聚羟基丁酸生成缺陷的鞘氨醇单胞菌属突变型细菌菌株 和澄清鞘氨糖的方法及其组合物 发明背景
【发明领域】
本发明涉及因无效突变而内部贮存聚合物聚羟基丁酸(polyhydroxybutyrate，“PHB”)生成缺陷但生成正常品质的荚膜多糖鞘氨糖(sphingan)的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)突变型细菌菌株。本发明还涉及澄清由PHB生成缺陷的鞘氨醇单胞菌突变菌株生成的鞘氨糖的方法。本发明还涉及包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工业产品。
相关技术的讨论
鞘氨糖是由鞘氨醇单胞菌属的细菌分泌的囊状多肽。鞘氨糖在结构上相关但不相同。鞘氨醇单胞菌属的常见成员及其生成地鞘氨糖包括：生成吉兰糖(gellan，S-60)的多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaselodea)ATCC 31461；生成welan(S-130)的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC 31555；生成rhamsan(S-194)的鞘氨醇单胞菌ATCC 31961；生成diutan(S-657)的鞘氨醇单胞菌ATCC 53159；生成尚未命名的多糖(S-88)的鞘氨醇单胞菌ATCC 31554；生成尚未命名的多糖(S-198)的鞘氨醇单胞菌ATCC 31853；生成尚未命名的多糖(S-7)的鞘氨醇单胞菌ATCC 21423；生成尚未命名的多糖(NW-11)的鞘氨醇单胞菌ATCC 53272；生成alcalan(Biopolymer B-16)的鞘氨醇单胞菌FERM-BP2015(以前称广泛产碱菌(Alcaligenes latus)B-16)；诸如此类。关于鞘氨醇单胞菌及其生成的多糖的描述可以参阅美国专利号4,377,636、4,326,053、4,326,052、和4,385,123(关于ATCC 31461及其S-60多糖)；美国专利号4,342,866(关于ATCC 31555及其S-130)；美国专利号4,401,760(关于ATCC 31961及其S-194)；美国专利号5,175,278(关于ATCC 53159及其S-657)；美国专利号4,331,440和4,535,153(关于ATCC 31554及其S-88)；美国专利号4,529,797(关于ATCC 31853及其S-198)；美国专利号3,960,832(关于ATCC 21423及其S-7)；美国专利号4,874,044(关于ATCC 53272及其NW-11)；美国专利号5,175,279(关于FERM BP-2015及其B-16)(将它们收入本文作为参考)。
鞘氨糖多糖在其主链的一级结构上相关，包含糖D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、和L-鼠李糖(或L-甘露糖)。例如，吉兰糖即S-60的一级结构以2∶1∶1的分子比包含D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、和L-鼠李糖，它们连在一起以如下顺序形成四糖重复单元：葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖。在天然形式中，吉兰糖在相同的葡萄糖残基上受到乙酰基和甘油基取代基的修饰。平均而言，在吉兰糖中，每个四糖重复单元具有一个甘油酸取代基，每两个四糖重复单元具有一个乙酸取代基。另一种鞘氨糖，diutan即S-657的一级结构与吉兰糖不同，其中一个额外的L-鼠李糖二糖侧链附着在一个葡萄糖残基上，由此形成六聚糖重复单元。S-657在另一个葡萄糖残基的位置2和/或6包含乙酰基。
鞘氨糖多糖(也称为糖胶)主要用于使水溶液增稠或凝胶，且通常分成两类：增稠剂和胶凝剂。典型的增稠剂包括淀粉、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素、藻酸、甲基纤维素、黄原胶、刺梧桐树胶、和黄蓍胶。常见的胶凝剂包括吉兰糖、明胶、淀粉、藻酸、果胶、角叉藻聚糖、琼脂、和甲基纤维素。
胶凝剂在多种应用中用于食品工业，包括糖果果冻，果酱、甜点胶冻、糖衣、奶制品、饮料、诸如此类。另外，胶凝剂可以用作微生物培养基的成分。胶凝剂在使用条件和凝胶质地方面是不同的。凝胶的这些区别性特征导致某些胶凝剂在特定产品中(如淀粉在糖果果冻中、明胶在甜点胶冻、琼脂在糖衣中、和藻酸在甘椒条(pimentostrips)中)的独占使用。
尽管某些胶凝剂用于特定产品，然而常规食品配方存在缺点。例如，常用于甜点胶冻配方的明胶来自动物，需要冷却来凝固，且因其在加热后不稳定而应用受到限制。常用于甜点胶冻、糖果、和果酱/果冻配方的角叉藻聚糖、角叉藻聚糖和槐豆胶混合物、果胶通常限于质地脆弱且无弹性的配方，储存稳定性差，且在有些国家(诸如日本)在使用上受到地理限制。常用于糖果配方的淀粉透明度差且香味释放差。因此，希望开发可用于不受常规胶凝剂相关问题困扰的食品配方的胶凝剂。
一种特别有用的胶凝剂是吉兰糖(S-60)，即由细菌多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461生成的荚膜多糖。在商业上，这种糖胶是通过在好气条件下用多沼鞘氨醇单胞菌接种发酵培养基而形成的。发酵培养基包含碳源、磷酸盐、有机和无机氮源、和适当的微量元素。在无菌条件下进行发酵，严格控制通气、搅动、温度、和pH。发酵完成后，在回收糖胶之前，将粘稠的肉汤巴氏灭菌以杀死存活细胞。然而，用于生成吉兰糖的最佳发酵条件还促进内部贮存聚合物聚羟基丁酸(“PHB”)的生成，它妨碍吉兰糖的最终澄清和回收。在发酵过程中，PHB合成和吉兰糖合成竞争可获得的碳源，而且PHB合成与吉兰糖合成进行竞争。
根据由发酵肉汤进行回收的方法，吉兰糖展示不同的特征。由发酵肉汤直接回收而生成的吉兰糖处于天然或高酰基形式，它受到多沼鞘氨醇单胞菌的修饰，在一个葡萄糖残基上具有乙酰基和甘油基取代基。以这种天然或高酰基形式分离的吉兰糖生成柔软、柔韧、有弹性的凝胶。可以通过热碱处理将吉兰糖脱酰基，由此提供低酰基形式的吉兰糖。以这种脱酰基形式分离的吉兰糖生成坚硬、坚固、脆弱的凝胶，这限制了它的商业应用。天然和脱酰基吉兰糖混合物生成中间质地的凝胶。
某些应用需要清澈的吉兰糖。然而，目前只能够澄清脱酰基吉兰糖。在脱酰基过程中，对吉兰糖进行的高温碱处理由吉兰糖除去酰基取代基并裂解多沼鞘氨醇单胞菌细胞。然后通过过滤除去固体和细胞碎片，生成清澈的、非酰基化的吉兰糖。目前还不可能通过过滤来澄清天然或高酰基形式的吉兰糖，因为所要求的高凝固温度(糖胶在冷却后形成凝胶的温度)和有机体的荚膜性质，使得不能流畅的由多沼鞘氨醇单胞菌细胞分离吉兰糖。为了需要天然吉兰糖的应用，可以通过化学或酶学方法裂解多沼鞘氨醇单胞菌细胞；然而终产物中将存在残余PHB，并使得生成的溶液混浊而非清澈。
除了吉兰糖作为胶凝剂的用途，其它鞘氨糖多糖也已找到有用的商业应用。S-657多糖赋予极性溶剂(诸如水)以显著的假塑性，使得S-657能够作为流变学调节剂，从而能够悬浮微粒、减小摩擦、稳定乳剂和泡沫、处置滤饼、和控制过滤。因此，S-657已经找到了工业用途，即作为流变学添加剂用于多种粘结系统，正如美国专利号6,110,271中所公开的(将其收入本文作为参考)。
除了削弱透明度，在鞘氨糖中发现的PHB还影响其糖胶的流变学特性。具体而言，S-657糖胶中的PHB影响多糖在多孔介质流动系统中调节流变学的能力，诸如油田，其中流变学在油井钻井、完成、和维修流体中发挥重要作用。另外，S-657中的PHB残余可能在储库形成过程中引起损害，且可能降低油井的生产力。PHB的存在还限制S-657糖胶在家庭和个人护理产品中的应用性，其中外观对于获得消费者的认可而言是至关重要的。
因此，试图消除鞘氨糖中的PHB生成。减轻鞘氨醇单胞菌种中妨碍PHB生成的问题的一种方法是在菌株中化学诱导随机突变以抑制PHB生成，诸如美国专利号5,300,429中所述，该专利公开了LPG-2，一种抑制PHB生成但仍能够生成吉兰糖的多沼鞘氨醇单胞菌突变菌株。多沼鞘氨醇单胞菌以前称为多沼假单胞菌，且指相同生物体。LPG-2菌株保藏于American Type Culture Collection即美国典型培养物收藏中心，编号ATCC 53967。尽管LPG-2菌株生成吉兰糖，但它的品质是不一致的，可能是由于化学诱变时发生了额外突变。
遗传工程是用于生成PHB生成缺陷的鞘氨醇单胞菌无效突变菌株的更有选择性的诱变方法。遗传工程能够对PHB合成途经中的一种基因进行选择性突变或缺失，继而能够完全抑制PHB生成而不影响糖胶生成的品质。
因此，非常希望开发合成PHB的能力缺陷，同时鞘氨糖生成最大化、因而可减轻要求由鞘氨糖除去PHB的努力的鞘氨醇单胞菌突变菌株。
发明概述
本发明涉及鞘氨醇单胞菌属突变菌株，其中编码参与聚羟基丁酸(“PHB”)合成的蛋白质的至少一种基因受到选择性突变或缺失，使得突变菌株生成鞘氨糖但不生成PHB。
本发明的另一个实施方案致力于由多种鞘氨醇单胞菌物种(即ATCC 31461和53159)的DNA分离的、编码蛋白质PHB合酶的分离DNA序列。
本发明的另一个实施方案致力于制备缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖的方法，包括下列步骤：将鞘氨醇单胞菌属突变菌株发酵，并由发酵肉汤澄清缺乏PHB的鞘氨糖。
本发明的还有一个实施方案致力于制备澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步骤：将鞘氨糖发酵肉汤加热至澄清温度大约30℃-大约70℃，用澄清剂处理鞘氨糖发酵肉汤，然后用酶处理发酵肉汤。
本发明的还有一个实施方案致力于制备澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步骤：将鞘氨糖发酵肉汤加热至澄清温度大约30℃-大约70℃，用螯合剂处理发酵肉汤，用溶菌酶处理发酵肉汤，用苛性或氧化剂处理发酵肉汤，并用蛋白酶处理发酵肉汤。
本发明的另一个实施方案致力于能够制备澄清的、缺乏PHB的、具有高凝胶强度的高酰基(天然)吉兰糖的多沼鞘氨醇单胞菌突变菌株。
本发明的还有一个实施方案致力于包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工业产品。
图的简述
图1描述了来自Rhizobium meliloti即苜蓿根瘤菌(U17227)(SEQID NO：1)、Alcaligenes eutrophus即真养产碱菌(J05003)(SEQID NO：2)、Acinetobacter sp.即不动杆菌菌株RA3849(L37761)(SEQ ID NO：3)、Rhodobacter spaeroides即类球红细菌(L17049)(SEQ ID NO：4)、和Methylobacterium extorquens即扭脱甲基杆菌(L07893)(SEQ ID NO：5)的PHB合酶蛋白质序列，使用LaserGene(Madison，WI)的软件DNA star MegAlign进行比对。选择区域1和2作为具有中等简并性的保守区，并用于提供大约400碱基对(“bp”)的聚合酶链式反应(“PCR”)产物。
图2显示了质粒pEB1中的408bp插入片段的序列(SEQ ID NO：6)。
图3的示意图例示了用于在多沼鞘氨醇单胞菌phaC基因中克隆并构建内部缺失的步骤。
图4描述了phaC区的序列(SEQ ID NO：7)。下划线标注PstI的限制酶位点(CTGCAG)。箭头指示引物结合位点。一部分phaC基因由第一个PstI位点延伸至TGA终止密码子(粗体)。分开描述了突变体中缺失的碱基。XbaI位点(TCTAGA，双下划线)在突变体中替代了缺失区，正如正文中所述。
图5是突变型phaC基因通过同源重组进入多沼鞘氨醇单胞菌染色体并切除整合载体，在染色体中只剩下完整的或突变的phaC基因的示意图。
图6是质粒pLO2的示意图。
图7的示意图演示了包含phaC缺失的载体整合进入多沼鞘氨醇单胞菌染色体。
图8以图表方式显示了通过将来自10升发酵的肉汤样品涂板而测定的细胞计数。
