具有血管生成抑制活性的杂合肽 本发明总地涉及肽化学领域。更具体地说，本发明涉及具有血管生成抑制活性的新的杂合肽，含有该杂合肽的药物组合物，以及所说的杂合肽在生产用于治疗毛细血管生成相关疾病的药物中的应用。
血管生成是正常机体活动(如组织再生、机体发育和伤口愈合)所必需的，并受到高度调节的生命基本过程。虽然目前对这一过程的确切机理尚不完全了解，但据信其中包括了某些刺激或抑制内皮细胞生长的分子间的复杂相互作用。在正常条件下，这些分子可使微血管形成系统维持在静止状态(即毛细血管非生长状态)长达数周至数十年。然而，当必要时(如伤口愈合期间)，这些构成毛细血管内壁的基本细胞可以迅速增殖并在5天内更新(Folkman，J.andShing，Y.，The Journal of Biological Chemistry 267(16)：10931-10934；Folkman，J.and Klagsbrun，M.，Science 235：442-447(1987))。
在正常条件下，血管生成是一个受到严格调节的过程，但如果这一过程持续失控，则会加速许多疾病(即所谓“血管生成性疾病”)的发展。换句话说，失去控制的血管生成可直接引起疾病或加重某些已有的病理条件。例如，眼的神经血管生成就是失明和许多眼病的主要原因。在某些已有的病理条件如关节炎的发病过程中，新生成的毛细血管可侵入关节内部并破坏软骨组织。在糖尿病发展过程中，视网膜内新生地毛细血管可侵入玻璃体，并进而导致眼底出血和失明。实体肿瘤的生长和转移也依赖于血管生成(Folkman，J.，Cancer Institute 82：4-6(1989)；Folkman，J.，Cancer Reserch 46：467-473(1986))。例如，已有证据显示，肿瘤长大到超过2mm大小，就必须通过诱导新的毛细血管生长而得到其自身的血液供应。一旦这些新的血管被埋在肿瘤中，便为肿瘤细胞进入血循环和远距离转移提供了必要的条件(Weidner，N.et al.，The EnglandJournal of Medicine 324(1)：1-8(1991))。
近年来，随着人们对血管生成在某些疾病发生和发展中的作用的不断深入认识，目前已逐步建立了一种新的疾病治疗方法，即具有广泛的潜在应用价值和前景的抗血管生成疗法。
可望应用抗血管生成疗法治疗的疾病包括肿瘤、动脉硬化、肥胖症、关节炎、十二指肠溃疡、心血管疾病以及因糖尿病引起的异常眼神经血管生成(Folkman J.，Nature Medicine 1：27(1995)).
迄今为止，已发现并深入研究了多种具有抑制体内神经血管生成活性的天然血管生成因子。其中血小板反应蛋白1(TSP-1)是一种具有体内抑制神经血管生成活性的大分子量(MW 450 KDa)基质蛋白质。TSP-1的大部分血管生成活性归因于分子中心部分的70KDa柄区域。Tolsma等人(Tolsma，et al，J.Cell Biol.122：497(1993))曾制备了模拟TSP-1该区域内备解素样重复区1序列的19mer合成肽Ser-Pro-Trp-Ser-Ser-Ala-Ser-Val-Thr-Ala-Gly-Asp-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg，并将其定名为Mal II。作者的研究证明，Mal II可阻断活体大鼠角膜内神经血管生成，并可在体外抑制培养的内皮细胞的迁移(半有效剂量为1μM)。
另一方面，O’Reilly等人已从带瘤小鼠的血清和尿中分离并纯化了一种38KDa蛋白质(O’Reilly，M，et al，Cell79：315-328(1995)；国际专利WO95/29242)。对这种内皮细胞生长抑制剂的微序列分析显示，该肽的氨基酸序列与纤溶酶原(小鼠)的一个内部片段有98％序列同源性。这种称为血管生成抑制素的肽片段包括了鼠纤溶蛋白的前4个Kringle区域。研究证明，含有Kringle 1-4区域的人纤溶蛋白肽片段也表现有很强的体外和体内抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。
目前正在进行抗血管生成性疾病应用研究的几种血管生成抑制剂，均有其各自的缺点。例如这些血管生成抑制剂中，有的生产成本很高，而且为达到治疗效果所需剂量过大，从而导致病人难以承受相应的经济负担；有的药物则可引起较严重的全身性毒性，因而大大限制了它们作为药物的应用。因此，有必要提供一种使用安全的，并可选择性地抑制肿瘤细胞增殖，同时对正常细胞(即非肿瘤细胞)没有或只有很低毒性的血管生成抑制剂。这样的化合物也应是易于生产且生产成本相对较低的。
本发明的一个目的是提供具有下列一级结构并表现有显著的血管生成抑制活性的杂合肽，或其医学上可接受的盐或功能等同物：
A-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-X-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Cys-B(I)或
