一种能特异性杀灭EB病毒相关肿瘤的重组病毒及其构建方法 本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能在Epstein-Barr病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞内增殖及表达晚期基因，而在Epstein-Barr病毒阴性正常细胞内不增殖及不表达晚期基因的重组溶细胞性病毒，及其构建和增殖的方法。
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
人类肿瘤大约15％与病毒有关，数种与人肿瘤相关的病毒在肿瘤细胞内潜伏感染，而在正常细胞中则潜伏感染率非常低及病毒负荷很小。如Epstein-Barr病毒(按常规简称EB病毒，记为EBV，下同)在Barkitt’s淋巴瘤和未分化鼻咽癌所有细胞内均可潜伏感染，其病毒基因EBNA-1在上述肿瘤细胞中均表达，而在正常细胞中则非常低，其外周血中单个核细胞中阳性率为10-5-10-6，在成人其它正常细胞中几乎均呈阴性。又如HPV病毒在90％宫颈癌细胞均可潜伏感染，其宫颈癌细胞通常均表达HPV病毒的E6及E7基因，而这种基因在正常细胞中表达率极低或阴性。因此，在与这种病毒相关的肿瘤病人中，其病毒蛋白可作为非常好的肿瘤标记。人们已将这些肿瘤细胞上的病毒蛋白作为免疫治疗的特异性靶目标，但由于在肿瘤发生及发展过程中，为逃避免疫监控，肿瘤细胞发生很多变化，如很多肿瘤细胞MHC1类基因表达及抗原提呈能力下调，缺乏免疫细胞刺激的第二信号，因而不能有效激活细胞毒T细胞来杀灭肿瘤细胞，因此在临床上免疫治疗疗效并十分不理想。
基因治疗是近年兴起地一种新的治疗恶性肿瘤方法。其基因转染方法分病毒法及非病毒法两种。病毒法通常采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及痘苗病毒。逆转录病毒在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏低，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体，存在癌变的可能性的缺点。腺相关病毒具有转染分裂及静止细胞的能力，能持久的表达。非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。腺病毒是目前肿瘤基因治疗中最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，具有容易生产及纯化的特点，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性。
目前肿瘤基因治疗的主要障碍是不能有效地将目的基因特异性转染所有的肿瘤细胞，而基因治疗的疗效与肿瘤细胞受基因转染的数量密切相关，因此，研究与发展特异性转染所有肿瘤细胞的病毒载体系统在肿瘤基因治疗中至关重要。
近年来，国际上兴起了肿瘤特异性增殖的病毒的研究，根据肿瘤细胞与正常细胞某些生物学特性的差异，经过改造的病毒只能特异性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，然后释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，由于病毒能够弥散到全身各个组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤，而不影响正常细胞。
典型的例子有三个，第一个为E1B 55Kda蛋白失活的腺病毒ONYX-015，其主要机理为：很多研究者发现P53在肿瘤癌变过程中起很大作用，P53突变或失活可使DNA损伤的细胞继续分裂及复制，当其它基因也产生突变时就可能发生癌变。P53也是宿主细胞抗病毒的主要蛋白，在正常细胞中病毒感染细胞后即可激活P53，如腺病毒增殖所必需的基因E1A区可导致细胞异常增殖并同时激活P53，最终导致细胞凋亡，使病毒复制终止。然而在极大多数情况下，正常细胞感染腺病毒后并没有出现立即凋亡，主要原因腺病毒尚存在着关闭激活P53功能的蛋白即E1B 19Kda和55Kda两个蛋白，前者作用于P53下游，阻止细胞凋亡，后者与P53结合阻止P53激活，因此野生型腺病毒能在正常细胞内生存并复制增殖。当腺病毒缺乏E1B区55Kda的蛋白，在正常细胞内由于P53具有正常功能，因此，很快被激活，从而使细胞凋亡，使腺病毒不能得到有效的复制及增殖，从而使感染终止，而在P53突变或失活的肿瘤细胞中，病毒感染后，P53不能被激活，因此缺乏E1B的腺病毒，仍能复制及增殖，使病毒在肿瘤细胞内大量复制，最终导致肿瘤细胞溶解死亡，并释放新的病毒感染其它肿瘤细胞，这使所有肿瘤细胞均受感染并死亡。在体内及体外ONYX-015对P53突变与功能异常的肿瘤均具有明显疗效，同时发现ONYX-015和化疗药物5-氟脲嘧啶(5-Fu)顺铂具有明显的协同作用。1999年3月已结束II期临床试验，对于30例常规治疗后无效的头颈部肿瘤病人，应用该病毒联合常规化疗，结果表明：19例肿瘤缩小一半以上(占63％)，其中8例肿瘤完全消退(占27％)，仅有17％病人无效，到目前已随访1-11月，无一例复发，且无明显的毒性作用(1.Bischoff JR，Kirn DH，Williams A，et al.Anadenovirus mutant that replicaties selective in p53-deficientes humancells.Science 1996，274，373-376.2.Heise C，Sampson-Johannes A，Williams A，et al.Onyx-015，an E1b gene-attenuated adenovirus，causestumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmentedby standard chemotherapeutic agents.Nature Medicine，1997，3，639-645.3.McCormic k.