可吸收煅烧骨的制备方法 所属技术领域
本发明可吸收煅烧骨的制备方法是一种可吸收双相煅烧骨的制备、涂层及细胞复合法，涉及一种钙磷陶瓷生物材料和骨组织工程的支架。背景技术
羟基磷灰石(HAP)是骨中的主要矿物成分，它有良好的生物相容性和骨传导性，并能与新生骨直接结合，因此多种不同结构和性状的HAP用不同的方法研制出来，用于修复骨骼中损伤的或病变的部分。但是HAP在体内太稳定而难以吸收，因为它显示与骨矿物质相似的晶体结构，倾向于与骨组织保持化学和生物学平衡。β-磷酸三钙(β-TCP)比HAP能更好地吸收和降解，但有学者报告它的降解速度太快而不利于新生骨的结合。研究显示一定比例的β-TCP/HAP双相陶瓷在修复骨缺损中比单一的陶瓷更有效。
人工合成的生物陶瓷往往因孔隙间的交通不足而影响骨组织进入材料深部。煅烧骨的孔隙与松质骨有相似的结构，有良好的孔与孔之间的交通，有利于成骨细胞、血管的长入，具有良好的传导成骨作用。传统方法制作地煅烧骨主要由HAP组成，虽HAP能直接与新生骨结合，但在体内难以吸收，从而影响了新生骨的后期重塑，并影响其生物力学的强度。因此有必要将煅烧骨中HAP部分或完全转化为β-TCP。
另外，未经表面改性的煅烧骨不利于细胞的贴附，材料表面改性的方法在文献中有用纤维连接素、胶原等促进细胞与材料的贴附。传统的方法单纯用胶原溶液浸泡煅烧骨，晾干后使用，细胞贴附也不好，需对煅烧骨的表面胶原涂层方法进行改进。
材料与细胞的复合方法是组织工程的难点，表面的贴附效率和密度是复合中要解决的难题，文献中有用纤维蛋白原等提高细胞在材料内部的聚集，材料和细胞的复合方法仍需改进。发明内容
本发明的目的在于：制备β-TCP/HAP双相煅烧骨或β-TCP煅烧骨，并对可吸收双相煅烧骨的制备方法进行改进，使其与细胞贴附好、提高细胞在材料内部的聚集。
本发明的目的可通过下述技术方案实现：一种可吸收的双相煅烧骨，可作为骨缺损的修复材料，HAP和β-TCP双相煅烧骨其以成年牛椎体骨为原料，如使用内径16-18mm的空心电钻，钻取椎体中心的松质骨，经处理后，通过浸渍(NH4)2HPO4溶液、经一次性煅烧和降低煅烧温度，将煅烧骨中的HAP部分或完全转化为β-TCP，其中煅烧温度为900-1300℃。本发明原理是：羟基磷灰石是骨的主要成分，当(NH4)2HPO4溶液(AP)液渗入牛煅烧骨(CBB)，其中的HPO42-离子加热后浓缩成P2O74-，P2O74-能与CBB的HAP的OH-反应，产生PO43-离子。(NH4)2HPO4溶液的浓度和煅烧的次数、温度及时间是决定β-TCP/HAP双相煅烧骨成分、含量和结晶度的重要因素。通过降低煅烧温度来降低结晶度，有利于材料的吸收。
在上述技术方案基础上，制备四种多用的煅烧骨，其β-TCP/HAP比例分别是4/6、6/4、8/2和10/0时，(NH4)2HPO4溶液浓度分别是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
在上述技术方案基础上，对煅烧骨及多孔材料采用胶原凝胶表面涂层，2-4mg/ml的胶原溶液经对pH为3.0去离子水配置的稀盐酸溶液在冷藏室内透析，涂层时与1/10体积的10倍浓度的PBS混合，37℃温育1小时。其原理是：胶原溶液交联成凝胶，胶原纤维贴于煅烧骨孔隙表面，有利于细胞的贴附，并消除对细胞的毒性及对机体的免疫原性。