A-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-X-Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Gln-Cys-Ala-Ala-Pro-Ser-Phe-B(II)其中A代表H或N保护基团；B代表NH2或任何一种碱性氨基酸；并且X代表含有5-60个氨基酸的空间臂或接头基团。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的空间臂是相当于Kringle 5片段中氨基酸454-514的不同长度的肽片段。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的接头基团是能够连接其C端和N端两个片段并维持它们的固有构型的，含有3-10个相同或不同氨基酸的共价或非共价基团。
本发明的另一个目的是提供以常规固相或液相化学合成，或DNA重组技术生产如上限定的短肽或其盐或功能等同物的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于治疗血管生成相关疾病的药物组合物，该组合物除含有作为基本活性成分的上述短肽或其盐或其功能等同物及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂外，还可含有一种或多种与所说的短肽有协同或辅助作用的其他非肽类化合物。
本发明的再一个目的是提供如上限定的短肽在生产用于治疗肿瘤、关节炎、异常眼神经血管生成、动脉硬化、肥胖及十二指肠溃疡的药物中的应用。
本发明涉及具有下示氨基酸序列的杂合肽或其盐或其功能等同物：
A-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-X-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Cys-B(I)或
A-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-X--Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Gln-Cys-Ala-Ala-Pro-Ser-Phe-B(II)其中A代表H或N保护基团；B代表NH2或任何一种碱性氨基酸；并且X代表含有5-60个氨基酸的空间臂或接头基团。所说的空间臂是相当于Kringle 5片段氨基酸454-514的不同长短的肽片段，且所说的接头基团是能够连接任何两个片段的，含3-10个氨基酸，特别是多聚赖氨酸的共价或非共价基团，从而使其两端所连接的肽片段保持其固有的空间构型。
本发明的短肽基本上是由两个借助上述空间臂或接头基团连接的，或直接连接的肽片段组成的。其中N末端片段是已知具有神经血管生成抑制活性的19mer合成肽(即所谓Mal II，参见Tolsma etal.，J.Cell Biol.，122：497(1993))的(C端)活性部分；而C末端部分则是相当于同样具有神经血管抑制活性的哺乳动物纤溶酶原分子之第5个部分(即所谓“Kringle 5”)中的第513位(Arg)至第524位(Cys)氨基酸(I)，或第535位(Tyr)至545位(Ser)氨基酸(II)片段。因此可以认为，本发明的短肽是由包括模拟血小板反应蛋白1(TSP-1)之中心柄区域的合成肽和Kringle 5区域之活性肽片段组成的杂合肽。
本文中所使用的术语“19mer合成肽”是指由Tolsma等人合成的包含19个氨基酸的肽片段。如前所述，该肽片段是模拟TSP-1分子中心部分70KDa柄区域内的备解素样重复区1的序列，即所谓的Mal II(19mer)片段。在本发明中，构成本发明杂合体短肽之N末端部分序列实质上是该19mer片段的后半部分，即氨基酸序列为Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg的七肽亚片段(SEQ ID NO：1)。
本文所使用的术语“Kringle 5”是指哺乳动物纤溶酶原分子的第5个区域所限定的，借助其中的三个二硫键维持特定的三维空间构象的哺乳动物纤溶酶原区域(这三个二硫键均限制在第462至536位氨基酸范围内)。
术语“含5-60个氨基酸的空间臂”是指实质上与哺乳动物纤溶酶原的相应肽片段同源的，含10至60个氨基酸的Kringle 5肽片段，即相当于Kringle 5片段中氨基酸454至5 14的不同长度的片段(SEQID NO：4)。该片段的N末端大约是完整哺乳动物纤溶酶原的第454位氨基酸，而其C末端则相当于大约第514位氨基酸。或者，在本发明的短肽序列中，不存在这样的Kringle 5(5-60个氨基酸)肽片段，而代之以连接N端Mal II亚片段(氨基酸13-19)和C端Kringle5亚片段(I)(氨基酸513-524)(SEQ ID NO：2)，或Kringle 5亚片段(II)(氨基酸535-545)(SEQ ID NO：3))的，有足够长度的“接头基团”。这样的接头基团可以是多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、多聚半胱氨酸、多聚谷氨酸或多聚天冬氨酸。接头基团最好是由3至10个带有惰性侧链的氨基酸构成的。
