一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用.pdf

一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用
    技术领域：

    本发明涉及一种防治三七根腐病的生物杀菌剂的制备方法和应用，属微生物农药

    技术领域。

    背景技术：

    三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，1948)，又名田七、山漆和金不换等，是五加科人参属的一种多年生阴生草本植物，作为第三纪古热带的残遗物种现仅存于北纬23°30′附近的我国云南省文山州和广西自治区百色地区的部分中高海拔地区。由于具有活血化淤、消肿止痛和滋补强身等多种功效，故作为我国中医药中的一种名贵药材而被广泛用于多种疾病特别是近年来日益严重的心血管疾病的预防和治疗。目前，野生三七已十分罕见。大力开展人工栽培和进行大面积集约化种植是解决野生资源日益枯竭问题和不断满足国内外对三七日益增长需求的重要手段。云南省文山州由于具有独特的气候和土壤条件，历史上一直是我国三七的主要产地。由于三七具有的重要经济价值，目前该草药的种植和加工已成为云南省文山州发展地方经济的重要支助产业之一。

    但由于连年大面积单一种植，加之三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，因此病害问题十分突出，特别是根腐病问题，目前已成为限制三七种植业发展的严重障碍。据王朝梁等人的调查，各年生三七均可受害，且生长年限越长受害越重，在文山州的发病率一般为5-20％，严重的达46.68％，甚至绝产。对该病的防治目前主要依靠轮作倒茬和化学药剂灌根。但轮作年限一般要求8年以上，生产上难以大面积推行。药剂灌根虽有效，但农药残留问题严重。因此，研究开发高效的生物杀菌剂很有经济价值和社会价值。

    三七根腐病是由多种病原菌复合侵染或交叉感染引起的。与症状相关的微生物类群主要包括Cylindrocarpon didynum、C.destructans、Fusarium solani、F.oxysporum、Phytophthora cactorum、Phoma herbarum、Rhizoctonia solani和Pseudomonas sp.等。其中两种株孢菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans在田间分布范围较广，分离频率较高，可导致典型的黄腐型症状，被认为是生产上三七根腐病的主要致病菌。

    侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)是一种好氧的，可形成芽孢的细菌。该菌可通过形成伴孢晶体，分泌酶、毒蛋白或其他毒肽而产生杀菌功能。

    发明内容：

    本发明的目的是通过对一株具有杀菌功能的侧孢短芽孢杆菌研究，开发应用于防治三七根腐病的生物杀菌剂。

    本发明利用Brevibacillus laterosporus G4菌株或由该菌株产生的各种突变株，通过液体培养方法，获得菌体培养物(包括菌体及其代谢物质)，添加农业上允许使用的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质，制成种粉剂，颗粒剂，可湿性粉剂，用于防治引起三七根腐病的主要病原菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans。

    侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株已于2003年6月2日保藏于武汉大学中国典型培育物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M203045。

    本发明通过以下步骤实现：(1)本发明使用的微生物的来源和特性；(2)微生物菌种的培养(包括微生物试管斜面种子培养、微生物液体种子培养)：(3)微生物菌体及其代谢物质的大量培养；(4)菌剂的加工及应用。以上各步骤分述如下：

    本发明使用的微生物是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株或由该菌株通过突变、遗传改造获得的衍生物。该菌株已于2003年6月2日保藏于武汉大学中国典型培育物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M203045。G4菌株形态特征是：菌体长杆状，个体较大，两端钝圆，多以凝集形式存在。在YPD培养基(10克酵母浸膏，5克蛋白胨，15克葡萄糖，20克琼脂，水1000毫升，pH6～7)上，菌落呈圆形、隆起、边缘较整齐，表面无光泽、粗糙、类似细小粉末状，菌苔白色；培养36小时后可见大量脱落的芽孢，芽孢为椭圆形呈独木舟状体。G4菌株通过分泌细胞壁降解酶分解病原真菌的细胞壁，继而通过分泌的抗菌肽抑制病原菌的生长和繁殖，其抑菌能力显著高于同类的其它侧孢短芽孢杆菌。