经过表面涂层处理的双相煅烧骨可与细胞复合，细胞与煅烧骨及多孔材料的复合方法：收集骨髓间充质干细胞，让细胞悬液完全吸入材料内，培养箱中孵育2-5小时，加入含血清培养液，孵育3-8天后植入体内。解决了传统的材料与细胞的复合方法存在的缺陷，即细胞丢失多，细胞活力差，细胞密度底，本发明所述的煅烧骨与细胞的复合方法，可提高细胞在材料内部的贴附效率、密度和活性。
具体煅烧骨的制备：
松质骨的来源：取成年牛椎体或股骨头及股骨下端，用内径16-18mm的空心电钻钻取椎体中心或股骨下端的松质骨。牛椎体松质骨内部孔隙呈纵形小管，小管之间有侧孔相交通，抗压强度比较高，本发明优选椎体松质骨。股骨下端的松质骨的孔隙呈网状，但骨小梁较纤细，抗压强度较低。首先对原料预处理，目的是尽可能去除杂质、软组织、脂肪和骨髓。流水冲洗，蒸馏水漂洗，去离子水煮沸5-12小时，最佳时间是10小时，高压流水冲洗，去离子水漂洗2次，系列酒精脱水，烘干，温度为50℃-70℃，4天；其次，进行初次煅烧：在高温炉中煅烧，800℃，3小时，升温速率为5℃-10℃/分。该步骤可以省略，以简化步骤；再次进行浸渍：煅烧骨块浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小时，去除多余液体，50℃-70℃烘干4天。制备四种多用的煅烧骨(β-TCP/HAP比例分别是4/6、6/4、8/2和10/0)时的(NH4)2HPO4溶液浓度分别是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。再次煅烧：
在高温炉中900℃-1300℃，1-4小时，升温速率为5℃/分，自然降温。温度过高钙磷陶瓷的结晶度过高，材料不易吸收，最佳温度是1000℃。流水冲洗，去离子水漂洗2次，50℃-70℃烘干4天，高温消毒备用，图1β-TCP/HAP双相可吸收煅烧骨。胶原表面涂层：
可溶性胶原溶液，可购自Cohesion公司的Vitrogen牌胶原或罗氏公司及Sigma公司的可溶性胶原，也可从猪、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，pH2-4，浓度2-4mg/ml。透析可去除醋酸等对细胞有毒的物质，并有利于形成凝胶。取4-6℃冷藏可溶性胶原溶液，装入透析袋，对去离子水配置的稀盐酸溶液，pH为3.0，透析6-10天或以上，置于4-6℃冷藏室中，磁力搅拌，每100ml胶原溶液对1.5-2L的透析液，每两天换液一次，共2-3次。临用前从冰箱取出，与1/10体积的10倍浓度的PBS混合，立即将煅烧骨投入液中，抽真空，反复三次，或将混合液滴到煅烧骨上。37℃温育0.5-2小时，使胶原形成凝胶，超净台内晾干，去离子水冲洗2次，超净台内晾干，环氧乙烷消毒，如图2胶原表面涂层后的煅烧骨。
另一种涂层方法是：用pH为3.0去离子水配置的稀盐酸溶液调节胶原浓度为2mg/ml，用针头滤器超滤消毒，4-6℃冷藏。用前取出，与1/10体积的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即将高温消毒过的煅烧骨投入液中，37℃温育0.5-2小时，使胶原形成凝胶，放置于无菌培养皿内，打开盖子，超净台内紫外线照射干燥，无菌容器包装备用，可不需环氧乙烷消毒。上述两种胶原表面涂层方法也适合于其他多孔材料的表面涂层。细胞与材料的复合方法：