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,801,029.4.McCormick.Cytopathic for therapyand prophylaxis of neoplasia.1997，United States Patent 5,677,178.5.McCormick.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,846,945.6.McCormick.Cytopathic fortherapy and prophylaxis of neoplasia.1999，United States Patent5,856,181)。
另一个成功的例子来自对单纯疮疹病毒的研究。单纯疮疹病毒具有明显的嗜神经细胞特性，在静止细胞中其核糖核苷酸还原酶和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSV-TK)为病毒DNA复制所必需的基因，这在快速生长的细胞中如肿瘤细胞病毒DNA复制则不需要上述两个基因，这是因为在快速生长的细胞存在着足够数量的核苷酸，因此，在缺乏HSV-TK的情况下也可以使病毒复制，由于正常中枢神经细胞处于静止期，颅内肿瘤细胞则处于生长期。因此，Martuza RL等人应用缺失HSV-TK的单纯性疮疹病毒来治疗胶质瘤，其在体外也有效溶解生长的胶质瘤细胞。在裸鼠体内应用该病毒直接注射胶质瘤细胞或其它中枢神经系统肿瘤可使病毒明显繁殖，并抑制肿瘤生长。这个实验随后被其它研究组在免疫功能正常的大鼠9L胶质癌模型中证实。1998年开始进行I期临床试验(Mineta T，Rabkin SD，YazakiT，ea al.Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for thetreatment of malignant gliomas.Nature Med，1995，1，938-943)。第三个例子来自Rodriguez R等报告，应用前列腺特性抗原(PSA)启动子插入腺病毒5型增殖所必需基因(E1A)上游区，命名为CN706，该病毒的E1A基因表达受PSA起动子的严格控制，在分泌PSA的前列腺癌的细胞株LNCaP中，E1A基因表达下降99％，其腺病毒则增殖能力明显减少，所产生的病毒滴度比分泌PSA的前列腺癌细胞株LNCaP低150倍，这表明腺病毒CN706能相当特异性地在分泌PSA的细胞株中复制及增殖。用该病毒一次性注射给裸鼠体内能有效杀死1×109个分泌PSA的LNCaP肿瘤细胞并使PSA分泌消失，而对不分泌PSA的DU145则无效，目前该研究已在美国进行I期临床试验。该研究应用真核细胞某些组织特异性激活顺式作用元件控制病毒早期基因的增殖腺病毒(1.Rodriguez R，Schuur ER，Lim HY，et al.Prostate attenuated replication competent adenovirus(ARCA)CN706：Aselective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancercells.Cancer Res，1997，57，2559-2563.2.Henderson，et al.Tissue specificand tumor growth supperssion by adenovirus comprising prostate specificantigen.1999，United States Patent 5,871,726.3.Henderson，et al.Tissuespecific viral vectors.1997，United States Patent 5,698,443)。
但迄今为止，尚未见到应用EB病毒感染或潜伏感染细胞特异性激活的顺式作用元件控制病毒早期基因的增殖病毒的报告
本发明的目的在于提供一类能特异性杀灭EB病毒相关肿瘤的增殖型重组病毒及其构建方法，即该病毒能选择性地在EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞内复制及增殖，而在EB病毒阴性的正常细胞内基本不复制及基本不增殖，从而特异性抑制或杀灭EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞。
本发明提供的能特异性杀灭EB病毒相关肿瘤的增殖型重组病毒，其修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入有目的基因。该目的基因为(1)抑癌基因、(2)血管抑制基因、(3)细胞因子基因、(4)前药转换酶基因及(5)细胞凋亡基因之一种。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(1)抑癌基因，抑癌基因能抑制肿瘤细胞生长，抑癌基因包含以下一个基因：P53、Rb、NF1、VHL及APC。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(2)血管抑制基因，血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。