一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法.pdf

本发明涉及一种利用黑曲霉生物转化木质纤维素高效生产葡萄糖酸的方法。提供的方法具体涉及，将培养好的黑曲霉接种于木质纤维素水解液中发酵生产葡萄糖酸，发酵96小时后葡萄糖酸浓度可达80g/L；或者将液体培养好的黑曲霉、木质纤维素原料和纤维素酶同时加入反应器中，进行同步糖化与发酵生产葡萄糖酸。本发明具有时间短、效率高的特点，而且木质纤维素原料来源广泛且价格低廉，具有非常广阔的发展空间和应用前景。

1.  一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，以木质纤维素为原料低成本高效生产葡萄糖酸，具体地说是首先进行木质纤维素原料的预处理，得到的原料进行脱毒或者不脱毒，然后经过以下两种途径生产葡萄糖酸：一、用纤维素酶酶解处理后的原料得到糖化液，然后接入葡萄糖酸生产菌株进行葡萄糖酸发酵；二、将处理后的原料、纤维素酶和葡萄糖酸生产菌株同时加入反应器中，通过同步糖化与发酵的方式生产葡萄糖酸。

2.  如权利要求1所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，其具体步骤为：
(1)木质纤维素预处理：
木质纤维素预处理包括稀酸预处理，蒸汽爆破，氨纤维爆破、液氨膨爆、亚硫酸盐预处理、碱法预处理、机械磨碎预处理、生物预处理；优选稀酸预处理方法，稀酸预处理是指稀硫酸溶液浸润物料，然后在180～200℃下维持1～10min，破坏木质纤维素结构，从而有利于后续酶解过程；
(2)利用液体培养基培养黑曲霉：
40～80g/L葡萄糖，0～1g/L硫酸镁，0～2g/L磷酸二氢钠，0～2g/L的磷酸二氢钾，0～2g/L的硫酸锰，液体培养黑曲霉25～40℃，50～500rpm，培养为12～48h，菌体浓度达到1～3g/L。培养的黑曲霉用于液体或固体发酵基质的进一步培养或发酵；
(3)固态生物脱毒：
调节木质纤维素物料pH和含水量后，接入脱毒霉菌Amorphotheca resinaeZN1，保藏编号CGMCC7452，固态培养特征在于培养温度20～35℃，物料含水量为30～70％，物料pH4.5～6.5。脱毒所脱除的化合物包括甲酸、乙酸、糠 醛、羟甲基糠醛等；
(4)葡萄糖酸的生产：
向发酵罐中同时加入脱毒或者未脱毒的木质纤维素原料和纤维素酶，用水调节固体含量，在50℃，pH4.8的条件下糖化48～96h，对糖化后的浆液进行固液分离，获得上清液，即木质纤维素酶解液；把液体培养好的黑曲霉菌种，接种于水解液中发酵；
或者将液体培养获得的黑曲霉菌种、木质纤维素原料(脱毒或者未脱毒)和纤维素酶同时加入到反应器中，在30～50℃，pH4～6的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产葡萄糖酸，发酵时间为72～120h。

3.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的木质纤维素原料包括玉米秸秆、小麦秆、稻草、棉花秆、能源植物、木头、木屑、废纸、农林业废弃物等一种或几种的混合。

4.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，如果选用抑制物耐受性强的葡萄糖酸生产菌，则步骤(3)，即对木质纤维素原料的脱毒处理可以省略。

5.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，如果选用抑制物耐受性较差的葡萄糖酸生产菌，则预处理后的木质纤维素原料需经过脱毒处理，脱除预处理过程中产生的抑制物，包括有机酸类化合物，脱毒方法包括但不限于生物脱毒、水洗、过碱处理(Overliming)、活性炭吸附、离子吸附，优选生物脱毒。

6.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法， 其特征在于，在所述的步骤(4)中，所述的木质纤维素在发酵罐中的质量分数为10～40％，纤维素酶为5～30FPU/g DM，发酵温度30～50℃。

7.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，生产葡萄酸的菌株主要有黑曲霉、青霉、葡萄糖氧化杆菌等，其中黑曲霉更适合于利用木质纤维素原料生产葡萄糖酸。

8.  如权利要求2所述的一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，发酵生成的葡萄糖酸，包括游离态的葡萄糖酸，以及调节发酵pH所生成的葡萄糖酸盐。

