牛Y染色体特异性引物序列及在牛胚胎性别鉴定中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种用巢式PCR来鉴定牛早期胚胎性别的牛Y-染色体特异性引物序列。背景技术
在农业生物技术领域中，性别控制问题，特别是对牛这样的大家畜的性别控制问题，长期以来一直是生物科学家致力于研究的重大的理论课题之一，而且具有巨大的经济价值。实现家畜性别的人为控制主要有两条途径：一是X精子和Y精子的分离；二是早期胚胎的性别鉴定。但从目前X、Y精子分离技术来看，虽然使用流式细胞分类仪已成功分离了X、Y精子，但其成本高，分离效率低，一时还很难在实际应用中推广。随着胚胎移植技术的产业化推广，早期胚胎的性别鉴定技术日益发展成熟，成为目前最具有推广和实用价值的一项性别控制技术。
牛早期胚胎的性别鉴定已有十几年的发展历史，从早期的免疫学方法到胚胎细胞的染色体核型分析和现在的分子生物学方法，该项技术取得了巨大的进展，但真正进入可以实际应用阶段是聚合酶链式反应(PCR)技术在牛早期胚胎性别鉴定中的应用。Herr CM等首先成功应用了PCR技术鉴定牛羊胚胎性别(Herr CM，Theriogenology，1991，35(1)：45-54)。在国内，曾溢滔等在1991年通过对牛Y-染色体性别决定区(SRY)基因核心序列的直接测序，并通过测定SRY基因核心序列地存在与否鉴定了奶牛胚胎的性别(中国科学(B)，1993，23(4)：371-375)。目前人们常用来鉴定牛胚胎性别的序列有Y-染色体重复序列、SRY基因核心序列等，但Y-染色体重复序列常常会因为在其他染色体上可能存在其同源序列而影响胚胎性别鉴定的准确率，曾溢滔等所应用的SRY核心序列也有其不足之处，因为SRY基因的核心序列在哺乳动物间有很高的同源性(达80％以上)，如和人的SRY基因的核心序列的同源性高达84％，这样在进行牛胚胎性别鉴定时男性操作者和其他动物的DNA容易对鉴定过程产生污染，特别是在野外进行PCR操作时，因为环境条件不够严格，容易产生假阳性，从而影响胚胎性别鉴定的准确率。并且Herr CM等所用的常规PCR一次扩增的灵敏度有限，因为胚胎性别鉴定时所能从胚胎切割取样的细胞数很少，所以有时会造成由于扩增产物的量太少而影响鉴定结果的判断。发明内容
本发明的目的是提供一种牛Y-染色体特异性引物序列，公牛特异的Y-染色体片段的巢式PCR引物用在PCR技术中鉴定牛早期胚胎性别时，不但能减少污染、提高准确率，而且由于提供的是嵌套式引物，采用巢式PCR提高了灵敏度，另外引物特异性强，不容易产生污染，因此适合在野外操作，便于在生产中使用。
本发明的另一个目的是牛Y-染色体特异性引物序列在牛早期胚胎性别鉴定中的应用。
本发明的目的是这样实现的：本发明是先提取牛耳组织基因组DNA，进行引物特异性检验，然后分割胚胎的细胞样品，提取胚胎细胞样品DNA后，使用巢式PCR进行胚胎性别鉴定的方法来进行牛的性别控制，用外引物进行PCR反应时公牛样品可以扩增出255bp的片段，使用Y染色体特异片段的内、外引物进行巢式PCR反应时公牛样品则可以扩增出205bp的扩增片段，而母牛样品使用这些引物则没有任何扩增产物，从而可以鉴定牛胚胎性别。
从相关报道中知道SRY基因核心序列以外的区域在目前所检测的哺乳动物中同源性低于54％，利用这一特点，本发明根据美国基因库(Genbank)所提供的Y-染色体特异性DNA序列中的SRY基因5′调控区序列，设计合成了A、B、C3条嵌套式引物(见表1)，并利用巢式PCR灵敏度和特异性高的特点，使用巢式PCR鉴定牛胚胎的性别。
表1：公牛特异的Y-染色体片段引物序列
引
序 列
物
A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′
B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′
C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′
在实际应用中如果只使用Y-染色体特异性引物序列，在牛胚胎性别鉴定过程中容易产生假阴性，因此本发明根据牛酪蛋白基因序列设计合成了一对牛酪蛋白基因引物作为内标基因引物。这样使用Y-染色体特异性序列引物和牛酪蛋白基因引物对牛DNA或牛胚胎进行性别鉴定时，母牛就只能扩增出403bp的内标基因——牛酪蛋白基因片段，而公牛则同时能扩增出205bp的Y-染色体特异性片段和403bp的牛酪蛋白基因片段(见附图1)，如果胚胎细胞丢失则没有任何扩增产物。