血管抑制基因包含以下一个基因：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，为血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构及Kringle1-3加上Kringle5结构、干扰素-α基因、干扰素-β基因、干扰素-γ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因、白细胞介素-12及纤维结合素基因。血管抑制基因中含有编码分泌型信号肽。该分泌型信号肽可以是下述中的任何一种：血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(3)细胞因子基因，细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等，细胞因子基因包含以下一个基因：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(4)前药转换酶基因，前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。前药转换酶基因包含以下一个基因：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(5)细胞凋亡基因，细胞凋亡基因可导致真核细胞凋亡，细胞凋亡基因包含以下一个基因：ICE、capase-3、capase-8、capase-9。
随着病毒在肿瘤细胞内复制，目的基因拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达目的基因。
基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子时会影响基因的转录水平。当宿主细胞受病毒感染或潜伏感染后，病毒可使细胞中转录调节因子发生变化，从而有利于病毒的基因的表达、病毒的复制及增殖。本发明应用病毒基因的某些顺式作用元件控制目的基因，使该目的基因特异性在该病毒感染或潜伏感染细胞内表达，而在病毒阴性的细胞内不表达或低水平表达。应用该病毒某些顺式作用元件控制病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在上述病毒感染的细胞中表达，导致病毒只能在上述病毒感染或潜伏感染的细胞内增殖，而在上述病毒阴性的细胞内基本不增殖。这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭被某种病毒感染或潜伏感染的特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不再能够再增殖。
本发明采用细胞专一的反应元件是由EB病毒感染或潜伏感染细胞特异性激活顺式作用元件组成，其顺式作用元件EB病毒Orip联合Bam HI C-启动子控制的报告基因，在EB病毒潜伏感染细胞(EBNA-1阳性)细胞的表达量比在EB病毒阴性(EBNA-1阴性)表达量高大约1000倍，同样应用顺式作用元件EB病毒Orip联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子(mini-HSV-TK)或SV40基本启动子(mini-SV40启动子)控制的报告基因，在EB病毒潜伏感染细胞(EBNA-1阳性)细胞的表达量比在EB病毒阴性(EBNA-1阴性)表达量高100-1000倍。
本发明提出的能特异性杀灭EB病毒相关肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的表达受EB病毒感染或潜伏感染细胞特异性激活的顺式作用元件控制。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件而构成。该顺式作用元件特异性在EB病毒感染或潜伏感染的细胞内激活，产生转录活性，而在EB病毒阴性的细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作元件至少含有以下顺序之一：EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(记为FR)、EB病毒Bam HI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒Bam HI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子(mini-HSV-TK)或SV40基本启动子(mini-SV40启动子)以及在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因ICE4。
本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4。
本发明提出的特异性杀灭EB病毒相关肿瘤细胞的增殖型重组病毒与化学治疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶、丝裂霉素C、碳铂、环磷酰胺等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆抗体(如抗鼻咽癌细胞抗体等)一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。