图9显示了经EcoRI消化并与ATCC 53159 phaC基因的探针杂交的鞘氨醇单胞菌基因组DNA制剂的Southern杂交。泳道1和2包含大小标准(分别是λHindIII和λHindIII+EcoRI)。泳道3-6包含分别来自鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 53159、31461、31551、和31961的基因组DNA消化物。
图10是ATCC 53159(SEQ ID NO：13)的phaC基因及侧翼区的DNA序列。下划线标注BamHI(ggatc)、EcoRI(gaattc)、和NotI(gcggccgc)的限制酶位点，双下划线标注交叠引物位点。箭头指示引物位点。粗体突出phaC基因。
图11描述了phaC区的遗传图谱和用于PCR扩增的引物。
图12描述了克隆策略，其中将PCR用于构建只包含phaC侧翼区并去掉整个phaC基因的产物。
图13是氢氧化钾浓度对透光率的影响的示意图。
图14是氢氧化钾浓度对凝胶强度的影响的示意图。
图15是Calgon浓度对透光率的影响的示意图。
图16是Calgon浓度对凝胶强度的影响的示意图。
发明详述
本发明涉及经遗传工程改造、因灭活内部贮存聚合物聚羟基丁酸(“PHB”)合成的无效突变而合成PHB的能力缺陷的鞘氨醇单胞菌属菌株。本发明的缺乏PHB的鞘氨醇单胞菌突变菌株能够合成在商业上有用的鞘氨糖，根据本领域众所周知的比浊法定性测定它不含PHB(见下文实施例4和美国专利号5,300,429,将它们的内容收入本文作为参考)。PHB是在高碳和低氮条件(与生成最佳水平的鞘氨糖的条件相同)下在鞘氨醇单胞菌细胞内积累的贮存聚合物。
已经在许多生物体中研究了PHB合成，而且已经鉴定了PHB合成的至少三种基因(Anderson，A.J.和Dawes，E.A.，Microbiol.Rev.，54：450-472，1990)。PHB以三步衍生自乙酰辅酶A(CoA)。第一步是由3-酮硫解酶(phaA)催化的，导致乙酰乙酰CoA的形成。在第二步中，酶乙酰乙酰CoA还原酶(phaB)将乙酰乙酰CoA转变成β-羟基丁酰CoA。最后，β-羟基丁酰CoA在第三步中由PHB合酶(phaC)聚合而形成PHB。编码参与聚羟基丁酸合成的蛋白质的至少一种基因受到选择性突变或缺失的突变可能导致缺乏PHB的鞘氨醇单胞菌菌株。
例如，本文所述的鞘氨醇单胞菌突变菌株是至少两种突变的结果：(1)编码PHB合酶的phaC基因的整个或部分缺失，这意外的导致鞘氨糖产量的降低；和(2)恢复鞘氨糖产量的自发突变。本发明还提供了任选的预备突变，包括增加鞘氨醇单胞菌突变体摄取质粒DNA的能力的自发突变，即多沼鞘氨醇单胞菌中的S-60wtc突变。
另外，本发明公开了使用螯合剂、苛性或氧化剂、和用于裂解细胞和消化蛋白质的酶来澄清由鞘氨醇单胞菌突变菌株生成的缺乏PHB的吉兰糖和其它鞘氨糖的方法。本发明还公开了包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工业产品。
为了例示本发明的细节，描述了通过遗传工程改造多沼鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇单胞菌ATCC 53159所涉及的步骤，但是，正如下文所述，本发明不限于改造多沼鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇单胞菌ATCC 53159，也不限于编码参与PHB合成的蛋白质的任何特定基因。
使用根据phaC所编码蛋白质的两个保守区设计的简并引物，通过PCR获得多沼鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 31461 phaC基因的内部片段。将该片段的核苷酸序列(显示于图2)用于设计反向PCR引物，从而能够分离phaC基因的更大部分和3’侧翼序列。一般而言，反向PCR技术以天然取向的相反方向克隆目的核苷酸的侧翼区(见图3)。将反向PCR片段排列成它们的天然取向的克隆过程导致232碱基对(“bp”)的缺失。该片段与染色体phaC基因的等位基因交换消除了多沼鞘氨醇单胞菌中的PHB生成。内部232bp缺失意外的会降低吉兰糖产量。
由突变型多沼鞘氨醇单胞菌的大规模培养分离吉兰糖产量得到恢复的自发衍生物。本发明的缺乏PHB的衍生物不含外源DNA、但具有来自天然染色体的232bp缺失、和未表征的自发突变。PDG-1和PDG-3菌株保藏于American Type Culture Collection即美国典型培养物收藏中心，编号分别是ATCC______和ATCC_______。
用于生成用于PHB生产的鞘氨醇单胞菌突变体的具体分子生物学技术(即反向PCR和缺失突变)不是至关重要的。使用常规分子生物学技术来生成鞘氨醇单胞菌突变体属于本领域普通技术人员的知识范围之内。可用于在不同鞘氨醇单胞菌菌株中突变phaC样基因的其它有用的分子生物学技术包括但不限于转座子诱变、点突变、和插入元件突变。
phaC基因只是PHB合成途经中的一个基因；因而有可能通过选择性突变或缺失参与PHB合成途经的其它基因来生成具有期望表型(即PHB生成缺陷)的鞘氨醇单胞菌突变体。可以选择性突变以生成期望表型的目的基因包括但不限于phaA(3-酮硫解酶)和phaB(乙酰乙酰CoA还原酶)。
一旦生成鞘氨醇单胞菌突变体，使它们在称为发酵肉汤的水溶液中生长或发酵，并以荚膜多糖形式向发酵肉汤中分泌鞘氨糖。在使缺乏PHB的鞘氨醇单胞菌突变体发酵之后，可以使用本领域众所周知的技术将肉汤巴氏灭菌并用醇(诸如异丙醇)沉淀鞘氨糖，由此制备鞘氨糖。
优选的是，在发酵之后，可以将鞘氨糖澄清并与悬浮固体和细胞碎片(发酵肉汤环境的一部分)分离以生成缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖。另外，本发明的澄清方法可应用于上文所述缺乏PHB的鞘氨糖以外的任何鞘氨糖菌株。正如本文所述，澄清方法包括将发酵肉汤加热，并用一种或多种螯合剂、一种或多种苛性或氧化剂、或其混合物处理发酵肉汤，随后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶进行处理。
就吉兰糖而言，将PHB生成缺陷的多沼鞘氨醇单胞菌突变体与本发明的澄清方法联合，从而能够生成高酰基形式的澄清吉兰糖。由这种突变体和方法生成的吉兰糖展示高透明度和高凝胶强度，这对于制作甜点胶冻、糖果、饮料、诸如此类是有用的。
在本发明的一个实施方案中(以下称为“第一方案”)，可以通过包括下列步骤的方法来澄清鞘氨糖水溶液：用一种或多种任选的表面活性剂、一种或多种螯合剂、一种或多种苛性或氧化剂、或其混合物处理鞘氨糖溶液，然后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶进行处理。
在本发明的另一个实施方案中(以下称为“第二方案”)，可以通过包括下列步骤的方法来澄清鞘氨糖水溶液：用一种或多种螯合剂处理鞘氨糖溶液，随后用任何溶菌酶，随后是一种或多种苛性或氧化剂、随后是任何蛋白酶或蛋白酶混合物进行处理。
在第一方案中，可以逐步方式进行本发明的方法，其中首先用螯合剂、任选表面活性剂、苛性或氧化剂、或其混合物处理鞘氨糖溶液，然后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶进行处理。在第二方案中，可以进行逐步方法，其中首先用螯合剂处理鞘氨糖溶液，然后是任何溶菌酶，然后是苛性或氧化剂，然后是任何蛋白酶(以此顺序)进行处理。
有利的是，本文所述用于生成澄清的鞘氨糖溶液的方法提供了可以(如果需要)在适当稀释后使用、无需任何进一步的化学或机械处理(除了巴氏灭菌和沉淀)的鞘氨糖溶液。对于有些应用，可以依照常规技术由这些澄清的鞘氨糖肉汤分离鞘氨糖，包括将肉汤巴氏灭菌，将肉汤调至期望pH，并用醇(即异丙醇)沉淀鞘氨糖。
这种鞘氨糖在水中的再水化和溶解提供了基本上清澈的鞘氨糖溶液。依照本发明，基本上清澈的鞘氨糖溶液(1％w/w)具有超过大约60％、优选超过70％、最优选超过80％的透光率。可以使用常规技术和设备(如商品化的分光光度计)在可见光谱的任何波长处测量透光率。通常测量波长大约600nm-大约650nm处的透光率。可以测定几种类型的鞘氨糖溶液的透光率：未处理的肉汤、部分处理的肉汤(如只用螯合剂、苛性或氧化剂、螯合/苛性或螯合/氧化剂混合物处理的肉汤，或者只用溶菌酶和/或蛋白酶处理的肉汤)、处理后的肉汤、或重建的鞘氨糖溶液。本文所述基本上清澈的溶液(具有超过大约60％的透光率)是包含大约1％(质量比)鞘氨糖的水溶液，所述鞘氨糖是由依照本发明的方法处理后的肉汤分离的。
可以使用本发明的方法澄清的鞘氨糖溶液包括包含鞘氨糖的整个发酵肉汤(所述鞘氨糖是通过在营养培养基中发酵生产鞘氨糖的微生物而获得的)、通过向水性介质中加入分离的鞘氨糖而获得的溶液、和部分纯化的鞘氨糖溶液。包含非期望的发酵固体、可用于本发明方法的鞘氨糖水溶液可以包含大约0.01％-大约10％鞘氨糖(相对于溶液总重的质量比)。包含任何已知鞘氨糖的任何水溶液都可用于本发明的实践。
本发明两种澄清方法的第一步包括通过常规技术将鞘氨糖溶液加热至澄清温度，诸如夹套罐中的温度控制、直接蒸气注入、诸如此类。优选直接蒸气注入，以使加热时间缩至最短。澄清温度的范围是大约30℃-大约70℃，优选大约50℃-大约60℃。将鞘氨糖溶液加热至期望温度所需时间可以随着待处理鞘氨糖溶液的大小和体积而显著变化。例如，将小体积(如50ml)鞘氨糖溶液由室温升高至大约60℃可能只需要几分钟，而将40,000升溶液(如分批加工中可能存在)升高相似温度可能需要几小时。
依照本发明的两个方案之一，本发明方法的下一步包括用选自至少一种螯合剂、至少一种苛性或氧化剂、或其混合物的澄清剂处理鞘氨糖水溶液。或者，可以在如上所述将鞘氨糖肉汤加热至澄清温度的同时加入澄清剂。
在第一方案中，下一步是在存在苛性或氧化剂时向鞘氨糖溶液中加入螯合剂。通常，螯合剂和腐蚀/氧化剂的接触时间的范围是每种大约0.5小时-大约2小时，优选螯合剂大约1小时、苛性或氧化剂大约0.5小时-大约1.0小时。通常，向鞘氨糖溶液中加入苛性或氧化剂的浓度范围是大约0g/L-大约2g/L，优选大约0.5g/L-大约1.5g/L。通常，向鞘氨糖溶液中加入螯合剂的浓度范围是大约0百万分之一(“ppm”)-大约3000ppm，优选大约1000ppm-大约2000ppm。
在第一方案的澄清剂处理之后，将鞘氨糖肉汤进行酶处理步骤，其中分开或同时向鞘氨糖溶液中加入溶菌酶和/或蛋白酶。通常，酶接触鞘氨糖肉汤的时间范围是每种至少大约0.5小时-8小时，优选每种至少1小时，最优选每种至少2小时。通常，溶菌酶的浓度范围是大约11,000MCG单位/L-44,000MCG单位/L，优选大约20,000MCG单位/L-25,000MCG单位/L；通常，蛋白酶的浓度范围是大约65,000Delft单位/L-260,000Delft单位/L，优选大约100,000Delft单位/L-150,000Delft单位/L。在用于本申请时，“MCG单位”指pH6.6和37℃时溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)相对于参照标准的裂解速率(正如Genencor International Inc.所述)；相似的，“Delft单位”指涉及样品在由卖主Genencor提供的溶液中的消光比率的具体测定法。
用于酶处理步骤的酶将固体细胞碎片降解成可溶性化合物，从而改进鞘氨糖溶液的透光率并有助于澄清方法。适用于这种方法的蛋白酶可以是来自细菌、真菌、或植物来源的酸性、中性、或碱性蛋白酶。可用于本发明方法的例示性酸性蛋白酶包括但不限于由曲霉属微生物(诸如黑曲霉)生成的蛋白酶。可用于本发明方法的中性蛋白酶包括但不限于由芽孢杆菌属微生物诸如解淀粉芽孢杆菌生成的蛋白酶。可用于本发明方法的碱性蛋白酶包括但不限于由芽孢杆菌属微生物诸如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、和短小芽孢杆菌生成的蛋白酶，由链霉菌属物种诸如弗氏链霉菌、灰色链霉菌、和直丝链霉菌生成的蛋白酶，由枯草杆菌蛋白酶诸如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg获得的蛋白酶，包括蛋白酶诸如枯草杆菌肽酶A和枯草杆菌肽酶B。适用于该方法的溶菌酶包括购自Genencor International Inc.(Rochester，纽约)的Multifect溶菌酶或可以由植物、动物、或微生物衍生来源获得的任何溶菌酶。可用于本发明的任何蛋白酶或溶菌酶的来源不是至关重要的。这些酶及获得它们的方法在本领域是众所周知的。