本文中使用的术语“杂合肽”是指含有20至80个氨基酸残基的血管生成肽。其中每个氨基酸残基都是与第一个血管生成蛋白的“血管生成同源区域”(AHR)(即不同血管生成蛋白之间共有的，或实质上保守的大约25个氨基酸的区域)中相应位置上的氨基酸残基相同的或结构相关的，而该杂合肽的其他氨基酸残基则是与第二个血管生成蛋白的AHR中相应位置上的氨基酸残基相同的。
本文中使用的术语“功能等同物”是指使用具有相似带电性和极性，并具有相同或不同构型的氨基酸经取代、加入或缺失而得到的，与本发明的杂合肽具有相同或相似功能的氨基酸片段。
根据本发明的一个实施方案，所说的杂合肽以直接或通过所说的空间臂或接头基团串联连接，或串联重复连接而形成的短肽。这样的杂合肽例如可以是“TSP-1/Kringle 5杂合肽”、“TSP-1/内皮抑制素杂合肽”、“TSP-1/血管生成抑制素杂合肽”、“内皮抑制素/血管生成抑制素杂合肽”、“内皮抑制素/Kringle 5杂合肽”等。本发明优选的血管生成杂合肽是具有如上所示氨基酸序列的TSP-1/Kringle 5杂合肽(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)。
本发明的杂合肽C末端或N末端或两者可以是羧酸保护基团或胺保护基团取代的，并且优选的保护基团应是有利于向细胞输送所说肽(例如通过降低肽的亲水性并提高亲脂性)的基团。另外，保护基团应是对肽链的形成条件稳定的，同时可在不破坏正在延伸的肽链的情况下易于除去的。适当的保护基团包括9-芴甲基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羧基(Boc)、苄氧基羧基(Cbz)、联苯异丙基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧苄氧基羰基，以及2-氰基-叔丁氧羰基等。其中优选的是9-芴甲基羰基(Fmoc)。
可以使用上述C或N末端保护基团，按照本领域已知的固相肽合成技术合成本发明的杂合肽(例如参见Steward，J.M.and Young J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.(1984))。在固相肽合成方法中，首先将C末端氨基酸连接到一个适当的固相载体或树脂上。用于合成C末端羧基肽的的优选的固相载体是4-羟甲基苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。用于C末端酰胺的优选固相载体是4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧乙酰胺乙基树脂(Apllied Biosystem Co.)。可借助N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)或2-(1-氢-1-苯并三唑基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)使C末端氨基酸偶联到树脂上(50-100℃，在二氯甲烷或DMF溶剂中反应1至24小时)。当固相载体是4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基树脂时，应在与上述C末端氨基酸偶联之前用哌啶等仲胺将Fmoc基团裂解掉。可以使用邻苯三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1当量)在DFM中与去保护的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基树脂偶联。
当固相合成结束时，可以用裂解试剂(例如苯甲硫醚、水、乙二硫醇及三氟乙酸)处理树脂结合的多肽，以从树脂上去掉合成的肽并使之去保护。如果肽的C末端是烷基酰胺，可以用烷基胺进行氨解以裂解出树脂。或者，可以用乙醇进行转酯处理以去除多肽，然后再进行氨解或直接进行转酰胺基处理。可以使用上述的几种裂解剂除去侧链保护基团。
可以使用离子交换层析、亲水吸附层析、硅胶吸附层析、分配层析、高效液相层析(HPLC)，特别是反相HPLC等一系列层析步骤纯化完全去保护的合成肽。
可使用配有120A分析仪的Applied biosystems 477A型蛋白质序列仪，以自动Edman化学法分析纯化的肽的氨基酸序列。可使用激光解吸和电喷射质谱法测定各肽序列的分子质量。
或者，当在本发明杂合肽结构中，X代表含有5-60个相当于纤溶蛋白Kringle 5片段的氨基酸454至514，致使该杂合肽含有50-80个以上氨基酸的情况下，也可使用常规DNA重组技术制备所说的杂合肽。例如可以基于待表达的多肽片段的氨基酸序列，合成编码该多肽片段的多核苷酸序列(cDNA)；然后使用适当的引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增相应的DNA序列；将编码杂合肽的多核苷酸克隆到适当的表达载体(如pBR322、pUC等)中，然后在适当的原核或真核细胞宿主中表达之。最后可使用常规方法从培养液或宿主细胞包含体中分离并纯化所需的多肽。