本发明提出的特异性杀灭EB病毒相关肿瘤细胞的增殖型重组腺病毒构建方法如下，将两个分别含有腺病毒左臂及右臂的载体共转染给会产生重组腺病毒的细胞，这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒增殖非必需区插入目的基因，同时这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒早期表达基因E1A、E1B、E2及E4区转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件，该顺式作用元件特异性在EB病毒感染或潜伏感染的细胞内激活，产生转录活性，而在EB病毒阴性的细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作元件至少含有以下顺序之一：EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒Bam HI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒Bam HI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子(记为mini-HSV-TK)或SV40基本启动子(记为mini-SV40启动子)、以及在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。
将EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件插入腺病毒早期基因转录起始位点与编码起始位点之间区域可以通过以下方法完成：通过聚合酶链式反应(PCR)技术在腺病毒早期基因转录起始位点与编码起始位点之间区域做一个酶切位点，通过酶切，将上述顺式作用元件插入该位点，从而使腺病毒早期基因受控于EB病毒感染或潜伏感染细胞特异性激活的顺式作用元件。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证对本发明加以进一步具体说明，但不限于该例证。腺病毒基因分为两类，早期基因与晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。E1a基因在病毒感染后即表达(0-2小时)，是最早表达腺病毒蛋白，它作为反式激活转录调节因子，是其它病毒早期基因蛋白表达所必需的，同时它反式激活其它病毒启动子。因此，缺乏E1A基因的表达，腺病毒DNA复制的必需基因产物不能产生，腺病毒不能有效复制及增殖。
E1b基因的转录受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA从细胞核转运到细胞浆中所必需的，E1B基因表达缺失可导致病毒后期基因表达不佳及不能关闭宿主细胞蛋白的合成。
E4基因位于病毒基因组的右未端，其开放阅读框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低106倍。
腺病毒系统是由两个载体组成，一个载体提供腺病毒的左臂部分，另一个载体提供右臂，这两个载体至少有500nt的同源重组区，然而其转染细胞产生重组腺病毒，载体系统质粒pXC1(Mckinnon，Gene 1982，19：39-42)，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3区Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3区)。
Ad5 E1A的转录起始位点与编码起始位点分别位于病毒基因组约560nt及610nt，在这个区域插入某种病毒顺式作用元件，如EB病毒的Orip联合BamH I C启动子。首先，应用聚合酶链反应(PCR)技术在这区域构建一个限制性内切酶位点，PCR引物将被限制于Ad5基因组或携带Ad5部分基因组的质粒中，如有pBR322为背景的引物。应用含有EcoR I位点pBR322序列及含有Xba I位点Ad5序列，通过二次叠加PCR方法，在该区域创建一个新的唯一个酶切位点，该确切位点将用于插入病毒顺式作用元件。
相似的方案也被用于插入病毒顺式作用元件，来调节E1b Ad5的E1B启动子，由一个对Sp1单一高亲和为识别物和一个TATAbox组成这区域位于1636到Sub-1701nt。通过插入病毒顺式作用元件在这个区域，将提供给E1B在细胞特异性转录。
本发明还提出前述增殖型重组病毒增殖方法，即将重组病毒(如重组腺病毒)感染EB病毒感染或潜伏感染的哺乳类细胞，从而使重组病毒特异性地在EB病毒感染或潜伏感染的哺乳类细胞中增殖。
使用只能在EB病毒感染或潜伏感染的特殊靶细胞内增殖的腺病毒，在靶细胞允许腺病毒增殖并导致细胞死亡。在体外培养或在动物体内通过将修饰后的腺病毒与细胞复合物混合，腺病毒只能在EB毒感染或潜伏感染的细胞内增殖，也就是说除了EB病毒感染或潜伏感染的细胞外，其他细胞不能被这种腺病毒杀死，由于腺病毒在EB病毒感染或潜伏感染的细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该EB病毒感染或潜伏感染的细胞被杀灭，一旦该EB病毒感染或潜伏感染的细胞被破坏，腺病毒不再能够再增殖。
本发明提出上述重组病毒实际应用。例如将该重组病毒(如重组腺病毒)用于体外感染EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞，导致细胞毒性。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于抑制EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞生长。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于体内选择性杀灭EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞。
本发明具有如下有益效果
1.本发明提供一类治疗EB病毒相关肿瘤的增殖型重组病毒，
动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗EB病毒相关肿瘤，