综上所述，本发明提供了Y-染色体特异性序列引物，并且该引物特异性强和其他哺乳动物的同源性低，避免了其他动物DNA给牛胚胎性别鉴定带来污染的问题。同时本发明提供的是嵌套式引物，使用的巢式PCR技术提高了性别鉴定的灵敏度和特异性，而且内标基因引物的使用排除了性别鉴定中假阴性错误，保证了鉴定结果的可靠性。本发明完全适合在野外操作，便于在生产中使用。附图说明
图1为Y-染色体特异性片段的嵌套式引物A、B、C和酪蛋白基因引物对牛基因组DNA进行PCR扩增的产物电泳分析图。
M：100bp梯度的DNA分子量标准；1、2、4、6、7为母牛，3、5、8为公牛；9为空白对照，10为阴性对照，11为阳性对照；205bp为公牛Y-染色体特异性片段的PCR扩增产物的电泳条带；403bp为公、母牛共有基因(内标基因)——酷蛋白基因的PCR扩增产物的电泳条带。
图2为引物进行牛胚胎性别鉴定的结果。
1、4、6泳道同时拥有205bp的Y-染色体特异性片段和403bp的酪蛋白基因扩增片段的电泳带，所以性别鉴定为雄性胚胎，而2、3、5、7、8泳道只有酪蛋白基因扩增片段的电泳带，所以性别鉴定为雌性胚胎。具体实施方式
下面结合实施实例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：通过牛基因组DNA进行性别鉴定，检测引物的特异性。
先提取公牛和母牛的耳组织DNA，再将提取后的牛耳组织DNA溶于400μl灭菌超纯水中，然后取0.5μl用于巢式PCR。
本发明根据Genbank所提供的Y-染色体特异性DNA序列中的SRY基因5′调控区序列，设计合成的引物序列如下所示：
引物 序 列
A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′
B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′
C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′
使用本发明设计合成的引物进行性别鉴定的具体实验过程如下：
巢式PCR的反应体系为：第一次PCR反应体系体积为10μl，其中含引物A、B和酪蛋白基因引物各0.1μmol/l，Taq酶2.0U，共20个循环。取第一次PCR反应物2～4μl作为第二次PCR反应模板，同时加入引物C、B和酪蛋白基因引物各0.25μmol/l，Taq酶2.0U共进行30个循环。循环参数为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火63℃，30s；延伸72℃，1min，最后在72℃，5min。PCR反应在PTC-100(MJ Research)上进行。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果。
结果表明只使用引物A、B进行PCR扩增时公牛可以扩增出255bp的片段，使用引物A、B、C和酪蛋白基因引物进行巢式PCR扩增时公牛可以扩增出205bp的Y-染色体特异性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而母牛DNA样品则只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段(如附图1)。共检测了19头公牛和27头母牛的DNA样品，性别检测的结果和实际完全相符，说明本发明设计合成的Y-染色体特异性序列引物公牛特异。
实施例2：牛胚胎性别鉴定
微量牛胚胎细胞DNA的提取：使用简易胚胎分割仪，从桑椹胚或囊胚切取4-6个细胞，然后把胚胎细胞样品放入200μl离心管后，加入7μl灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，使胚胎细胞样品存在于离心管底，用封口膜封好离心管；在100℃煮沸10-15min后立即置于冰上；冷却后14000r/min离心10min，取上清用PCR。其巢式PCR的反应体系和循环参数与实施例1相同。胚胎的性别鉴定结果如附图2所示。雄性胚胎可以扩增出205bp的Y-染色体特异性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而雌性胚胎则只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段。共检测了12个胚胎的性别，性别鉴定胚胎移植后产犊牛的性别和检测结果完全相一致。
实施例3：使用本发明所设计的引物对人、羊和猪的基因组DNA进行PCR扩增，检测引物是否牛特异。
采集人、羊和猪的血液，提取DNA后，用于巢式PCR扩增，其具体的实验过程与实施例1相同。结果所有的人、羊和猪的基因组DNA都没有任何扩增产物，说明本发明设计的引物严格牛特异，男性操作者和其他动物的DNA不会对牛胚胎性别鉴定结果产生污染。