正如上文第一方案所述，可以同时或分开加入酶处理(用溶菌酶和/或蛋白酶进行的处理)所包括的酶。同时处理指以任意顺序向鞘氨糖溶液中加入蛋白酶和溶菌酶并度过任意时间，条件是处理过程中鞘氨糖溶液中存在这两种酶。当同时加入时，在溶菌酶和蛋白酶都有活性并提供期望酶功能的条件下进行本发明的酶处理方法。可以在温度大约30℃-大约70℃、pH大约5-大约9(优选大约6-大约8)进行这个实施方案的同时酶处理方法。虽然这个实施方案的具体温度和pH范围可以随着所用的酶而变化，但是在这种同时实施方案中，在相对温和的温度和近中性的条件下进行本发明的方法，使得溶菌酶和蛋白酶(酸性、中性、或碱性)都将展示可接受水平的活性以澄清鞘氨糖溶液。
优选的是，如下进行酶处理，即向鞘氨糖溶液中分开加入任何溶菌酶和/或蛋白酶。最优选的是，分别在其最佳pH条件(对于溶菌酶为酸性至中性pH范围即pH范围大约3-大约7.5，对于蛋白酶为中性至碱性pH范围即pH范围大约6.5-大约9)下向sphigan溶液中加入每一种酶。不同溶菌酶和蛋白酶展示最佳澄清活性的温度和pH范围可能不同。另外，若必须在用于酶处理的溶菌酶或蛋白酶之间做出选择，则优选的是酶处理包括一种或多种蛋白酶。
在第二方案中，螯合步骤之后是任何溶菌酶的酶处理，随后是一种或多种苛性或氧化剂的处理，随后是任何蛋白酶的酶处理。如上所示，酶处理可以是溶菌酶与蛋白酶处理。这种可变顺序使得任何溶菌酶能够在其优选的中性至酸性pH条件下发挥作用，并使得任何蛋白酶能够在其优选的中性至碱性pH条件下发挥作用。可以将上文第一方案所述的相同溶菌酶和蛋白酶，和螯合剂、表面活性剂、和苛性或氧化剂用于实践第二方案。
不必搅动鞘氨糖溶液，当然，方便时可以温和的或间歇的搅动鞘氨糖溶液，以避免固体沉降和促进酶的接触。
适用于本发明方法的螯合剂是能够通过与多价金属离子形成多配位基复合物、与金属离子形成沉淀、或吸附金属离子而螯合鞘氨糖溶液中的多价金属离子(如Mg2+、Ca2+、等)的化合物或组合物。优选的是，螯合剂是可溶于水或水-醇的化合物或组合物，而且是有机和/或无机酸的碱金属或碱土金属盐或者碱性(含胺)有机化合物的有机/无机酸盐，以及有机和/或无机酸或碱性化合物自身。可用于本发明方法的其它螯合剂是阳离子交换树脂和碳酸和碳酸盐。在本发明方法中特别有用的盐化合物和组合物包括乙二胺四乙酸、磷酸、偏磷酸、碳酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、谷氨酸、焦磷酸、多磷酸、偏磷酸、葡糖二酸、乙二醇二(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、乙二胺、2，3-二氨基丁烷、1，2-二氨基环己烷、三氨基三乙胺、诸如此类的盐。适当的，有用的盐可以包括上述酸的单、二、三、和/或四金属盐和上述碱的单、二、或三酸盐。优选的是，用于本发明方法的螯合剂包括乙二胺四乙酸、柠檬酸、磷酸、焦磷酸、多磷酸、碳酸、焦磷酸、和乙二胺的盐。有用螯合剂的范例包括但不限于乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸单钠、磷酸单钾、磷酸二钠、磷酸二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、阳离子交换树脂、乙二胺二氢氯酸、乙二胺二醋酸、乙二胺锂盐、乙二胺二氢碘酸、诸如此类。更优选的是，将六偏磷酸钠用作螯合剂。
正如上文实施方案所述，表面活性剂可以任选的与苛性、氧化、和螯合剂联合使用，从而进一步改进最终吉兰糖产品的透光率。适用于本发明方法的表面活性剂是能够在存在亲水和疏水物质(固体或液体)时形成水乳浊液的化合物或组合物。优选的是，表面活性剂可溶于水或水-醇的化合物或组合物。有用表面活性剂的范例包括但不限于SDS、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80，ICI Americas Inc.，Bridgewater，NJ)、卵磷脂、单甘油酯、酒石酸单甘油酯、磷酸化单甘油酯(如单钠盐)、乳酰化单甘油酯、乙酰化单甘油酯、琥珀酰化单甘油酯、乙氧基化单甘油酯、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(polysorbate)、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酸钠、丙二醇酯、诸如此类。
在螯合剂、苛性或氧化剂处理过程中的任何时间向鞘氨糖肉汤中加入任选的表面活性剂，接触时间的范围是每种大约0.5小时-大约8小时，优选大约2小时。通常，向鞘氨糖溶液中加入表面活性剂的浓度范围是大约0.0g/L-大约3.0g/L，优选大约0.1g/L-大约1.0g/L。通常，向鞘氨糖溶液中加入表面活性剂的浓度范围是大约0百万分之一(“ppm”)-大约3000ppm，优选大约300ppm-大约1000ppm。
适用于本发明方法的苛性剂包括但不限于氢氧化钾、氢氧化钠、磷酸三钠、诸如此类。氢氧化钾是优选的苛性剂。或者，可以使用氧化剂来代替苛性剂。可用于本发明澄清方法的氧化剂包括次氯酸钠或其它次氯酸盐、二氧化氯(chloride dioxide)、过氧化氢、过乙酸、臭氧、和本领域众所周知的其它氧化剂。在本发明中，优选的氧化剂是次氯酸钠。
应当注意，通过用螯合剂、表面活性剂、苛性或氧化剂、或其混合物处理鞘氨糖溶液而实现的澄清程度可能影响完成后继酶处理所需要的酶浓度或时间。例如，增加用于这种方法的螯合剂、表面活性剂、苛性或氧化剂、或其混合物的量可以降低实现澄清鞘氨糖溶液所需要的酶量和/或时间。为了获得鞘氨糖溶液，优选调整和平衡螯合剂、表面活性剂、苛性或氧化剂、或其混合物的浓度和处理时间和/或溶菌酶和/或蛋白酶的浓度和处理时间，以优化本文所述缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖的生产。
本文所述缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖可用于多种食品或工业应用。例如，缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖诸如天然(高酰基)吉兰糖可用于改进食品产品诸如甜点胶冻、糖果、果酱和果冻、饮料、薄膜、糖衣、诸如此类的味道、质地、稳定性、和外观。作为额外的范例，缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖诸如S-657可以更有效的作为流变学调节剂用于工业应用诸如油田钻井或粘结系统。本发明的其它缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖还将在食品产品和工业中更大范围的应用。
下列实施例提供了本发明的例示，而不应当误解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：生成多沼鞘氨醇单胞菌phaC片段
为了鉴定PHB合酶基因的高度保守区，由National Center forBiotechnology Information即国家生物技术信息中心(“NCBI”)的基因库检索来自不同生物体的PHB合酶序列。选择并研究来自苜蓿根瘤菌(gb：U17227)(SEQ ID NO：1)、类球红细菌(gb：L17049)(SEQ ID NO：4)、扭脱甲基杆菌(gb：07893)(SEQ ID NO：5)、真氧产碱菌(gb：J05003)(SEQ ID NO：2)、和不动杆菌菌株RA3849(gb：L37761)(SEQ ID NO：3)的序列。比对选定PHB合酶基因的蛋白质序列，正如图1所示。在保守区中，根据其位置和相对较低的简并性，选择区域1(苜蓿根瘤菌第411-417位密码子)和区域2(苜蓿根瘤菌第535-541位密码子)来提供大约408bp的PCR产物。
根据保守蛋白质序列和多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461的表观密码子偏爱，设计简并PCR引物来扩增区域1与区域2之间的序列。密码子偏爱是由来自多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461的外多糖(exopolysaccharide)生物合成酶编码区域(由Luis Ielpi博士测序，未发表)的五种基因和来自密切相关的鞘氨醇单胞菌ATCC 31554(它生成S-88糖胶)(Yamazaki等人，J.Bacteriol.，178：2676-2687，1996)的完整外多糖生物合成酶基因簇的密码子使用率推断的。
称为PHADG5(SEQ ID NO：9)的N端引物包含5’-AGTT夹子区、TCTAGAXbaI位点、和靶向区域1的TTC GAY CTS CTS TAY TGG AAY3’简并杂交区。称为PHADG7(SEQ ID NO：10)的C端引物包含5’-GTAT夹子、ACTAGTSpeI位点、和靶向区域2的CCA III SGG CCA CCA GCT GCC简并区。在SEQ ID NO：10中，“I”指次黄苷，一种与任何其它碱基(即A、C、T、或G)相容的核苷酸。
将引物PHADG5(SEQ ID NO：9)和PHADG7(SEQ ID NO：10)用于以来自非粘液样菌株Gps31的染色体DNA为模板的PCR反应。Gps31是不生成吉兰糖的S-60突变体。Taq聚合酶与Taq Start抗体(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA)为PCR提供了热启动，在100μl反应体系中包含2.5mM每种dNTP、4mM MgCl2、和50pmol每种引物。温度程序是：96℃5min；30个循环的96℃1min、58℃1min、72℃1min；再72℃5min，然后通过冷却至4℃来终止反应。PCR反应导致位于预期416bp大小(408bp+夹子)的单一条带。XbaI和SpeI消化后，将片段克隆到经XbaI消化、小牛肠碱性磷酸酶(“CIAP”)处理的pUC19载体中，以生成质粒pEB1。来自两条链的408bp插入片段的DNA序列(SEQID NO：6)显示于图2。该片段包含EcoRI、KpnI、和PvuII的限制性位点。翻译后的克隆片段与其它PHB合酶蛋白质的比对证明已经克隆了PHB合酶。
实施例2：通过反向PCR构建phaC缺失
将Southern杂交用于确定将提供鞘氨醇单胞菌S-60 phaC基因较大片段的适当限制酶，它仍未大得易于通过反向PCR回收。依照QIAGEN(巴伦西亚，加利福尼亚)DNA纯化试剂盒描述的方法，由Gps31分离染色体DNA。使用由克隆到pEB1中的408bp插入片段(SEQ ID NO：6)生成的探针进行的Southern分析证明，在多沼鞘氨醇单胞菌DNA的PstI消化物中，408bp phaC片段(SEQ ID NO：6)位于大约2kb的片段上。
将408bp鞘氨醇单胞菌S-60 phaC片段的序列(SEQ ID NO：6)用于选择向外读码的PCR引物，正如图2所示。引物PHAC12(SEQ ID NO：11)读向phaC所编码蛋白质的N末端，具有夹子5’-GTTC、XbaI位点TCTAGA、和杂交区GGC GCG ATC AGC TTG TTG TC3’。引物PHAC11(SEQID NO：12)读向phaC所编码蛋白质的C末端，具有夹子5’-GTTC、XbaI位点TCTAGA、和杂交区GAG TCG CTC GAA TCC TTT GTC3’。用PstI消化多沼鞘氨醇单胞菌染色体DNA，并在200μl体积中连接0.5μg DNA以进行环化。将用于生成线性DNA分子的KpnI消化物作为模板用于反向PCR反应，以生成408bp phaC片段(SEQ ID NO：6)侧翼区的1.7kb片段，正如图3所示。