基本上按照Polverini，P.J.等人所述的内皮细胞迁移试验法(参见Polverini，P.J et al，Methods Enzymol.，198：440-450(1991))，检测本发明的杂合肽对体外内皮细胞(牛毛细血管内皮细胞，BSE)迁移的影响(参见实施例3)。同时，基本上按照Lingen等人所述的内皮细胞增殖试验法(参见Lingen，et al，Laboratory Investigation74：476-483(1996))，检测本发明的杂合肽对体外内皮细胞(牛毛细血管内皮细胞，BSE)增殖能力的影响(参见实施例4)。这些体外初步试验结果表明，本发明的包括TSP-1的AHR小片段和Kringle5内部小片段的杂合肽，可在体外以剂量依赖方式显著地抑制BSE细胞的迁移和增殖，其半数有效浓度分别为250pM和125nM。
在上述体外试验的基础上，本发明人进一步观察了杂合肽对小鼠移植瘤(B16黑色素瘤细胞)生长速度的影响。初步实验结果显示，本发明的杂合肽可在体内抑制带瘤动物的肿瘤生长，并且其抑瘤作用明显高于单纯的TSP-1小片段或单纯的Kringle 5内部小片段(p＜0.01或p＜0.05)(数据未示出)。
本发明的杂合肽基本上是由已知具有血管生成抑制活性的，分别来自血管生成蛋白质TSP-1中心柄区域模拟肽和纤溶蛋白Kingle5区域的内部序列的小片段以串联方式连接而成的。
虽然目前尚不知道其确切的作用机理，但我们的实验观察令人惊奇地发现，本发明制得的上述不同来源的小片段(即所说的AHR区域)直接或借助适当的接头基团串联连接而成的杂合肽，确实具有明显优于任何一个由之来源的单一小片段的抗血管生成活性。因此，本发明的杂合肽作为一种抗血管生成剂，其可用于治疗多种与神经血管过度生长有关的疾病，这些疾病或病理条件包括肿瘤、心血管病(如动脉硬化)、肥胖、骨关节炎、十二指肠溃疡，以及与糖尿病有关的异常眼神经血管生成等。
可以将本发明的杂合肽制成无机酸或有机酸盐，这些盐包括但不只限于盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐，以及乙酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、酒石酸盐等有机酸盐，从而可得到水或油溶性的或可分散的药物产品。
可以按照医药工业中已知的方法(如参见Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.1990)，将本发明的杂合肽与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂相混合，制成适于经胃肠道或胃肠道外途径给药的各种不同剂型的药物组合物。医药上可接受的载体包括无毒性的并且对活性成分没有干扰作用的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊包裹材料或任何类型的配方辅助剂。所制得药物组合物可以经胃肠道外、口服及局部等途径给药。
胃肠道外途径包括静脉内、肌肉内、体腔(如腹腔、胸腔或脑脊髓腔)及器官腔(如鼻腔、口腔、直肠、阴道或子宫腔)内，以及皮内、皮下或眼内等给药途径。为了经胃肠道外给药，可将本发明的杂合肽溶解在水、盐水、右旋糖溶液、乙醇或油中制成溶液或悬浮液。所使用的载体也可以包括防腐剂、混悬剂、增溶剂、缓冲剂等其他成分。当化合物(肽)以鞘内途径给药时，也可将其溶解在脑脊液中。
为了口服或经粘膜给药，可以将本发明的杂合肽或其药物组合物制成胶囊剂、丸剂、片剂、驰剂、粉末剂、悬浮剂或乳剂形成的固体或液体制剂。可使用水、乙二醇、油、醇、香味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等载体或辅助成分制备液态口服制剂(如溶液、悬浮液和驰剂)；或使用淀粉、糖、造粒剂、固体稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等载体或辅助剂制备固态口服制剂(如粉末剂、片剂、栓剂和胶囊剂)。必要时，可使用微胶囊或脂质体包裹活性成分，制成能够通过胃肠道或血脑屏障的稳定制剂(如参见国际专利WO 86/11698)。
本发明的药物组合物的给药剂量一般为0.0001至200mg/kg/天，每天可以以亚剂量形式分几次给药。但确切的用药剂量应根据待治疗疾病的性质、疾病严重程度、病人的年龄和身体一般状况，以及给药途径等因素由临床医生决定。
本发明的化合物或其药物组合物可用于预防或治疗原发或转移的各种实体瘤或造血系统细胞恶性增生性疾病。当用于预防肿瘤转移时，可单独或与肿瘤放疗或化疗联合使用。例如可在实体瘤放射治疗后，联合使用本发明的肽化合物和一种或几种常规肿瘤化疗药物。或者，在经过手术、放疗及化疗后，继续使用本发明的肽化合物，以清除体内可能存在的微小肿瘤转移灶，或稳定并抑制任何残存的原发肿瘤。