    微生物斜面种子培养方法：将微生物的菌丝体接种到YPD培养基斜面上，28～32℃下培养1～4天，获得试管种。

    微生物液体种子的培养方法：将斜面种子接种到YDFG液体培养基(5克酵母粉，150克大豆饼粉，5克鱼粉，200克葡萄糖，水1000毫升，pH6～7)中，于25～35℃，转速为200～300rpm的摇床上培养2～5天，获得液体菌种。

    微生物液体条件下的大量繁殖方法：将液体种子接种到有液体YDFG培养基的20立升，50立升，1000～4000立升发酵罐中，生产这种微生物的菌体和代谢产物。发酵时，发酵罐的培养温度控制在28～35℃，转速为300～500rmp，培养时间36～72小时。

    菌剂各种剂型的制备如下：

    粉剂的制备：微生物大量菌体制备好以后作为原药与粉碎(粒径小于1毫米以下)的单一或组合的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，叶蜡石，高岭土，膨润土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助剂(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸盐，木质素磺酸盐以及它们的复配物)混合，混合物中微生物及其代谢物(即发酵终产物)的重量百分比为30～75％。混合之后将水分相对湿度调节到5％以下，包装，室温或4～10℃下保存。

    颗粒剂的制备：按粉剂的方法将菌体与填料和助剂混合，用造粒机制成直径为1～4mm，长度为0.5～8cm的颗粒，在30～35℃下烘干到水分含量小于5％，制成颗粒剂。

    可湿性粉剂的制备：微生物大量发酵生产以后，将发酵终产物与填料(同粉剂)，润湿剂(茶枯，皂角，土温60，拉开粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸钠等)，分散剂(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散剂MF等)，稳定剂(如抗坏血酸)均匀混合，将水分调节到2％以下。在制备时先将微生物发酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再与菌体混合。可湿性粉剂中微生物的重量百分比为35～75％。

    以上菌剂中，粉剂和可湿性粉剂的使用方法可以是拌种，拌土穴施、沟施，也可以是喷雾；颗粒剂为拌土穴施。

    以上菌剂的使用时期可以是播种期，一年期和二年期。

    本发明产品对三七根腐病菌的抑制试验：

    试验一  粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂防治三七根腐病菌的室内平板测定

    1.试验菌剂及稀释：粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂(其中，填料为85％草炭和15％硅藻土；助剂为50％烷基萘磺酸盐和50％木质素磺酸盐；菌剂中微生物发酵终产物的重量百分比为50％)通过上述方法制备；用水将菌剂稀释500倍后备用。以水作为菌剂的对照。

    2.病原菌地准备：柱孢菌C.didynum和C.destructans由发明人分离自云南文山州所采集的三七根腐病病根。将这两种病原菌分别接种到PDA培养基(蔗糖20g，去皮马铃薯200g，琼脂10g，用水定容至1000mL)平板上，25℃下培养14天后所得的菌落作为接种体备用。

    3.试验方法：在PDA平板(直径＝9cm)上接种1片病原菌菌落(直径＝5mm)，在与病原菌接种体距离3cm处的牛津杯(1×0.5cm)中加入200μL菌剂稀释液。每处理设三个重复，以加水的处理作为对照。将各处理平板置于25℃下培养，14天后测量各处理中病原菌的菌落直径。

    4.试验结果与分析：

    表1 粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂对两种三七根腐病菌的抑菌效果   菌剂    病原菌C.didynum    病原菌C.destructans对照菌落直径平均值(cm)处理菌落直径平均值(cm)相对抑制率(％)对照菌落直径平均值(cm)处理菌落直径平均值(cm)相对抑制率(％)粉剂 6.5  1.12   83.77^a 5.8  0.95   83.62^a可湿性粉剂 6.5  0.68   89.54^a 5.8  0.74   87.24^a颗粒剂 6.5  0.81   87.54^a 5.8  0.81   86.03^a

    相对抑制率(％)＝(对照菌落直径平均值-处理菌落直径平均值)÷对照菌落直径平均值×100；a表示各处理间无显著差异。

    从表1可以看出，使用本发明制备的三种菌剂在平板上能显著抑制两种三七病原菌的生长，三种菌剂中以可湿性粉剂的抑菌效果最好，但三种菌剂对两种病原菌的抑菌效果间没有显著差异。粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂对病原菌对C.didynum的相对抑菌率分别为83.77％、89.54％和87.54％；对病原菌C.destructans的相对抑菌率分别为83.62％、87.24％和86.03％。