一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法
【技术领域】
本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是玉米秸秆等木质纤维素原料经过糖化与发酵生产高浓度葡萄糖酸的方法。
【背景技术】
葡萄糖酸及其盐类具有无毒、热稳定性好和不易潮解等特点，在化工、食品、医药、轻工等行业有广泛的用途。特别是在水泥外加剂方面，葡萄糖酸钠可以作为减水剂和缓凝剂而被广泛使用，并取得了良好的效果；在食品工业可用作营养增补剂、固化剂、缓冲剂等，现在人们已经以葡萄糖酸钠为原料开发出高呈味的新型调味品。此外，由于葡萄糖酸具有优良的螯合性能还被广泛用于水质处理、电镀、金属与非金属的表面清洗及水泥生产等多种工业部门。目前，葡萄糖酸的年需求量已经超过50万吨。
生产葡萄糖酸的方法主要有生物发酵法、均相化学氧化法、电解氧化法以及多相催化氧化法四种方法。均相化学氧化法的中间步骤多，副产物多，产物难于分离，而且成品中含有氯化钠，使其在水泥外加剂方面的应用受到了限制；电解氧化法在生产中能耗大且不易控制；多相催化氧化法需要使用昂贵的催化剂，导致葡萄糖酸的生产成本居高不下。而微生物发酵法由于发酵速度快、发酵过程易于控制、产品易提取、生产稳定温和、容易工业化生产等优点，而成为当前葡萄糖酸最主要的生产方法。
发酵生产葡萄糖酸的原料主要是葡萄糖、糖蜜及淀粉类物质。而当前的葡萄糖酸产量并不能满足日益增加的对葡萄糖酸的需求，淀粉深加工企业的一味大规模扩建势必会严重影响到国家的粮食安全。因此，寻求价格低廉且来源广泛的葡萄糖酸生产原料是葡萄糖酸行业健康发展所面临的首要问题。我国是农业大国，农林业废弃物等木质纤维素原料的产量巨大，但大部分都被低效的焚烧浪费掉，不仅造成了巨大的资源浪费，而且导致了比较严重的环境和交通问题。而利用木质纤维素原料生产葡萄糖酸，则可以有效解决葡萄糖酸行业的原料来源问题，同时可以有效缓解当前的三农问题，为农业废弃物的深加工提供新的出路。
生物转化木质纤维素原料生产化学品，一般包括原料预处理、酶水解、发酵和产品分离等工序。木质纤维素原料经过预处理破坏了其致密结构，促进纤维素酶对纤维素的降解。但是，预处理过程产生有机酸类、醛类和酚类等抑制物。为了提高纤维素基质的可发酵性，发酵之前必须降低或完全脱除其中的抑制物。但是以木质纤维素为基质发酵生产葡萄糖酸存在许多技术难点，目前有关利用木质纤维素原料生产葡萄糖酸的报道中采用的方法多为多相催化氧化法。采用这些方法生产葡萄糖酸的过程中，需要用到大量的硫酸、氢氧化钠等化学品，而催化剂多为Na₂Cu(OH)₄和金/磷钨杂多酸铯盐，这种方法虽然转化率高，但是所用催化剂在循环次数有限，单位产品的催化剂消耗量高，变相增加了葡萄糖酸产品的生产成本。
本发明提供了以完全真实的木质纤维素物料为基质，采用发明人提出的预处理、糖化与发酵工艺生产高浓度葡萄糖酸。
【发明内容】
本发明目的在于拓展工业用葡萄糖酸发酵的发酵基质，使用价格低廉、资源丰富的木质纤维素，提供一种以木质纤维素为原料，通过糖化与发酵生产高浓度葡萄糖酸的方法。
本发明的构思：以木质纤维素为原料低成本高效生产葡萄糖酸，具体地说是首先进行木质纤维素原料的预处理，得到的原料进行脱毒或者不脱毒，然后经过以下两种途径生产葡萄糖酸：一、用纤维素酶酶解处理后的原料得到糖化液，然后接入葡萄糖酸生产菌株进行葡萄糖酸发酵；二、将处理后的原料、纤维素酶和葡萄糖酸生产菌株同时加入反应器中，通过同步糖化与发酵的方式生产葡萄糖酸。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，其具体步骤为：
(1)木质纤维素预处理：
木质纤维素预处理包括稀酸预处理，蒸汽爆破，氨纤维爆破、液氨膨爆、亚硫酸盐预处理、碱法预处理、机械磨碎预处理、生物预处理；优选稀酸预处理方法，稀酸预处理是指稀硫酸溶液浸润物料，然后在180～200℃下维持1～10min，破坏木质纤维素结构，从而有利于后续酶解过程。
所述的木质纤维素原料包括玉米秸秆、小麦秆、稻草、棉花秆、能源植物、木头、木屑、废纸、农林业废弃物等一种或几种的混合。
所述的木质纤维素原料经过了预处理，使其致密结构被破坏，从而提高其可酶解性。预处理方法包括但不限于稀酸预处理、蒸汽爆破、氨纤维爆破、 液氨膨爆、亚硫酸盐预处理、碱法预处理、机械磨碎预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理方法。
(2)利用液体培养基培养黑曲霉：
40～80g/L葡萄糖，0～1g/L硫酸镁，0～2g/L磷酸二氢钠，0～2g/L的磷酸二氢钾，0～2g/L的硫酸锰，液体培养黑曲霉25～40℃，50～500rpm，培养为12～48h，菌体浓度达到1～3g/L。培养的黑曲霉用于液体或固体发酵基质的进一步培养或发酵。
(3)固态生物脱毒：
调节木质纤维素物料pH和含水量后，接入脱毒霉菌Amorphotheca resinae ZN1，保藏编号CGMCC7452，固态培养特征在于培养温度20～35℃，物料含水量为30～70％，物料pH4.5～6.5。脱毒所脱除的化合物包括甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等。