最后，还可将假单胞菌外毒素(PE40或PE60)、白喉内毒素、蓖麻毒素或霍乱毒素等细胞毒性剂连接到本发明的杂合肽或其片段上，从而提供一种能够定向破坏或杀伤与TSP-1或Kringle 5肽结合的细胞的手段。可以使所说的与细胞毒性剂连接的肽最大可能的达到预定部分。例如可通过插管使蓖麻毒素连接的高亲合性TSP-1和/或Kringle 5片段直接被递送到靶位点，或进入通向靶位点的血管内。据信这种方法将特别适用于抑制转移瘤的生长。
下列实施例旨在进一步举例描述而不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的原则和基本精神的前提下，对本发明的所有技术环节所作的任何改动或改变，均将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1：N-Ac-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Cys-NH2的合成
将Arg(Pmoc)肽合成柱(Advenced ChemTech)放在AdvencedChemTech 90肽合成仪的肽合成柱位置上。按照下列合成循环依次加入标题肽片段中所示的氨基酸：
1、首先用二甲基甲酰胺(DMF)使树脂溶剂化(5分钟)；
2、使用溶于DMF中的哌啶处理5分钟，以从氨基酸功能集团上除去Fmoc保护基团；
3、用DMF洗5分钟；
4、使用溶于DMSO-NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的0.2M HBTU(75μM)溶液和溶于DMSO-NMP中的0.4M二异丙基乙胺(150μM)溶液，活化所得到的Fmoc保护的氨基酸(75μM)；
5、使活化的Fmoc保护的氨基酸偶联到DMF中树脂结合的氨基酸上；
6、重复上述步骤3至5，依次连接序列中所示的Fmoc保护的氨基酸；
7、通过上述步骤4和5的条件，使乙酸偶联到树脂结合的肽的N末端；
8、最后用DMF洗30分钟。
合成完成后，用四氢呋喃(THF)洗树脂(5分钟)以除去DMF，然后在氩气和氮气环境下风干树脂，从而得到树脂结合的肽。
将树脂结合的肽与预制备(-5至-10℃保存)的裂解试剂(经依次混合700μl苯甲硫醚，50μl水，50μl乙二硫醇和1.8ml三氟乙酸而制到)的混合物于大约0℃下搅拌约15分钟，再于室温下继续搅拌约100分钟。然后滤出树脂并用纯净的三氟乙酸淋洗。将滤出并洗过的树脂按每份0.5ml加到含有约8ml二乙醚的离心管内，离心所得到的悬浮液后，除去上清。可多次重复该过程直到所有的肽均被沉淀出来。用乙醚洗沉淀的滤液，然后风干并冷冻干燥之。
裂解完成后，使用Symmetry Prep C18柱以HPLC方法纯化如上得到的粗肽(用5-100％乙腈梯度经60分钟洗脱)，然后冷冻干燥如此纯化的肽(约30mg)。
实施例2：H-Ac-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-Thr-Cys-Asp-Val-Pro-Glu-Cys-Ala-Ala-Pro-Ser-Phe-NH2的合成
基本上按照实施例1中所述方法，并使用Pmoc-Phe做第一位氨基酸，制备具有标题化合物所示序列的合成肽。
实施例3：杂合肽对体外内皮细胞迁移的影响
基本上按照Polverini等人(Polverini，et al，Mothods Enzymol.，198：440-450(1991))所述的方法完成体外内皮细胞迁移试验，观察本发明的杂合肽对体外内皮细胞迁移的影响。
简单地说，首先使牛毛细血管内皮细胞(BCE)在含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培养基中饥饿过夜。然后用胰酶消化以收获细胞，并将所收获的细胞按1.5×106细胞/ml的浓度重新悬浮在含0.1％BSA的DMEM培养基中。将细胞加入到48孔改良的Boyden分隔室(Nucleopore Corporation)底部，然后装配并倒转分隔室，以使细胞附着(37℃，2小时)到已在0.1％明胶中浸泡过夜并风干的聚碳酸趋化膜(5μm孔径)上。然后再次倒置隔离室，将试验化合物加到上室腔内(总体积50μl)，并将装置37℃保温4小时。保温后回收趋化膜，固定并染色后计数已迁移到上室腔的细胞数目(共计数10个高倍视野)。减去进入培养基内的本底迁移数后，结果以每10个高倍视野可见的迁移细胞数目表示，本发明的杂合肽对细胞迁移的抑制以半数抑制浓度(IC50)表示。结果如下列表1所示。
表1本发明的杂合肽对内皮细胞迁移的影响肽 IC50(nM)TSP-1模拟肽亚片段 10Kringle 5肽内部亚片段 7杂合肽 0.7
从表1所示数据可以看出，本发明的基本上由TSP-1模拟肽亚片段和纤溶蛋白Kringle 5的内部序列亚片段，连接而成的杂合肽能够显著地抑制体外内皮细胞的迁移，而且这种抑制作用是剂量依赖性的(数据未示出)。另外，与单独的TSP-1模拟肽亚片段和Kringle5内部亚片段相比，本发明的杂合肽显著地提高了体外抑制内皮细胞迁移活性(分别提高13和10倍)。