1.7kb片段包含在它们的PstI末端以相对于天然取向的相反反向连接的两个侧翼区。PstI位点处的切割指示侧翼区具有相似大小，为850bp和980bp。为了将片段改回天然取向并同时生成缺失最初408bp克隆的大部分的片段，用XbaI消化1.7kb片段，在稀释条件下自身连接以进行环化，然后用PstI消化。将生成的片段克隆到经PstI消化、CIAP处理的pUC19中，称为pEB4。
实施例3：phaC克隆的测序
将pEB4中的1.7kb插入片段测序，并联合408bp片段(SEQ ID NO：6)的序列。合并的1920bp DNA序列(SEQ ID NO：7)描述于图4。该序列的一部分，即由PstI位点至TGA终止密码子(第1-1200位碱基)，编码与其它phaC基因羧基端2/3同源的蛋白质(SEQ ID NO：8)。序列比对确认克隆了正确基因。
该phaC克隆在408bp片段中具有232bp缺失和对应于XbaI位点的6bp即TCTAGA插入。这一缺失和插入引起了改变羧基末端的移码突变，并在第1102位碱基对处导入新的终止密码子。
实施例4：构建整合载体并通过同源重组转移至鞘氨醇单胞菌
为将phaC缺失突变转移至多沼鞘氨醇单胞菌中，使用能够在适用于质粒构建的宿主(例如大肠杆菌)中复制但不能在鞘氨醇单胞菌中复制的“自杀”载体。在鞘氨醇单胞菌中对由质粒表面的抗生素抗性进行选择，鉴定了那些质粒通过同源重组整合到染色体中的菌落。正如图5所示，对抗生素抗性丧失的选择鉴定了那些重复区被重组掉而可能导致突变(即缺失)或野生型基因的保留的菌落。可以通过表型表达(PHB合成)来测定具有缺失的克隆与具有野生型DNA的克隆之间的差异。为了测量PHB的表型表达，使用定性比浊法：将一些肉汤(大约1ml)加到9倍体积的Clorox(Clorox公司，Oakland，CA)中，并于37℃保温至少4小时或过夜。白色沉淀的出现指示存在PHB。
为了便于检测第二交换重组事件，将阳性选择系统修改用于多沼鞘氨醇单胞菌。可以将枯草芽孢杆菌基因sacB(编码果聚糖蔗糖酶)转移到革兰氏阴性细菌中(Kamoun，S.等人，Mol.Microbiol.，6：809-816，1985)。在蔗糖中培养这些细菌可以促进果聚糖的合成，而果聚糖对细菌是有毒的。因此，若载体上存在sacB基因，则可以将蔗糖培养用于鉴定那些丧失了载体的分离菌。
由Cereon，Monsanto的Steven Slater处获得pLO2质粒。正如图6所示，pLO2质粒在具有卡那霉素抗性、ColE1复制起点、和RP4转移起点的载体上包含sacB基因(Lenz，O.等人，J.Bacteriol.，176：4385-4393，1994)。pLO2质粒可用于通过天然接合过程来转移基因。该质粒能够在大肠杆菌中复制，但是不能在鞘氨醇单胞菌中复制；且包含用于带动质粒转移的位点，但是不含转移功能。即pLO2质粒是可带动的，但不可自身传递。在第二种质粒上提供用于接合转移功能的基因，并以反式发挥作用。虽然此实施例使用pLO2质粒，但是它的使用不是至关重要的。本领域普通技术人员将知道如何设计和改造合适的其它质粒，并使用常规技术(诸如电穿孔、转化、诸如此类)将它转移到鞘氨醇单胞菌中。相似的，使用卡那霉素作为选择标记不是至关重要的。本领域普通技术人员将知道如何选择适当的其它选择标记。
将包含phaC缺失的1.7kb PstI片段连接到经PstI消化的pLO2中，称为pLO2-phaC或pEB11，并通过使用电穿孔的转化而转移到大肠杆菌YMC9(F-ΔlacU169 thi endA hsdR)中。纯化大肠杆菌菌株，并与多沼鞘氨醇单胞菌菌株S-60wtc及携带质粒pRK2013的大肠杆菌菌株JZ279混和，后者提供了接合转移的功能(Ditta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：7347-7351，1980)。S-60wtc是菌株多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461的衍生物，它是作为摄取质粒DNA的能力增加的自发分离菌而选择的。使用稳定期(过夜)培养物进行接合转移，即1ml YMC9/pLO2-phaCΔ、1ml JZ279/pRK2013、和2-3ml多沼鞘氨醇单胞菌。混和培养物并在滤器上浓缩，继而置于TYE培养皿(8g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和5g/L氯化钠)上，并于37℃保温7小时。然后将细胞悬于去离子水并置于选择培养基上。保温大约7小时后，在添加25μg/ml链霉素(为了反选择大肠杆菌)和7.5μg/ml卡那霉素(为了选择质粒)的YM培养基(3g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、5g/L蛋白胨、和10g/L葡萄糖)上选择S-60wtc的卡那霉素抗性转接合子。根据卡那霉素抗性衡量，整合的发生频率是1.5×10-6。
实施例5：选择第二交换缺失菌株
纯化两个卡那霉素抗性整合体，并在非选择性YEME培养基(0.25％酵母提取物、0.025％麦芽提取物)中传代三次，然后涂布在7.5％蔗糖上以选择交换体。获得了七个卡那霉素敏感性交换体，但都是PHB阳性的。将PCR测试用于确认载体phaC插入了染色体的phaC区和确定插入片段相对于野生型phaC基因的位置。设计了与缺失侧翼区和载体末端同源的引物。正如图7所示，重组可以两种取向进行，分别导致：(1)在载体的左边具有缺失、右边是phaC基因片段的phaC基因，这将生成PHB阴性克隆；或(2)载体的左边是完整的phaC基因、右边是phaC，这将生成PHB阳性克隆。
对六个pLO2phaC单一交换整合体的测试证明都是第二种、可能偏爱的、PHB阳性的取向。可能强烈偏爱在缺失的一侧发生重组，或者PHB阳性菌株生长得比PHB阴性重组体好。质粒以较不优选方式即第一种、PHB阴性的取向进行整合的菌落或许更可能在优选位点进行第二重组事件，导致保留突变表型的双重交换。
通过PCR筛选转接合子，并测试PHB表达，以鉴定处于第一种或PHB阴性取向的转化体。在测试的24个菌落中，PCR结果证明21个是PHB阳性整合体，3个是PHB阴性整合体。PHB测试证实了这些结果。选择这3个PHB阴性菌株(3、15、和22)，纯化，在非选择性条件下培养三代，并涂布在蔗糖上。在来自每个亲本的五个卡那霉素敏感菌落中，一个是PHB阴性的。由此，分离得到三个缺乏PHB的、卡那霉素敏感的突变体，称为NPG-1、NPG-2、和NPG-3。
实施例6：表征突变体的吉兰糖生物合成
通过在14L发酵罐中进行10L发酵来测试NPG-1、NPG-2、和NPG-3，并与LPG-2进行比较，LPG-2是通过化学诱变分离得到的缺乏PHB型突变体(美国专利号5,300,429)。发酵阶段和所用培养基与美国专利号5,300,429所述相似，只是将第二阶段培养基用于所有种子阶段。在接种最终培养基之前使用三个种子阶段。转移体积是2.5-5％。使用不同的有机氮(Quest Nzamine EKC，芝加哥，伊利诺斯州，0.41g/L)代替promosoy(0.5g/L)。种子阶段中的玉米浆水平是3％而非3.75％。最终10L发酵与种子培养基相似，但是包含较少的磷酸盐(0.5g/LK2HPO4)，而且根据需要通过添加KOH来控制pH。有机氮(1.1g/L)和无机氮NaNO3(1.5g/L)均更高。添加消泡剂H-60-K至0.6ml/L。玉米浆水平是3.85％。在去离子水中配制最终阶段的培养基，并添加钙和镁。
正如表1所示，根据总沉淀物(“TPM”)和粘度，NPG突变体生成的吉兰糖显著少于LPG-2。肉汤浓度是在Brookfield粘度计中用4号轴以60rpm测定的。总沉淀物是通过将肉汤在高压锅中加热10分钟、然后用2倍体积的异丙醇沉淀并干燥来测定的。这些结果具有可重复性。对发酵过程中肉汤样品的分析指示生成了大量的有机酸。因此，NPG突变体的吉兰糖低产量与在缺乏PHB合成时大量的碳水化合物水解成二碳和三碳中间物和二氧化碳有关。 表1：NPG菌株的10升发酵数据的概述 菌株 ％LPG-2(TPM) 粘度(cP) LPG-2 7,000 NPG-1 40 1,450 NPG-2 45 2,200 NPG-3 61 2,150
实施例7：分离恢复了吉兰糖生产力的突变体
因PHB合成的阻断而积累的代谢中间物(如有机酸)可能对吉兰糖合成具有不利影响。预计在促进吉兰糖合成的培养基中的培养过程中，能够发生补偿突变，使得吉兰糖合成达到正常水平。涂布来自10L发酵(实施例6)的一些发酵肉汤以测定细胞计数(图8)。观察到，在发酵快要结束时(即44和69小时)，大约0.5％-2％的菌落比NPG更大且更粘。纯化这些菌落，并在摇瓶发酵中测试PHB和吉兰糖生成。新的分离菌是缺乏PHB的，且吉兰糖产量高于最初的NPG突变体。最佳补偿突变体的总可沉淀物与LPG-2可比，且≥野生型的80％(预计TPM降低大约10-15％，可能是由于PHB质量的丧失所致)。将这些菌株称为PDG突变体：PDG-1衍生自NPG-1，而PDG-3衍生自NPG-3。在摇瓶发酵中评价每种菌株的PHB和吉兰糖生成。
表2、实验1：缺乏PHB菌株的摇瓶发酵 菌株 TPM(g/100ml) ％S60 ％LPG2 PHB S60-wtc 1.52 + LPG-2 1.42 93 - NPG-1 0.72 47 50 - PDG-1 1.44 94 102 - NPG-3 0.51 34 36 - PDG-3 1.37 90 96 -
另外，使用Brookfield粘度计用4号轴以60rpm测定第二批S60-wtc、LPG-2、PDG-1、和PDG-3的肉汤粘度。下文表3显示了肉汤粘度。 表3、实验2：缺乏PHB菌株的肉汤浓度 菌株 粘度(cPa×103) S60-wtc 84 LPG-2 92 PDG-1 83 PDG-3 63
用于摇瓶的培养基与美国专利号5,300,429所示相似。第一种子包含YM培养基。第二和最终阶段是每个500ml摇瓶装有100ml先前所述培养基，只是用于缓冲的磷酸盐更高(K2HPO4是2.8g/L；KH2PO4是1.2g/L)且有机氮是1.0g/L。
不限于理论，新的突变可以是限制葡萄糖降解成有机酸的自发突变体。对来自发酵罐的循环内样品的分析指示，PDG-1和PDG-3的有机酸生成与对照菌株S-60wtc和LPG-2大致相同。
菌株PDG-1一致性地生成大量的高粘度吉兰糖，且TPM＞14g/L。
评价这些培养物在平板上的菌落形态以检查菌株的稳定性，特别是比较自发PDG-1突变体与具有低吉兰糖产量的原始NPG菌株。在YM琼脂上于大约37℃培养大约60小时后，PDG-1显示与其亲本NPG-1显著不同的形态。在来自PDG-1发酵的肉汤中没有观察到具有NPG-1型形态的菌落，指示菌株的稳定性。
实施例8：多沼鞘氨醇单胞菌以外的鞘氨醇单胞菌菌株中同源phaC基因的存在
在多沼鞘氨醇单胞菌以外的鞘氨醇单胞菌菌株中鉴定到phaC的同源基因，由此证明在多沼鞘氨醇单胞菌以外的鞘氨醇单胞菌菌株中生成缺乏PHB突变体的可行性。
对四种鞘氨醇单胞菌菌株进行Southern DNA杂交：生成diutan(S-657)的ATCC 53159；生成welan(S-130)的ATCC 31555；生成rhamsan(S-194)的ATCC 31961；和生成吉兰糖(S-60)的ATCC 31461作为对照。由每种菌株分离基因组DNA，并用酶EcoRI进行消化。将消化后的基因组DNA样品(1μg)在1％琼脂糖凝胶上分开，并使用Schleicher和Schuell Turboblotter(Keene，New Hampshire)在中性条件下通过毛细作用转移至尼龙膜。
使用简并引物PHADG5和PHADG7(见实施例1)，通过鞘氨醇单胞菌S-657phaC基因内部区域的PCR扩增，用洋地黄毒苷-11-dUTP依照制造商的方案(Roche Molecular Biochemicals，瑞士)制备洋地黄毒苷标记的探针。使用来自Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的DigEasyHyb依照制造商的方案在中性条件下进行杂交。于44℃(比计算得到的T最佳低10℃)对滤膜进行杂交。预计这些条件将导致超过90％同一的DNA分子发生杂交(Birren，B.等人编，《Genomic Analysis，A Laboratory Manual》即基因组分析，实验室手册，1997)。在用于本文时，术语T最佳定义为Tm-20，其中Tm是由公式“50+0.41(％GC)-600/探针长度”定义的，其中％GC是65％，探针长度是400个核苷酸。将滤膜在2×SSC、0.1％SDS中于44℃清洗两次15分钟，并使用抗洋地黄毒苷-碱性磷酸酶缀合物和洋地黄毒苷检测试剂盒依照制造商的方案(Roche Molecualr Biochemicals)进行显色。