培养并收集骨髓间充质干细胞(BMSC)，用含血清a-MEM制成0.5-5×107个/1ml细胞悬液，滴入煅烧骨中，或将煅烧骨投入悬液中，抽真空，一个大气压，每次10-20秒，间隔5-15秒，反复三次，让细胞悬液完全吸入材料内。培养箱中孵育2-5小时，缓慢加入20-30ml含血清培养液，在37℃、5％CO2的条件下孵育3-8天后植入体内。该方法同样适合其他多孔材料与细胞复合。
本发明的优越性在于：可吸收双相煅烧骨可用于修复骨缺损、骨不连、脊柱融合，并可以作为骨髓基质干细胞及成骨细胞的载体，构建组织工程化人工骨，也可用此可吸收双相煅烧骨作为BMP的缓释载体修复骨缺损。经X线衍射分析：加0.3M，0.6M，1.0M和1.2M的AP液组制备的三种煅烧骨出现典型的β-TCP的波型，其中β-TCP/HAP比例分别是4/6，6/4，8/2和10/0，其中4/6如图3所示，X线衍射分析示浸渍AP液后的煅烧骨(中)出现典型的β-TCP和HAP的混合波型。扫描电镜观察：双相煅烧骨孔径和孔隙率均与松质骨相似，孔径约400-600μm，孔隙率约85％，均保留骨陷窝的结构，如图4，扫描电镜观察示双相煅烧骨孔径约400-600μm，孔隙率约85％，孔隙间交通良好(40×)。超微结构观察(2000-4000倍)见材料有蜂窝状微孔。双相煅烧骨比HAP煅烧骨孔隙率较高，微孔较大，约0.5-5μm，如图5超微结构观察见煅烧骨有蜂窝状微孔。双相煅烧骨比HAP煅烧骨孔隙率较高，微孔较大，约0.5-5μm(2000×)；生物力学测定：β-TCP的存在对煅烧骨的力学性能无明显影响，最大抗压强度：3.188±0.943，弹性模量：85.327±21.534。细胞在材料表面的贴附能力：扫描电镜下可见细胞在材料表面贴附良好，细胞呈扁平的梭形、多边形或多角形。表面涂层后，4小时细胞部分贴壁，24小时基本汇合；4天部分呈复层生长，如图6，表面涂层的煅烧骨与细胞复合后4天，细胞部分呈复层生长(200×)；8天呈复层生长，如图7，表面涂层的煅烧骨与细胞复合后8天，细胞呈复层生长(200×)；30天呈网状完全长满孔隙。复合后4-8天是植入的最佳时机。
裸鼠皮下诱导成骨试验：3周，煅烧骨加BMSC组可见煅烧骨表面有大量类骨质形成，以直接成骨为主，有少量软骨内成骨，如图8，裸鼠皮下诱导成骨试验，复合BMSC的煅烧骨植入后3周，可见煅烧骨表面有大量类骨质形成(100×)。5周材料表面成熟骨痂明显，与材料无明显界限，见图9，裸鼠皮下诱导成骨试验5周，材料表面成熟骨痂明显，与材料无明显界限(100×)。本发明表明双相煅烧骨与BMSC复合组织工程化人工骨有良好的诱导成骨作用，说明双相煅烧骨是BMSC的良好的载体。
吸收时间：6个月时β-TCP/HAP比例分别是4/6的吸收率约40％，1年时吸收60％。β-TCP/HAP比例分别是8/2的吸收率6个月约70％，1年时完全吸收，该比例符合骨折愈合的需要。附图说明
图1 β-TCP/HAP双相可吸收煅烧骨
图2 胶原表面涂层后的煅烧骨
图3 X线衍射分析示浸渍AP液后的煅烧骨(中)出现典型的β-TCP和HAP的混合波型
图4扫描电镜观察示双相煅烧骨孔径约400-600μm，孔隙率约85％，孔隙间交通良好(40×)
图5超微结构观察见煅烧骨有蜂窝状微孔。双相煅烧骨比HAP煅烧骨孔隙率较高，微孔较大，约0.5-5μm(2000×)
图6表面涂层的煅烧骨与细胞复合后4天，细胞部分呈复层生长(200×)
图7表面涂层的煅烧骨与细胞复合后8天，细胞呈复层生长(200×)
图8裸鼠皮下诱导成骨试验 复合BMSC的煅烧骨植入后3周，可见煅烧骨表面有大量类骨质形成(100×)