    试验二  利用粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂对三七种苗进行处理防治三七根腐病的田间防治效果

    1.试验菌剂及稀释：粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂(其中，填料为85％草炭和15％硅藻土；助剂为50％烷基萘磺酸盐和50％木质素磺酸盐；菌剂中微生物发酵终产物的重量百分比为50％)通过上述方法制备；用水将菌剂稀释500倍后备用。以水、500倍的2％次氯酸钠、500倍的2％优氯净和500倍的2％消菌灵作为菌剂的对照。

    2.材料及试验场地：一年生三七种苗取自云南省文山州三七试验场。实验场地为自云南省文山州三七试验场，实验地上连作三七10年，根腐病严重。实验时间2003年2月18日。

    3.试验方法：将供试种苗浸于以上药剂药液中20分钟取出，自然风干植株水迹后立即移栽入土，使芽尖离地面0.5-1cm。每处理10株，重复3次。试验区上置遮阳物使透光率在15-20％。不进行任何肥水和施药管理。30天后进行第一次调查，对比出苗数量、成苗率、苗嫩叶顶芽有无药物灼伤和移栽后1年的成苗率。

    4.试验结果与分析：

    表2 粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂对三七种苗进行处理防治三七根腐病的田间防治效果  药剂出苗率(％)药害灼伤率(％)1年后成苗率(％)1年后根腐病的病情指数粉剂 90^a 0^a 65^b  2.9^a可湿性粉剂 89^a 0^a 63^b  3.1^a颗粒剂 87^a 0^a 58^b  3.9^b次氯酸钠 90^a 7.4^b 67^b  3.2^a优氯净 97^a 0^a 57^b  4.1^b消菌灵 90^a 3.7^b 73^a  2.8^a水 63^b 0^a 34^c  8.4^c

    数据后的标有同一字母表示这些处理间尤显著差异；而不同字母间的处理有显著差异。

    从表1可以看出，使用本发明制备的三种菌剂处理三七种苗后能有效降低根腐病菌的危害。与水处理相比较，能显著提高出苗率(三种菌剂的出苗率分别为90％、89％和87％；水处理的出苗率仅为63％；菌剂处理与水处理的出苗率间存在显著差异)，1年后的成苗率(三种菌剂的成苗率分别为65％、63％和58％；水处理的成苗率仅为34％；菌剂处理与水处理的成苗率间存在显著差异)和降低根腐病危害的病情指数(三种菌剂的病情指数分别为2.9％、3.1％和3.9％；水处理的病情指数为8.4％；菌剂处理与水处理的病情指数间存在显著差异)。三种菌剂以粉剂的效果最好，但三种菌剂的处理效果间五差异显著性。与三种化学药剂相比较，三种菌剂和三种化学药剂处理的出苗率无差异显著性；三种菌剂与次氯酸钠和优氯净处理的1年后成苗率和病情指数相当，无显著差异；消菌灵处理后1年后的成苗率和防治效果最好(分别为73％和2.8)，与三种菌剂和另外两种化学药剂的处理效果存在显著差异。但是从药害灼伤率上看，次氯酸钠和消菌灵对种苗存在药害灼伤，三种菌剂和优氯净无药害灼伤。综合以上效果和从较低农药残留的角度看，三种菌剂是处理三七种苗、降低根腐病危害的理想生物菌剂。

    试验三  利用粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂防治一年生三七种苗根腐病的田间防病效果

    1.试验菌剂及稀释：粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂(其中，填料为85％草炭和15％硅藻土；助剂为50％烷基萘磺酸盐和50％木质素磺酸盐；菌剂中微生物发酵终产物的重量百分比为50％)通过上述方法制备；用水将菌剂稀释200倍后备用。以水、3％多抗霉素200倍液、50％甲霜灵锰锌+98％惡霉灵(1∶1)200倍、50％甲霜灵锰锌200倍、50％速克灵200倍，98％惡霉灵200倍作为菌剂的对照。