图9显示了杂交结果。在鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 31461中检测到具有预期大小(2.6kb)的EcoRI消化条带。鞘氨醇单胞菌菌株ATCC 53159和ATCC 31961生成具有完全相同大小的条带。鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31555包含与phaC探针杂交的2.4kb片段。因而，Southern DNA杂交确认了这三种菌株包含phaC样基因，而且能够依照本文所述方法生成缺乏PHB菌株。
实施例9：构建具有phaC缺失的ATCC 53159突变菌株
使用重组DNA技术，构建完成缺失phaC基因的鞘氨醇单胞菌ATCC53159突变菌株。如下进行突变菌株的构建：通过PCR扩增phaC基因的侧翼DNA区，并克隆到自杀载体中，通过接合将包含侧翼PCR产物的自杀载体转移到ATCC 53159细胞中，然后通过对卡那霉素抗性(由载体编码)的选择来实现整个质粒在鞘氨醇单胞菌ATCC 53159染色体中紧挨phaC上游或下游的同源基因座处的整合。由染色体切除phaC基因座和载体DNA是通过载体上编码的蔗糖敏感性来选择的后继第二交换事件的结果。
为了分离包含phaC基因和侧翼区的克隆，制备基因组DNA文库，并使用PHADG5和PHADG7引物(见上文实施例1)通过PCR进行筛选。构建了两个基因组文库，一个是在载体pZERO-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)中插入NotI限制酶片段，第二个是在pLAFR3(Staskawicz等人，J.Bacteriol.，169：5789-5794，1987)中插入Sau3A部分消化片段。由每个文库分离一个阳性克隆。亚克隆来自这些质粒的BamHI-NotI片段，并对适当片段测序以测定phaC基因和5’和3’侧翼区的DNA序列。质粒p21-7和pJCS104-2分别包含phaC基因的5’和3’端和侧翼区。
图10显示了phaC基因和侧翼区的DNA序列。图11显示了遗传图谱。开放读码框是通过存在的起始和终止密码子以及联合了使用来自GeneMark的Borodovsky分析(Lasergene GeneQuest模块)和P_aeruginosa_3.mat矩阵预测的编码区的BLAST分析而确定的。序列是由克隆p21-7和pJCS104-2中的插入片段序列连接得到的。两种序列之间的接合位于NotI位点。
图12描述了如何将PCR用于生成只包含phaC侧翼区、缺失了整个phaC基因(1737bp，由起始密码子的第一个核苷酸至终止密码子的最后一个核苷酸)的产物pJCS105 112-1。将两种外部引物(引物1Xba和引物4Xba)与跨越phaC上游和下游区之间的期望接合的引物(交叠1)组合使用。表4显示了引物序列。 表4：用于ATCC 53159 phaC缺失的引物序列引物核苷酸(5’_3’)(下划线指示限制酶位点)引物结合位点添加的限制性位点引物1XbaATTCTAGAGATGATGAAGCCGAAGGTGTGGAT(SEQ ID NO：14)phaC上游537bp XbaI引物4XbaATTCTAGATGGTGCGCTCGTTGAGG(SEQ ID NO：15)phaC上游512bp XbaI交叠1GAAATTCTGCCTCTTTGTCGGTCCTCTCCTTCGC(SEQ ID NO：16)跨越phaC基因开放读码框 无
依照制造商的方案，将质粒pJCS104-2和p21-7(每种200ng)与引物1Xba和4Xba(每种50pmol)、交叠1引物(2pmol)、dNTP、和来自Clontech Laboratories公司(Palo Alto，CA)的Advantage HighFidelity 2 PCR kit即高级高保真2PCR试剂盒中的Taq聚合酶混和。然后在Matrix热循环仪中进行扩增：95℃1min；5个循环的95℃30sec、44℃30sec、68℃2min；20个循环的95℃30sec、53-68℃30sec、68℃2min；68℃3min。由凝胶纯化扩增的DNA片段，并用相同引物再次扩增以生成更多产物。扩增条件是：95℃1min；25个循环的95℃30sec、64℃30sec、68℃2min；68℃3min。然后使用SNAP凝胶纯化试剂盒(Invitrogen)由凝胶分离1.1kb条带，并使用拓扑异构酶、具有3’T突出端的载体、和化学感受态TOP10细胞依照Invitrogen的方案克隆到载体pCRII-TOPO(Invitrogen)中，以生成pJC105-112-1，正如图12所示。
凝胶纯化来自pJCS105-112-1的包含phaC缺失构建物的1.1kbXbaI片段，并克隆到经XbaI消化的pLO2中。回收两种取向的插入片段，称为pJCS106-5和pJC106-16。
将标记交换用于构建ATCC 53159的缺乏PHB菌株。如上文实施例4所述，通过转接合将质粒pJCS106-5和pJC106-16导入ATCC 53159。如上文实施例4和5所述，进行对第一和第二交换缺失菌株的选择，即首先选择由卡那霉素抗性显示的整合，然后涂布在蔗糖上以选择对卡那霉素敏感的交换体。通过诊断PCR检测得到缺失交换体(相对野生型)，称为NPD-3(衍生自pJCS106-5)和NPD-6(衍生自pJCS106-16)。
生成的NPD-3和NPD-6菌株具有精确的phaC染色体缺失而不剩余外源DNA。然而，这些缺失菌株的糖胶产量得到极大降低，但是随后在发酵培养后分离得到恢复糖胶产量的抑制基因。
在促进S-657合成的条件下培养NPD-3和NPD-6，并选择具有大型、粘液样菌落的抑制基因菌株，正如上文实施例7对吉兰糖合成所进行的。根据衍生它们的菌落将这些大型、粘液样菌落称为PDD-3和PDD-6，并分析PHB和S-657生成。PDD-3和PDD-6菌株保藏于American TypeCulture Collection即美国典型培养物收藏中心，编号分别是ATCC______和ATCC_______。下文表5指示了PDD-6提供比其祖先NPD-6菌株高的糖胶产量，同时定性的看不生成PHB。 表5：S-657缺乏PHB菌株的发酵结果 菌株 TPM(g/L) ％S-657 PHB S-657 20.7 + NPD-6 5.6 27 - PDD-6 18.7 90 -
实施例10：氢氧化钾浓度对透光率和凝胶强度的影响
在包括上文概述为第一方案的步骤的澄清方法中评价苛性剂氢氧化钾(“KOH”)浓度的影响。将包含缺乏PHB突变体的吉兰糖发酵肉汤预处理，并与不同浓度的KOH混和15分钟，随后是作为螯合剂的1000ppm Calgon达1小时，随后依次是22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小时。测试的KOH浓度在大约0.0g/L与大约0.45g/L之间变化。正如图13所示，当KOH浓度增加至0.45g/L时，透光率增加了近20％(31％相对增加)。
TA-TX2Texture Analyzer(Texture Technologies公司，Scarsdale，NY)以两种指数即用压力感觉柱塞使制备的凝胶表面的破裂所需要的打孔力度和距离的乘积来测量凝胶强度数据。在测压元件检测到凝胶编码的破裂时测量打孔力度，且以高度变化的百分比来测量打孔力度。正如图14所示，在测试的相同KOH范围，凝胶强度就打孔力度而言降低了280g或32％，这可能要归功于吉兰糖的部分脱酰基。然而，凝胶强度就距离百分比而言似乎没有受到显著影响，只反映1.5％的变化。
依照第一方案澄清方法进行2×2小因子研究。将包含缺乏PHB突变体的吉兰糖发酵肉汤预处理，并与不同浓度的KOH混和15分钟，随后是作为螯合剂的2000ppm Calgon达1小时，随后是依次22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小时。在此研究中研究透光率百分比、打孔力度、和距离百分比，因为认为它们与动力学相关。KOH浓度在大约0.225g/L与大约0.45g/L之间变化，且温度在大约55℃与大约60℃之间变化，而得到下表(显示透光率百分比、打孔力度、和距离百分比结果)显示的结果，以评价KOH浓度和温度对吉兰糖透明度的影响。 表3温度[KOH]0.225g/L[KOH]0.45g/L ％透光率55℃78.0577.960℃80.984.2 打孔力度55℃75356260℃600428 距离55℃89.287.260℃90.788.2
如表中所示，在分别增加KOH浓度或温度后，透光率变化不大。然而，当KOH浓度和温度都增加时，透光率增加了大约6％，这指示这两个参数对实现透光率增加是至关重要的且叠加的。相似的，凝胶强度也显示叠加效应。在分别增加温度或KOH浓度后，打孔力度降低了大约130g-大约190g；然而，在温度和KOH浓度都增加时，打孔力度降低了大约326g，从而说明凝胶强度易受温度和KOH浓度二者变化的影响。
实施例11：六偏磷酸钠对吉兰糖特性的影响
依照上文实施例10描述的澄清方法，评价六偏磷酸钠(“SHMP”，也称为Calgon)对透光率、打孔力度、和距离百分比的影响。将包含缺乏PHB突变体的吉兰糖发酵肉汤预处理，并与0.45g/L KOH混和15分钟，随后是不同浓度的Calgon达1小时，随后是依次22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小时。SHMP浓度在大约1000ppm与大约3000ppm之间变化，而且正如图15所示，在此范围内，SHMP浓度与透光率之间存在线性关联。SHMP增加大约1000ppm导致透光率增加大约5％。如图16所示，SHMP似乎不影响凝胶强度，因为在测试范围内，打孔力度和距离百分比相对不受SHMP浓度增加的影响。
实施例12：SHMP的其它澄清顺序
在2升规模在天然吉兰糖肉汤上进行澄清方法的两种变通形式。依照制造商Genencor International公司(Rochester，纽约)提供的信息，Multifect溶菌酶在酸性-中性pH水平是稳定的，而且能够在碱性pH在短时间内灭活。在依照澄清方法加入0.45g/L KOH后，pH通常超过pH8，这对于溶菌酶并不是最佳的，而蛋白酶据说在这些条件下发挥很好。因而，依照第二方案修改澄清方法，在溶菌酶处理后添加KOH(顺序概述：溶菌酶，然后KOH，然后蛋白酶)。无论是在溶菌酶处理之前或之后添加KOH，都观察到5.5％的相对标准误差(“RSD”)，正如下表所示。 表5 方案；[SHMP] 透光率(％) 力度(g) 距离(％) N 平均值 RSD 第一方案； 2000ppm SHMP 82.38 5.50 436.85 0.28 87.84 0.02 4 平均值 RSD 第二方案； 2000ppm SHMP 81.34 5.40 **** **** 6 平均值 RSD 第二方案； 1500ppm SHMP 83.83 7.10 **** **** 3
****指未测量数据
RSD指相对于平均值百分比的相对标准误差
实施例13：糖果配方
此实施例演示了可用于生成展示极好透明度和稳定性的弹性耐嚼糖果的配方。成分 百分比部分A 葡萄糖浆 45.00 水 21.67部分B 蔗糖 30.00 澄清的高酰基吉兰糖 1.33 Kelcogel F吉兰糖 (CP Kelco U.S.公司，圣迭哥，加州) 0.67部分C 柠檬酸溶液，54％ 0.67 柠檬酸钠溶液，33％ 0.67
在加热容器中混和包含部分A的成分并加热至40℃。
在干燥状态下混和部分B的成分，倒到加热容器中快速混和，并加热至沸腾。将混合物降至72％固体。混和部分C的成分，加入调味剂和颜料，并混和至均质。
将材料置于容器中并填充到预制的淀粉模具中。然后将填满的淀粉模具保存于30℃和35％相对湿度达3-4天，直至固体水平达到大约82％-85％。将材料脱模，上蜡，并保存于密封袋中。