如果选用抑制物耐受性强的葡萄糖酸生产菌，则步骤(3)，即对木质纤维素原料的脱毒处理可以省略。
如果选用抑制物耐受性较差的葡萄糖酸生产菌，则预处理后的木质纤维素原料需经过脱毒处理，脱除预处理过程中产生的抑制物，包括有机酸类化合物，如甲酸、乙酸、乙酰丙酸等，呋喃类衍生物，如糠醛、羟甲基糠醛等，酚类化合物，如对羟基苯甲醛、香兰素等。脱毒方法包括但不限于生物脱毒、水洗、过碱处理(Overliming)、活性炭吸附、离子吸附等，优选生物脱毒。
(4)葡萄糖酸的生产：
向发酵罐中同时加入脱毒或者未脱毒的木质纤维素原料和纤维素酶，用水调节固体含量，在50℃，pH4.8的条件下糖化48～96h，对糖化后的浆液进 行固液分离，获得上清液，即木质纤维素酶解液；把液体培养好的黑曲霉菌种，接种于水解液中发酵。
或者将液体培养获得的黑曲霉菌种、木质纤维素原料(脱毒或者未脱毒)和纤维素酶同时加入到反应器中，在30～50℃，pH4～6的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产葡萄糖酸，发酵时间为72～120h。
所述的木质纤维素在发酵罐中的质量分数为10～40％，纤维素酶为5～30FPU/g DM，发酵温度30～50℃。所述的纤维质原料选自固体秸秆原料或者固体秸秆处理物；其中：所述的纤维质原料包括玉米秸秆、麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中。
生产葡萄酸的菌株主要有黑曲霉、青霉、葡萄糖氧化杆菌等，其中黑曲霉更适合于利用木质纤维素原料生产葡萄糖酸。
发酵生成的葡萄糖酸，包括游离态的葡萄糖酸，以及调节发酵pH所生成的葡萄糖酸盐，如葡萄糖酸钠，葡萄糖酸钙，葡萄糖酸铵等。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明以木质纤维素为原料发酵葡萄糖酸，基质成本低廉，来源广泛，充分利用了可再生资源，不与人类争粮，能够满足不断扩大的市场需求；
(2)本发明使用独特的发酵菌种和培养工艺，在发酵过程只需要添加少量无机盐离子，成本低，葡萄糖酸浓度和产率高，便于后续分离和纯化。
(3)本发明以木质纤维素为原料高效发酵生产葡萄糖酸，可以借鉴现有纤维乙醇生产相关技术，实现从木质纤维素生产葡萄糖酸及其盐类化合物，实现基于木质纤维素的大宗精细化学品生物炼制。
【附图说明】
图1实施例1发酵过程曲线；
图2实施例2发酵过程曲线
【具体实施方式】
以下提供本发明一种生物转化木质纤维素生产葡萄糖酸的方法的具体实施方式。
实施例1
将烘干的玉米秸秆与5％(w/w)浓度的稀硫酸溶液以2∶1的质量比混合均匀，于190℃、1.2MPa的条件下预处理3min；预处理后将物料pH值调节到5.5，接入培养好的生物脱毒菌种Amorphotheca resinae ZN1(CGMCC7452)，于25℃的条件下静置培养7d；然后将脱毒后的物料加入反应器中，调节固体含量至25％(w/w)，加入纤维素酶(用量为15FPU/g DM)，于50℃、150rpm的条件下糖化48h，糖化过程中用5M氢氧化钠控制pH在4.8。得到的玉米秸秆水解液中葡萄糖的浓度为71.42g/L。玉米秸秆水解液经过10000rpm离心10min后作为培养基，以10％接种量接入黑曲霉(Aspergillus niger M276，购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)种子培养液，30℃液态发酵96h，转速200rpm，发酵液中葡萄糖酸浓度为70.6g/L，葡萄糖酸得率达到98％。
实施例2
将烘干的玉米秸秆与5％(w/w)浓度的稀硫酸溶液以2∶1的质量比混合 均匀，于190℃、1.2MPa的条件下预处理3min；将预处理后的物料直接加入到反应器中，调节固体含量至25％(w/w)，加入纤维素酶(用量为15FPU/gDM)，于50℃、150rpm的条件下糖化48h，糖化过程中用5M氢氧化钠控制pH在4.8。得到的玉米秸秆水解液中葡萄糖的浓度为75.36g/L。玉米秸秆水解液经过10000rpm离心10min后作为培养基，以10％接种量接入黑曲霉(Aspergillus niger M276，购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)种子培养液，30℃液态发酵168h，转速200rpm，发酵液中葡萄糖酸浓度为79.04g/L，对葡萄糖的转化率为95％。
本发明所涉及的纤维质原料不限于玉米秸秆，还可以为麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中的一种；木质纤维素处理物选自采用稀酸、蒸汽膨爆、液氨膨爆、生物法预处理后的麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。