    2.材料及试验场地：一年生三七种苗取自云南省文山州三七试验场老病地。实验场地为自云南省文山州三七试验场，实验地上连作三七10年，根腐病严重。实验时间2003年2月18日。

    3.试验方法：将供试种苗用上述药剂浸泡1分钟后取出直接移栽入土。为增加附着力和持效性，每处理药液中加入60目细木粉5g。每处理10株，重复3次。试验区上置遮阳物使透光率在15-20％。不进行任何肥水和施药管理。处理1年后调查根腐病危害的病情指数。

    表3 粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂防治一年生三七种苗根腐病的田间防病效果  药剂  1  2  3  4  5  6  7  8  9病情指数     2.7     3.1     3.2     2.9     2.4     2.8     2.7     2.1     7.8

    注：1为粉剂，2为可湿性粉剂，3为颗粒剂，4为3％多抗霉素，5为50％甲霜灵锰锌+98％惡霉灵，6为50％甲霜灵锰锌，7为50％速克灵，8为98％惡霉灵，9为水。

    从表3看出，供试的三种菌剂和5种化学药剂都能很好防治三七根腐病的危害，其中以98％惡霉灵和50％甲霜灵锰锌+98％惡霉灵和防治效果最好；三种菌剂种粉剂的效果与50％速克灵、50％甲霜灵锰锌和3％多抗霉素水平相当，可湿性粉剂和颗粒剂的效果稍差；三种菌剂中以粉剂最好。

    以上可见本发明利用低成本原料和采用常规生产工艺制成的菌剂对防治三七的两种主要病原菌有很好的抑菌效果。

    具体实施方式：

    实施例1：小规模制备粉剂的方法

    在20升发酵罐中发酵菌剂的具体方法和菌剂制备的工艺是：在发酵罐中装入16升YDFG培养基，121℃灭菌90分钟，接入1升液体培养菌种，在通气率为0.7，转速为450rpm，温度为28～35℃的波动范围内发酵2-4天，发酵1天后每4小时检测一次菌体数量，当菌体量达到10¹³个/mL以上，并且数量不再增加时及时中止发酵。然后按50毫升发酵终产物∶45克填料∶5克助剂的比例混合，在35～45℃下烘干到水分含量小于5％，最后用塑料袋密封，4℃或室温保存于通风避光处。以上使用的填料可以是粒径小于1mm的以下各种填料中的一种或多种的混合物：草粉，米糠，木屑，滑石，叶蜡石，高岭土，膨润土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭。以上使用的助剂可以是以下各种助剂中的一种或多种的混合物：烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸盐，木质素磺酸盐。微生物及其代谢产物在制成的粉剂中的重量百分比为30％。

    实施例2：大规模制备粉剂的方法

    在4000升发酵罐中发酵菌体的具体方法和菌剂制备的工艺是：在发酵罐中装入3500升YDFG培养基，121℃灭菌120分钟，接入175升液体培养菌种，在通气率为0.9，转速为450rpm，温度为28～35℃的波动范围内发酵2～4天，发酵1天后每4小时检测一次菌体数量，当菌体量达到10¹³个/mL以上，并且数量不再增加时及时中止发酵。之后按实例1中的方法制备粉剂。微生物及其代谢产物在制成的粉剂中的重量百分比为75％。

    实施例3：制备颗粒剂的方法

    按实施例1或实施例2的方法发酵生产微生物及其代谢产物。将发酵终产物与25％的硅藻酸钠溶液按体积比为1∶1的比例混合，然后用造粒机制成直径为4mm，长度为4.5cm的颗粒，在35℃下烘干到水分含量小于5％，制成颗粒剂。微生物及其代谢产物在制成的颗粒剂中的重量百分比为45％。

    实施例4：可湿性粉剂的制备

    按实施例1或实施例2的方法发酵生产微生物及其代谢产物。将发酵终产物与填料按15克∶85克的比例混合制成颗粒剂。其中填料为95％草炭，2％吐温60，1％十二烷基苯磺酸钠，1％拉散剂MF，1％抗坏血酸，混合后将含水量调节2％。微生物及其代谢产物在制成的可湿性粉剂中的重量百分比为55％。