可以向部分A成分中加入额外的水以便于完成亲水胶体的水合。
实施例14：甜点胶冻配方
此配方可用于生成具有极好透明度和稳定性的弹性甜点胶冻。成分 百分比部分A 蔗糖 13.20 己二酸 0.40 澄清的高酰基吉兰糖 0.16 柠檬酸钠 0.13 磷酸二钠 0.13 富马酸 0.11 Kelcogel F吉兰糖 (CP Kelco U.S.公司，圣迭哥，加州) 0.04部分B 水 85.83
以干燥状态混合干燥的调味剂和颜料以及部分A的成分，散布到部分B中并混匀；加热至90℃。然后将混合物倒到合适的容器中，并使之于室温凝固。
实施例15：果冻配方
此配方提供了具有极好透明度、保存稳定性、味道释放、和涂抹能力的果冻。成分 百分比部分A Concord葡萄汁 45.69 高果糖玉米浆 30.46 水 22.85部分B 澄清的高酰基吉兰糖 0.18 柠檬酸钠 0.10 SHMP 0.10 山梨酸钾 0.09部分C 柠檬酸，50％溶液 0.53
混和部分A的成分。在干燥状态混和部分B的成分，并在混和时分散到部分A的成分中。在混和时将生成的混合物加热至沸腾，并在沸腾状态下保持大约1分钟-大约3分钟，此时将部分C的成分搅拌到混合物中。然后将混合物倒到灭菌后的容器中并封口。
上文已经通过目前认为的优选实施方案描述了本发明，应当理解本发明不限于上文所述。相反，本发明意欲覆盖包括在所附权利要求的精神和范围之内的各种修改和等同安排。
序列表
<110>Bower，Stan
Burke，Ellen
Harding，Nancy E.
Patel，Yamini N.
Schneider，J.Carrie
Meissner，Dagmar
Morrison，Neil
Bezanson，Ralph
<120>聚羟基丁酸生成缺陷的鞘氨醇单胞菌属突变型细菌菌株
和澄清鞘氨糖的方法及其组合物
<130>2047.144
<140>
<141>
<150>60/186,433
<151>2000-03-02
<160>16
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>577
<212>PRT
<213>苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)
<400>1
Met Ala Arg Ala Ala Glu Gln Leu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Trp Leu
1 5 10 15
Ala Pro Arg Glu Ala Gly Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ala Glu Pro Val
20 25 30
Ser Asp Met Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Ser Glu Tyr Trp Leu Ser
35 40 45
Asp Pro Arg Arg Thr Leu Glu Ala Gln Thr His Leu Leu Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Asp Met Trp Ser Arg Thr Leu Gln Arg Met Ala Ala Asp Ala Val
65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Asn Leu Gln His Asn Asp Lys Arg Phe Ala Asp Glu
85 90 95
Asp Trp Val Lys Asn Pro Phe Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ala Tyr Phe
100 105 110
Val Thr Ser Asp Trp Ala Glu Arg Met Val Lys Asp Ala Glu Gly Leu
115 120 125
Asp Asp His Thr Arg His Lys Ala Ala Phe Tyr Val Arg Gln Ile Ala
130 135 140
Ser Ala Leu Ser Pro Thr Asn Phe Ile Thr Thr Asn Pro Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Arg Glu Thr Val Ala Ser Ser Gly Ala Asn Leu Val Lys Gly Met Gln
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Met Leu Ala Glu Asp Ile Ala Ala Gly Arg Gly Glu Leu Arg Leu Arg
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Gln Thr Asp Thr Ser Lys Phe Ala Ile Gly Glu Asn Ile Ala Ile Thr
195 200 205
Pro Gly Lys Val Ile Ala Gln Asn Asp Val Cys Gln Val Leu Gln Tyr
210 215 220
Glu Ala Ser Thr Glu Thr Val Leu Lys Arg Pro Leu Leu Ile Cys Pro
225 230 235 240
Pro Trp Ile Asn Lys Phe Tyr Val Leu Asp Leu Asn Pro Glu Lys Ser
245 250 255
Phe Ile Lys Trp Ala Val Asp Gln Gly Gln Thr Val Phe Val Ile Ser
260 265 270
Trp Val Asn Pro Asp Glu Arg His Ala Ser Lys Asp Trp Glu Ala Tyr
275 280 285
Ala Arg Glu Gly Ile Gly Phe Ala Leu Asp Ile Ile Glu Gln Ala Thr
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Gly Glu Arg Glu Val Asn Ser Ile Gly Tyr Cys Val Gly Gly Thr Leu
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Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu His Ala Ala Glu Gly Asp Glu Arg Ile
325 330 335
Arg Ser Ala Thr Leu Phe Thr Thr Gln Val Asp Phe Thr His Ala Gly
340 345 350
Asp Leu Lys Val Phe Val Asp Asp Asp Gln Ile Arg His Leu Glu Ala
355 360 365
Asn Met Ser Ala Thr Gly Tyr Leu Glu Gly Ser Lys Met Ala Ser Ala
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Asn Tyr Leu Lys Gly Gln Asp Pro Leu Pro Phe Asp Leu Leu Tyr Trp
405 410 415
Asn Ser Asp Ser Thr Arg Met Pro Ala Ala Asn His Ser Phe Tyr Leu
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Arg Asn Cys Tyr Leu Glu Asn Arg Leu Ser Arg Gly Glu Met Met Leu
435 440 445
Ala Gly Arg Arg Val Ser Leu Gly Asp Val Lys Ile Pro Ile Tyr Asn
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Leu Ala Thr Lys Glu Asp His Ile Ala Pro Ala Lys Ser Val Phe Leu
465 470 475 480
Gly Ser Ser Ser Phe Gly Gly Lys Val Thr Phe Val Leu Ser Gly Ser
485 490 495
Gly His Ile Ala Gly Val Val Asn Pro Pro Ala Arg Ser Lys Tyr Gln
500 505 510
Tyr Trp Thr Gly Gly Ala Pro Lys Gly Asp Ile Glu Thr Trp Met Gly
515 520 525
Lys Ala Lys Glu Thr Ala Gly Ser Trp Trp Pro His Trp Gln Gly Trp
530 535 540
Val Glu Arg Leu Asp Lys Arg Arg Val Pro Ala Arg Lys Ala Gly Gly
545 550 555 560
Pro Leu Asn Ser Ile Glu Glu Ala Pro Gly Ser Tyr Val Arg Val Arg
565 570 575
Ala
<210>2
<211>589
<212>PRT
<213>真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)
<400>2
Met Ala Thr Gly Lys Gly Ala Ala Ala Ser Thr Gln Glu Gly Lys Ser
1 5 10 15
Gln Pro Phe Lys Val Thr Pro Gly Pro Phe Asp Pro Ala Thr Trp Leu
20 25 30
Glu Trp Ser Arg Gln Trp Gln Gly Thr Glu Gly Asn Gly His Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Gly Ile Pro Gly Leu Asp Ala Leu Ala Gly Val Lys Ile Ala
50 55 60
Pro Ala Gln Leu Gly Asp Ile Gln Gln Arg Tyr Met Lys Asp Phe Ser
65 70 75 80
Ala Leu Trp Gln Ala Met Ala Glu Gly Lys Ala Glu Ala Thr Gly Pro
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Leu His Asp Arg Arg Phe Ala Gly Asp Ala Trp Arg Thr Asn Leu Pro
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Glu Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Asp Ala Lys Thr Arg Gln Arg Ile
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Arg Phe Ala Ile Ser Gln Trp Val Asp Ala Met Ser Pro Ala Asn phe
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Gly Gly Thr Ile Val Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly
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<210>3
<211>590
<212>PRT
<213>不动杆菌(Acinetobacter sp.)