图9裸鼠皮下诱导成骨试验 5周，材料表面成熟骨痂明显，与材料无明显界限(100×)具体实施方式
1.煅烧骨制备：
方法1：取成年牛椎体骨，用内径16-18mm的空心电钻钻取椎体中心的松质骨，圆柱形。流水冲洗，蒸馏水漂洗，蒸馏水煮沸10小时，中间换液数次，流水冲洗，去离子水漂洗2次，系列酒精脱水，50℃烘干4天。在高温炉中煅烧，800℃，3小时，升温速率为10℃/分。煅烧骨块浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小时，去除多余液体，50℃烘干4天。再次在高温炉中煅烧，1100℃，1小时，升温速率为5℃/分，自然降温。流水冲洗，去离子水漂洗2次，50℃烘干4天，高温消毒备用。制备四种多用的煅烧骨(β-TCP/HAP比例分别是4/6、6/4、8/2和10/0)时的(NH4)2HPO4溶液浓度分别是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
方法2：取成年牛椎体骨，用内径16-18mm的空心电钻钻取椎体中心的松质骨。流水冲洗，蒸馏水漂洗，蒸馏水煮沸10小时，流水冲洗，去离子水漂洗2次，系列酒精脱水，50℃烘干4天。骨块浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小时，倾去多余液体，50℃烘干4天。在高温炉中煅烧，1000℃，3小时，升温速率为5℃/分，自然降温。流水冲洗，去离子水漂洗两次，50℃烘干4天，高温消毒备用。制备四种多用的煅烧骨(β-TCP/HAP比例分别是4/6和8/2和10/0)时的(NH4)2HPO4溶液浓度分别是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
2.胶原表面涂层：可溶性胶原溶液，可购自Cohesion公司的Vitrogen牌或罗氏公司可溶性胶原，也可从猪、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，PH3，2-4mg/ml。取4-6℃冷藏可溶性胶原溶液，装入透析袋(预煮沸30分钟消毒并脱甘油)，对pH为3.0去离子水配置的稀盐酸溶液透析8天，置于4-6℃冷藏室中，磁力搅拌，100ml胶原溶液对1.5L的透析液，每两天换液一次，共三次。临用前从冰箱取出，与1/10体积的10倍的PBS混合，立即将煅烧骨投入液中，抽真空，反复三次，或将混合液滴到煅烧骨上。37℃温育1小时，使胶原形成凝胶，超净台内晾干，去离子水冲洗2次，超净台内晾干，环氧乙烷消毒。
另一种涂层方法是：用pH为3.0去离子水调节胶原浓度为2mg/ml，用针头滤器超滤消毒，4-6℃冷藏。用前取出，与1/10体积的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即将高温消毒过的煅烧骨投入液中，37℃温育1小时，使胶原形成凝胶，放置于无菌培养皿内，打开盖子，超净台内紫外线照射干燥，无菌容器包装备用，可不用环氧乙烷消毒。
3.细胞与材料的复合方法：培养并收集骨髓间充质干细胞，用含血清a-MEM制成2×107个/ml细胞悬液，滴入煅烧骨中，或将煅烧骨投入悬液中，抽真空，一个大气压，每次15秒，间隔10秒，反复三次，让细胞悬液完全吸入材料内。培养箱中孵育4小时，缓慢加入20ml含血清a-MEM或D-MEM，在37℃、5％CO2的条件下孵育4-8天后植入体内。