实施例4，杂合肽对体外内皮细胞增殖的影响
基本上按照Lingen等人(Lingen，et al.，LaboratoryInvestigation，74：476-483(1996))所述的方法完成体外内皮细胞增殖试验，观察本发明的杂合肽对体外内皮细胞增殖的影响。
实验使用非放射活性细胞增殖试验药盒(Promega Co.)进行。简单地说，首先将牛毛细血管内皮细胞(BCE)悬浮在含有10％胎牛血清和1％BSA(Gibco BRL)的DMEM培养基中，并以每孔约1000个细胞的密度铺敷在96孔滴定板的各小孔内。37℃保温8小时后，使细胞在含有0.1％BSA的DMEM中饥饿过夜，然后再换成含有特定浓度(0.1-500nM)的本发明杂合肽或阳性对照肽，并且加或不加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，5ng/ml)的培养基，并维持培养8小时(37℃)。以未刺激的细胞(即未加bFGF)作为基线，并以单纯bFGF刺激的细胞作为最大增殖，对试验数据进行必要的校正。结果以本发明的杂合肽和阳性对照肽抑制BCE细胞增殖的半数有效剂量(ED50)表示，并示于下列表2中。
表2 本发明的杂合肽对内皮细胞体外增殖的影响肽 ED50TSP-1模拟肽亚片段 250nMKringle 5肽内部亚片段 125nM杂合肽 5nM
从上列表2中所示数据可以看出，本发明的基本上由TSP-1模拟肽亚片段和纤溶蛋白Kringle 5内部亚片段连接而成的杂合肽，能够显著地抑制体外内皮细胞的增殖，而且这种抑制作用是剂量依赖性的(数据未示出)。另外，与单独的TSP-1模拟肽亚片段和Kringle 5内部亚片段相比，本发明的杂合肽显著地提高了体外抑制内皮细胞增殖的活性(分别提高50倍和25倍)。
序列表
(1)一般信息
(iii)序列数：6
(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：1：
Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg
(2)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
(A)长度：12氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：2：
Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Cys
(2)SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征
(A)长度：12氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：3：
Trp-Cys-Asp-Val-Pro-Gln-Cys-Ala-Ala-Pro-Ser-Phe
(2)SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征
(A)长度：60氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：4：
Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-Cys-Met-Phe-Gly-
Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lyr-Arg-Ala-Thr-Thr-
Val-ThT-Gly-Thr-Pro-Cys-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-
Gln-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-
Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Cys-Arg
(2)SEQ ID NO：5的信息
(i)序列特征
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：5：
Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-
Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Cys
(2)SEQ ID NO：6的信息
(i)序列特征
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽片段
(iii)序列描述：SEQ ID NO：6：
Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-
Trp-Cys-Asp-Val-Pro-Gln-Cys-Ala-Ala-Pro-Ser-Phe