菌株RA3849
<400>3
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1 5 10 15
Ser Val His Asp Asp Ile Trp Lys Lys Leu Gln Glu Phe Tyr Tyr Gly
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Gln Ser Pro Ile Asn Glu Ala Leu Ala Gln Leu Asn Lys Glu Asp Met
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Ser Leu Phe Phe Glu Ala Leu Ser Lys Asn Pro Ala Arg Met Met Glu
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Ile Glu Ala Ala Pro Gly Arg Tyr Val Leu Val Asn Leu Phe
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<210>4
<211>601
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>4
Met Ala Thr Glu Glu Gln Ser Pro Gly Ser Gly Arg Asp Ala Gln Phe
1 5 10 15
Glu Arg Leu Asn Ala Asn Leu Thr Arg Ile Asp Glu Leu Ser Lys Arg
20 25 30
Leu Thr Ala Ala Leu Thr Lys Arg Lys Leu Ser Asp Pro Ala Leu His
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50 55 60
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Arg Gln Ile Val Asp Leu Phe Ser Pro Thr Asn Phe Phe Gly Thr Asn
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Pro Asp Ala Leu Glu Arg Ala Ile Ala Thr Asp Gly Glu Ser Leu Val
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Asn Leu Val Arg Asp Ile Glu Ala Asn Asn Gly Asp
195 200 205
Leu Leu Val Thr Leu Ala Asp Pro Glu Ala Phe Gln Val Gly Gln Asn
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Leu Ile Gln Tyr Lys Pro Thr Thr Glu Thr Val His Glu Thr Pro Leu
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Leu Ile Phe Pro Pro Trp Ile Asn Lys Phe Tyr Ile Leu Asp Leu Lys
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Asp Pro Ser Val Arg Ser Ala Thr Phe Phe Thr Thr Leu Thr Asp Phe
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Ser Asp Pro Gly Glu Val Gly Val Phe Leu Asn Asp Asp Phe Val Asp
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Gly Ile Glu Arg Gln Val Ala Val Asp Gly Ile Leu Asp Lys Thr Phe
385 390 395 400
Met Ser Arg Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Ser Asn Asp Leu Ile Tyr Gln
405 410 415
Pro Ala Ile Lys Ser Tyr Met Met Gly Glu Ala Pro Pro Ala Phe Asp
420 425 430
Leu Leu Tyr Trp Asn Gly Asp Gly Thr Asn Leu Pro Ala Gln Met Ala
435 440 445
Val Glu Tyr Leu Arg Gly Leu Cys Gln Gln Asp Arg Leu Ala Gly Gly
450 455 460
Thr Phe Pro Val Leu Gly Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Val Thr Leu
465 470 475 480
Pro Val Cys Ala Ile Ala Cys Glu Thr Asp His Ile Ala Pro Trp Lys
485 490 495
Ser Ser Phe Asn Gly Phe Arg Gln Phe Gly Ser Thr Asp Lys Thr Phe
500 505 510
Ile Leu Ser Gln Ser Gly His Val Ala Gly Ile Val Asn Pro Pro Ser
515 520 525
Arg Asn Lys Tyr Gly His Tyr Thr Asn Glu Gly Pro Ala Gly Thr Pro
530 535 540
Glu Ser Phe Arg Glu Gly Ala Glu Phe His Ala Gly Ser Trp Trp Pro
545 550 555 560
Arg Trp Gly Ala Trp Leu Ala Glu Arg Ser Gly Lys Gln Val Pro Ala
565 570 575
Arg Gln Pro Gly Asp Ser Lys His Pro Glu Leu Ala Pro Ala Pro Gly
580 585 590
Ser Tyr Val Ala Ala Val Gly Gly Ala
595 600
<210>5
<211>605
<212>PRT
<213>扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)
<400>5
Met Gly Thr Glu Arg Thr Asn Pro Ala Ala Pro Asp Phe Glu Thr Ile
1 5 10 15
Ala Arg Asn Ala Asn Gln Leu Ala Glu Val Phe Arg Gln Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Ser Leu Lys Pro Phe Glu Pro Ala Gly Gln Gly Ala Leu Leu Pro
35 40 45
Gly Ala Asn Leu Gln Gly Ala Ser Glu Ile Asp Glu Met Thr Arg Thr
50 55 60
Leu Thr Arg Val Ala Glu Thr Trp Leu Lys Asp Pro Glu Lys Ala Leu
65 70 75 80
Gln Ala Gln Thr Lys Leu Gly Gln Ser Phe Ala Ala Leu Trp Ala Ser
85 90 95
Thr Leu Thr Arg Met Gln Gly Ala Val Thr Glu Pro Val Val Gln Pro
100 105 110
Pro Pro Thr Asp Lys Arg Phe Ala His Ala Asp Trp Ser Ala Asn Pro
115 120 125
Val Phe Asp Leu Ile Lys Gln Ser Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Ala
130 135 140
Glu Glu Met Val Glu Thr Ala Glu Gly Ile Asp Glu His Thr Arg His
145 150 155 160
Lys Ala Glu Phe Tyr Leu Arg Gln Leu Leu Ser Ala Tyr Ser Pro Ser
165 170 175
Asn Phe Val Met Thr Asn Pro Glu Leu Leu Arg Gln Thr Leu Glu Glu
180 185 190
Gly Gly Ala Asn Leu Met Arg Gly Met Lys Met Leu Gln Glu Asp Leu
195 200 205
Glu Ala Gly Gly Gly Gln Leu Arg Val Arg Gln Thr Asp Leu Ser Ala
210 215 220
Phe Thr Phe Gly Lys Asp Val Ala Val Thr Pro Gly Glu Val Ile Phe
225 230 235 240
Arg Asn Asp Leu Met Glu Leu Ile Gln Tyr Ala Pro Thr Thr Glu Thr
245 250 255
Val Leu Lys Arg Pro Leu Leu Ile Val Pro Pro Trp Ile Asn Lys Phe
260 265 270
Tyr Ile Leu Asp Leu Asn Pro Gln Lys Ser Leu Ile Gly Trp Met Val
275 280 285
Ser Gln Gly Ile Thr Val Phe Val Ile Ser Trp Val Asn Pro Asp Glu
290 295 300
Arg His Arg Asp Lys Asp Phe Glu Ser Tyr Met Arg Glu Gly Ile Glu
305 310 315 320
Thr Ala Ile Asp Met Ile Gly Val Ala Thr Gly Glu Thr Asp Val Ala
325 330 335
Ala Ala Gly Tyr Cys Val Gly Gly Thr Leu Leu Ala Val Thr Leu Ala
340 345 350
Tyr Gln Ala Ala Thr Gly Asn Arg Arg Ile Lys Ser Ala Thr Phe Leu
355 360 365
Thr Thr Gln Val Asp Phe Thr His Ala Gly Asp Leu Lys Val Phe Ala
370 375 380
Asp Glu Gly Gln Ile Lys Ala Ile Glu Glu Arg Met Ala Glu His Gly
385 390 395 400
Tyr Leu Glu Gly Ala Arg Met Ala Asn Ala Phe Asn Met Leu Arg Pro
405 410 415
Asn Asp Leu Ile Trp Ser Tyr Val Val Asn Asn Tyr Val Arg Gly Lys
420 425 430
Ala Pro Ala Ala Phe Asp Leu Leu Tyr Trp Asn Ala Asp Ala Thr Arg
435 440 445
Met Pro Ala Ala Asn His Ser Phe Tyr Leu Arg Asn Cys Tyr Leu Asn
450 455 460
Asn Thr Leu Ala Lys Gly Gln Met Val Leu Gly Asn Val Arg Leu Asp
465 470 475 480
Leu Lys Lys Val Lys Val Pro Val Phe Asn Leu Ala Thr Arg Glu Asp
485 490 495
His Ile Ala Pro Ala Leu Ser Val Phe Glu Gly Ser Ala Lys Phe Gly
500 505 510
Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Gly Ser Gly His Ile Ala Gly Val
515 520 525
Val Ala Pro Pro Gly Pro Lys Ala Lys Tyr Gly Phe Arg Thr Gly Gly
530 535 540
Pro Ala Arg Gly Arg Phe Glu Asp Trp Val Ala Ala Ala Thr Glu His
545 550 555 560
Pro Gly Ser Trp Trp Pro Tyr Trp Tyr Lys Trp Leu Glu Glu Gln Ala
565 570 575
Pro Glu Arg Val Pro Ala Arg Ile Pro Gly Thr Gly Ala Leu Pro Ser
580 585 590
Leu Ala Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Val Arg Met Lys Ala
595 600 605
<210>6
<211>408
<212>DNA
<213>多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)
<400>6
tctagattcg atctcctcta ctggaattcg gacgtcacca acctgccggc gacctggcac 60
ctcagctacc tgaccgacct ctaccgcgac aacaagctga tcgcgcccgg cgcgctcagc 120
atcggcggta ccccgatcga cctgtcgaag gtagaaacgc cgtcctatat ccaggccggg 180
cgcgaagatc acatcgcacc gccccgcagc gtctggaaga tgacggagca tttccgcggg 240
ccgcacaagt tcgtgctggc cggttccggc catatcgccg gcgtaatcaa tccgccttcg 300
gcaaagaaat accaatactg gaccaatgcc gggccggccg agtcgctcga atcctttgtc 360
gaaaacgcga cggaacatgc cggcagctgg tggcccccct ggactaga 408
<210>7
<211>1925
<212>DNA
<213>多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)
<400>7
ctgcaggaca tggccaaggg ccagatgacg cagaccgccg ccggcgcgtt cgagctcggc 60
cgcaacctgg cgatgacgcc gggcaaggtg gtgaagcgca cgccgctgta cgaactgatc 120
cagtattcgc cgacgacgga cacggtgctg gaaacgccgc tgatcatctt cccgccctgg 180
atcaaccgct tctacattct cgacctgacg ccggagaaga gcttcatccg ctgggcggtg 240
gcgcagggga tcaccgtgtt cgtcgtgtcg tggcgctcgg ccgatgcgag catgaaggac 300
gtggtgtggg acgattatgt cgagcgcggc cagatcgacg cgatcgacac cgtgcgcgag 360
ctgctcggcg tggaaagcgt ccacacgatc ggctattgcg tggcgggcac cacgctggcg 420
gcgacgctgg cggtgctcgc ggcgcgcggg gaggcggcga aggtggcgag cgcgaccttc 480
ttcaccgccc aggtcgactt caccgaggcg ggcgacctgc gcgtgttcgt cgacgacgac 540
cagctggcga tgatccgcag cctcggcgcc gacgggttcc tcgacgggcg ctacatggcg 600
gcgacgttca acctgctgcg cgggcgcgac ctgatctgga actacgtcac caacaactat 660
ctgatggggc aggaatatgc gccgttcgac ctgctccact ggaactcgga cgtcaccaac 720
ctgccggcgr cctggcacct cagctacctg accgacctct accgcgacaa caagctgatc 780
gcgcctctag acggcgcgct cagcatcggc ggtaccccga tcgacctgtc gaaggtagaa 840
acgccgtcct atatccaggc cgggcgcgaa gatcacatcg caccgccccg cagcgtctgg 900
aagatgacgg agcatttccg cgggccgcac aagttcgtgc tggccggttc cggccatatc 960
gccggcgtaa tcaatccgcc ttcggcaaag aaataccaat actggaccaa tgccgggccg 1020
gccgagtcgc tcgaatcctt tgtcgaaaac gcgacggaac atgccggaag ctggtggccg 1080
