatinIII)和15-羟基-10-脱乙酰浆果赤霉素III的发现，为紫杉醇的半合成和在此基础上进行改造生产紫杉醇类似物的研究提供了可能并取得了阶段性成果。由于紫杉醇和半合成前体均需从天然植物中取得，所以天然资源(栽植)和组织培养等研究特别是组织细胞培养研究仍然处于紫杉醇资源研究的核心位置，而后者则是重中之重。
我们经多年的时间，在分析、研究国内外紫杉醇研究成果的基础上，系统地研究了植物组织细胞培养技术应用到东北红豆杉有效药物紫杉醇生产地理论、工艺及可行性，包括从材料选择、外植体诱导、高频细胞株的保存、悬浮培养系的建立到分离、纯化等过程，完成了实验室和中试研究，实现了一个培养周期可收获紫杉醇80.3％mg/L的结果，使下一步产业化具有实际意义并为此提供了可能与保障。
本发明的目的，在于提供一种提高东北红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇的方法，该方法不仅能明显提高东北红豆杉细胞培养液中紫杉醇的含量，而且更有利于达到产业化水平。
本项目经多年研究，依东北红豆杉培养细胞产生紫杉醇的特殊机理首创了采用看护培养和细胞悬浮培养相结合的半连续细胞培养方式，同时在培养液中附加了有机成分，合理组配很好地控制了细胞的生长过程，缩短了缓慢生长期，延长了平稳生长期，进而缩短了培养周期，降低了成本，提高紫杉醇产量。此外，对细胞培养液的预处理采用有机溶剂分段处理法进行萃取、浓缩培养液到最后柱层大大减少了紫杉醇的损失量。
为了实现本发明的目的，本发明的技术路线如下：
将东北红豆杉的外植体进行离体培养，筛选高产细胞株，转入细胞种子培养，尔后进行细胞大规模培养。细胞培养液经过分离，萃取纯化等处理，得到紫杉醇晶体。
具体来说，在MB培养基上进行愈伤组织诱导和高产细胞株的筛选，在1/2MB培养基上进行细胞种子培养和细胞反应器内的大规模细胞培养。特别是，在MB培养基上附加NAA、IAA、KT条件下进行东北红豆杉高产细胞株的筛选，在1/2MB培养基上附加NAA、IAA、KT条件下进行东北红豆杉细胞种子培养和细胞反应器的大规模培养。
在上述基础上的东北红豆杉愈伤组织继代保存20天为一周期，细胞种子培养10天为一继代周期，细胞反应器培养20-25天为一周期。
上述所说的MB培养基组成为：MS培养基大量元素+B5培养基微量元素；1/2MB培养基组成为MS培养基大量元素减半+B5培养基微量元素。
所添加的NAA、IAA、KT用量为：NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L。
上述的培养基中需添加蔗糖1.5-2.5％，并调PH值4.5-7.5。
上述的培养条件为8h/d光照，2000Lx光照强度，温度24℃±1。
培养结束后采用`H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC以及CD谱对紫杉醇平面和立体结构进行测定。
本发明的最佳离体培养条件是：
MB培养基：附加NAA1.Omg/L+IAA 2.5mg/L+KT1.0mg/L+2％糖
本发明的最佳细胞培养条件是：
1/2MB培养基，其它组成同上。
本发明提出的东北红豆杉大规模培养的方法是采用5L气升式细胞反应器(中国科学院生化中心有售)作种子罐，培养10-15天，培养条件为：温度24±1℃-28±1℃，最佳为26±1℃，光照最佳时间为8小时/天，光照强度800-1500LX，最佳为1000LX。以20L气升式细胞反应器作生产罐。培养条件为培养温度为24℃±1，光照8h/d。光照强度2000LX，培养时间20-25天，每隔8-10天进行补加营养，每次添加1/2MB 100-500ml。
本发明的分离和纯化过程如下：
细胞培养液下罐后，经过旋转蒸发，浓缩至1/2-1/4体积，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量为按1∶1体积比加入，每天摇动2-5次，于30℃以下静置20-40小时，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重复5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通过HPLC过柱，获得紫杉醇晶体。
本发明运用植物细胞培养技术分离提取紫杉醇意义十分重大：(1)解决了紫杉醇的原料来源，保护了东北红豆杉自然资源，无任何环境污染；(2)满足日益增长的临床试验和医疗用药，为广大患者提供大量的具显著疗效的新型抗癌药物；(3)紫杉醇生产是在传统的提取及化学合合成和半合成以外的一种运用植物细胞培养技术开发现代中药的一次革命；(4)在生物反应器内生产、调控，从细胞培养液中分离产物，节省了场地、节约了时间、降低了生产成本、提高了产量。最终实现让中国普通老百姓都能享用到运用现代高新技术生产抗癌药物紫杉醇的目的。
与现有技术相比，本发明的技术路线所达到的先进结果分析如下： 本发明 现有技术细胞培养周期 20-25天 25-35天细胞内紫杉醇最大产出量持续时间 5天 2-3天持续时间及平均产出量 16.02mg/L.d 1.8mg/L细胞干重 39.2g/L 16.1g/L紫杉醇含量 0.9％ 0.2％紫杉醇产量 80.3mg/L 24.1mg/L
实施例
以MS培养基大量元素+B5培养基微量元素组成配制MB培养基，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。在此条件下进行东北红豆杉高产细胞株的筛选，将筛选出的高产细胞株在1/2MB培养基上进行细胞种子培养，该1/2MB培养基组成为MS培养基大量元素减半+B5培养基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。将培养的种子在细胞反应器内进行大规模细胞培养。培养基是1/2MB，该1/2MB培养基组成为MS培养基大量元素减半+B5培养基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。还需添加蔗糖1.5-2.5％，并调PH值4.5-7.5。附加NAA、IAA、KT条件下进行东北红豆杉细胞种子培养和细胞反应器的大规模培养。大规模培养的方法是采用5L气升式细胞反应器(中国科学院生化中心有售)作种子罐，培养10-15天，培养条件为：温度24±1℃-28±1℃，最佳为26±1℃，光照最佳时间为8小时/天，光照强度800-1500LX，最佳为1000LX。以20L气升式细胞反应器作生产罐。培养条件为培养温度为24℃±1，光照8h/d。光照强度2000LX，培养时间20-25天，每隔8-10天进行补加营养，每次添加1/2MB 100-500ml。
细胞培养液下罐后，经过旋转蒸发，浓缩至1/2-1/4体积，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量为按1∶1体积比加入，每天摇动2-5次，于30℃以下静置20-40小时，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重复5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通过HPLC过柱，获得紫杉醇晶体。