gactgggtgg actggttggt tgcgttgaac agtgcaaagg ttgcgacgaa aggtgcgcgg 1140
cttcccggca gtggaaacct ttgtgcaatc gccgacgcgc ccggcgaata tgttagaatg 1200
cgctgacggg aaggccgaat tttcgcgggt ttgacgattt ttgtgcactg cacaatggcg 1260
ccttgcaaaa tggccgtcga gcctttatat gttgcagcca gcaattggca gggaaagcta 1320
gtcacatggc cagcaaagga cctaagacga cggccaaacc ggcggcacgc ggtgctacca 1380
agcccgcgac tctggccgaa gctgccgcgg cgaagccgac gcctgcaccc gcccttgccg 1440
agacgatcgt cccggcagcg gcgccggtgc cggcgcctgc cgaagccgct gcaccgcagg 1500
acgtgaagac caacatcgaa gaggcgatca ccgccccggt ggaaacggca gccgccgtca 1560
ccgagcaggc gatcgaagcc gcagagaccg tcgcgccggc ggtcaccacc agcaccgcga 1620
aggaaacgac tatcatggct accactttcg aaaacgcgac tacccaggcc cagaccgttt 1680
tcgccgacct gaatgagcgc accaaggccg ccgtcgagaa gtcgaccaag ctggtcgagg 1740
aagccaacga gttcgccaag ggcaacatcg aagccctggt cgaatcgggc cgcatcgccg 1800
ccaagggctt cgagagcctg ggccaggaag ctgccgatta cagccgccgc tcgttcgaga 1860
gcgcgaccgc cgcgctgaag ggcctgtcgt cggtcaagtc gccgaccgaa ttcttcaagc 1920
tgcag 1925
<210>8
<211>399
<212>PRT
<213>多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)
<400>8
Leu Gln Asp Met Ala Lys Gly Gln Met Thr Gln Thr Ala Ala Gly Ala
1 5 10 15
Phe Glu Leu Gly Arg Asn Leu Ala Met Thr Pro Gly Lys Val Val Lys
20 25 30
Arg Thr Pro Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Asp Thr
35 40 45
Val Leu Glu Thr Pro Leu Ile Ile Phe Pro Pro Trp Ile Asn Arg Phe
50 55 60
Tyr Ile Leu Asp Leu Thr Pro Glu Lys Ser Phe Ile Arg Trp Ala Val
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Thr Val Phe Val Val Ser Trp Arg Ser Ala Asp Ala
85 90 95
Ser Met Lys Asp Val Val Trp Asp Asp Tyr Val Glu Arg Gly Gln Ile
100 105 110
Asp Ala Ile Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu Gly Val Glu Ser Val His
115 120 125
Thr Ile Gly Tyr Cys Val Ala Gly Thr Thr Leu Ala Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Val Leu Ala Ala Arg Gly Glu Ala Ala Lys Val Ala Ser Ala Thr Phe
145 150 155 160
Phe Thr Ala Gln Val Asp Phe Thr Glu Ala Gly Asp Leu Arg Val Phe
165 170 175
Val Asp Asp Asp Gln Leu Ala Met Ile Arg Ser Leu Gly Ala Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Asp Gly Arg Tyr Met Ala Ala Thr Phe Asn Leu Leu Arg Gly
195 200 205
Arg Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Val Thr Asn Asn Tyr Leu Met Gly Gln
210 215 220
Glu Tyr Ala Pro Phe Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Val Thr Asn
225 230 235 240
Leu Pro Ala Xaa Trp His Leu Ser Tyr Leu Thr Asp Leu Tyr Arg Asp
245 250 255
Asn Lys Leu Ile Ala Pro Gly Ala Leu Ser Ile Gly Gly Thr Pro Ile
260 265 270
Asp Leu Ser Lys Val Glu Thr Pro Ser Tyr Ile Gln Ala Gly Arg Glu
275 280 285
Asp His Ile Ala Pro Pro Arg Ser Val Trp Lys Met Thr Glu His Phe
290 295 300
Arg Gly Pro His Lys Phe Val Leu Ala Gly Ser Gly His Ile Ala Gly
305 310 315 320
Val Ile Asn Pro Pro Ser Ala Lys Lys Tyr Gln Tyr Trp Thr Asn Ala
325 330 335
Gly Pro Ala Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Glu Asn Ala Thr Glu His
340 345 350
Ala Gly Ser Trp Trp Pro Asp Trp Val Asp Trp Leu Val Ala Leu Asn
355 360 365
Ser Ala Lys Val Ala Thr Lys Gly Ala Arg Leu Pro Gly Ser Gly Asn
370 375 380
Leu Cys Ala Ile Ala Asp Ala Pro Gly Glu Tyr Val Arg Met Arg
385 390 395
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与多沼鞘氨醇单胞菌phaC基因片段退
火的PCR引物PHADG5
<400>9
agtttctaga ttcgayctst aytggaay 28
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与多沼鞘氨醇单胞菌phaC基因片段退
火的PCR引物PHADG7
<400>10
gtatactagt ccaiiisggc caccagctgc c 31
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与多沼鞘氨醇单胞菌phaC基因片段退
火的PCR引物PHAC12
<400>11
gttctctaga ggcgcgatca gcttgttgtc 30
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与多沼鞘氨醇单胞菌phaC基因片段退
火的PCR引物PHAC11
<400>12
gttctctaga gagtcgctcg aatcctttgt c 31
<210>13
<211>3180
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)ATCC 53159
<400>13
gatccacacc ttgttctcgc gcgcccaggc gacgaggcgc tcgtagaagg cgaggtccac 60
cgtctccgcc gtcgggttcg acggatagtt gacgacgagg atcgacgggc gcggcacggt 120
gaagttcatt gcccgctcga ggctttcgaa ataggcgtcg tcgggcgtgg tcggcaccgc 180
gcggatcgtc gcgccggcga tgatgaagcc gaaggtgtgg atcgggtagc tggggttggg 240
cgcgagcacc acgtcgcccg gcgcggtgat cgcggtggcg aggctggcaa ggccctcctt 300
cgagcccatc gtgacgacga cctcggtctc gggatcgagc tcgacgccga atcggcggcc 360
ataataattg gcctgggcgc ggcgcaggcc cggaatgccc ttggactgcg aatagccgtg 420
cgcgtcgggc ttgcgcgcca cttcgcacag tttctcgatc acatggtcgg gcggcggcag 480
gtccggattg cccatgccga ggtcgataat gtcctctccg cccgcgcgtg ccgctgcccg 540
catcgcgttc acttcggcga tgacataggg aggcaagcgc ttgatgcggt agaattcttc 600
ggacatttcc tcgactttca agggttttga cacgcgacac aaaattgtgt cgtgcgcgcg 660
ttctacgcca taatcgcgca tccgggaatg acgcattgct ccgcctgcgc taagccgggg 720
cgaaggagag gaccgaatgg ccgatacgct cacgccgacc ctgccccgac tggaagacct 780
gcagcattgg acctgggtgc tgggccgcgc gcagcagatg atgctggagc atgggctgga 840
cctgatggag catgtgcccg ccgcgccccc cttcggcatg ctgctcgatc cgaccccggc 900
aatgcgggcg agcgcggacc tctgggcgga cacgatgcag ctgtggcagc gcttcctcga 960
tcccgcccat gccgagccgt tcgtcgaatc gcccgagcag gcgcgcgaca agcgcttcaa 1020
ggcgccgcaa tggcgcgagg agccggtgtt cgatttcctg cggcagagct atttcgtgat 1080
cgccgaccac atgctcaggc aggtcgaggc gctcgagcat gtcgacgagc ggcagcggga 1140
ccagatccgc ttcgccacca agggcttcat cgacgcgatc agccccacca acttccccgc 1200
caccaatccg caggtgatcg agaagatcgt cgagaccaag ggggaaagcc tgctcaaggg 1260
cctgcagcat atgctgcagg acatggccaa gggccagatg acgcagaccg ccgccggtgc 1320
gttcgagctc ggccgcaacc tggcgatgac gcccggcaag gtggtgaagc gcaccccgct 1380
ctacgaactg atccagtatt cgccgaccac cgagaccgtg ctggaaacgc cgctgatcat 1440
cttcccgccc tggatcaacc gcttctacat cctcgacctg acgcccgaga aaagcttcat 1500
ccgctgggcg gtggagcagg ggatcaccgt gttcgtcgtc tcctggcgct cggccgatgc 1560
gagcatgaag gacgtggtgt gggacgatta tgtcgagcgc ggccagatcg acgcgatcga 1620
cacggtgcgc gcgctgctcg gcgtcgagag cgtccatacc atcggctatt gcgtggcggg 1680
caccacgctg gcggcgacgc tggcggtgct cgccgcgcgc gggcaggcgg cgaaggtggc 1740
gagcgcgacc ttcttcaccg cgcaggtcga tttcaccgag gcgggcgacc tgcgcgtgtt 1800
cgtcgatgac gaccagctgg cgatgatccg cagcctcagc gccgacggct tcctcgacgg 1860
gcgctacatg gcggcgacct tcaacctgct gcgcggccgc gacctgatct ggaactacgt 1920
caccaacaac tatctgatgg ggcaggaata tgcgccgttc gacctgctcc actggaactc 1980
ggacgtcacc aacctgccgg cgacctggca tctcagctac ctgaccgacc tgtaccgcga 2040
caacaagctg atcgcgcccg gcgcgctgcg catcggcggc accccggtcg acctttcgaa 2100
ggtcgaaacg ccgtcctaca tccaggccgg ccgcgaagat catatcgcgc cgccgcaaag 2160
cgtctggaag atcaccgagc atttccgcgg gccgcacaag ttcgtgctgg cgggttccgg 2220
gcatatcgca ggtgtaataa accccccggc ggcgaagaaa taccaatact ggaccaatac 2280
agggcctgcc gagtcgctcg actcctttat cgaaaccgcg acggaacatg cgggaagttg 2340
gtggccggat tggctggatt gggtccgtgc gctgaacggt gcaaaggttg cgacgagcgg 2400
tgcgcgggtg ccggggggtg gtaacctttg tgcagttgcg gaagcgcccg gcgactatgt 2460
tagaatgcgc tgacaaagag gcagaatttc gtgggtttct ggcgtttttg tgcactgcac 2520
aatgatcgct tgcaaaagca gcgccaagtc tttatatgct gcagtgcagc aatagccagg 2580
gaaagctagt cacatggcca gcaaaggacc caagacgacg gccaaacccg ccgcaaaatc 2640
agcggctcgc ggtgctatca agcccgcgat tctggccgaa gctgccgcgg cgacgccggc 2700
gtctgtacct cccgttgccg agacgatcgt cccggccgcg gcgttggtgc ctgcgccgga 2760
cgaagccgct gcaacgcagg aagtgacgac tcacatcaaa gacacggtcg acgttgcggc 2820
ggaaacggta aaggccgtcg ccgaacacgc gatcgaagcc gcagagaccg tcgcgccggc 2880
ggtcaccacc agcaccgcga aggaaccgac tatcatggcc accactttcg agaacgcgac 2940
cacccaggcc cagactgttt tcgccgacct caacgagcgc accaaggccg ccgtcgaaaa 3000
gtcgaccaag ctggtcgagg aagccaacga gttcgccaag ggcaacatcg aggcgctggt 3060
cgaatccggc cgcatcgctg ccaagggctt cgagacgctg ggccaggaag ccgccgatta 3120
cagccgtcgc tcgttcgaga acgccacgac cacgctgaag agcctgtcgt cggtgaagtc 3180
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与鞘氨醇单胞菌ATCC 53159基因片段
退火的PCR引物1Xba
<400>14
attctagaga tgatgaagcc gaaggtgtgg at 32
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：与鞘氨醇单胞菌ATCC 53159基因片段
退火的PCR引物4Xba
<400>15
attctagatg gtgcgctcgt tgagg 25
<210>16
<211>34
<212>DNA
<213>Sphingomonas sp.ATCC 531559
<400>16
gaaattctgc ctctttgtcg gtcctctcct tcgc 34