包括鼻咽癌、何杰金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、胃癌等。
2.本发明提供一类治疗EB病毒相关肿瘤的增殖型重组病毒的
构建方法。该方法简便易行可用于构建多种治疗EB病毒相
关肿瘤的增殖型重组病毒。
3.本发明提供一种在体内及体外杀灭EB病毒潜伏感染或感染
肿瘤细胞、而不影响EB病毒阴性的正常细胞的方法。
例1：含有EB病毒顺式作用元件的载体的构建
以pCAT-Basic为基础载体，在其多克隆位点中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)联合SV40基本启动子(mini-SV40)，pCAT-Basic购自Promega公司。应用PCR技术扩增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40启动子。前者的模板EB病毒DNA从淋巴瘤细胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法参见QIAGEN公司QIAamp Blood试剂盒的操作说明。后者的模板为pCAT-Control(购于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物为：
prime1：5’-引物(含有Hind III及AgeI酶切位点)GGG AAG CTTACC GGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGC
primer2：3’-引物(含有部分mini-SV40启动子序列)GAG ATGCAG ATC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACC
mini-SV40启动子的引物为
primer3：5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATCTGC ATC TCA ATT AGT CAG
primer4：3’-引物(含有Sal I及Age I酶切位点)GCT AAA GTCGAC ACC GGT AAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG
应用两次叠加PCR技术(方法参见PCR Protools Current Methodsand Applications，White BA主编，Humana Press Inc.1993年出版—文献1)将EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40启动子产生融合启动子，将其融合启动子PCR片段应用Hind III及Sal I双酶切插入pCAT-Basic载体Hind III及Sal I位点中(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版-文献2)。将该片段进行DNA测序，其融合启动子序列完全正确，记为CHEB-FRSV40。
以pbluescript II KS(+)为基础载体(购于美国ATCC公司)，在其多克隆位点中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)联合HSV-TK基本启动子(mini-TK)，pbluescript II购自Promega公司。应用PCR技术扩增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40启动子。前者的模板EB病毒DNA从淋巴瘤细胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法参见QIAGEN公司QIAamp Blood试剂盒的操作说明。后者的模板为pTAL-Luc(购于Clontech公司)。
EB病毒Orip中的FR的引物为：
Primer 5：5’-引物(含有XhoI酶切位点)GGG CAT CTC GAG GCATGC AGG AAA AGG ACA AGC
Primer 6：3’-引物(含有部分mini-HSV-TK启动子序列)AGT CGGGGC GGC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACC
mini-HSV-TK启动子的引物为
Primer 7：5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GGT GCC ATT GCCGCC CCG ACT GCA TCT GC
Primer8：3’-引物(含有Xba I酶切位点)TTT TCT AGA CTT CTG CTTCAT CCC CGT G
应用两次叠加PCR技术(方法同前)将EB病毒Orip中的FR序列和mini-TK启动子产生融合启动子，将其融合启动子PCR片段应用Xho I及Xba I双酶切插入pbluescript II KS(+)载体(购于美国ATCC公司)Xho I及Xba I位点中(方法参见文献2)。将该片段进行DNA测序，其融合启动子序列完全正确，记为CHEB-FRTK。
例2：携带内皮抑素或血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。
pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中552bp处创立一个新的、唯一的Age I酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为
primer9：5’-引物(含有EcoR I酶切位点)TTC AAG AAT TCT CATGTT TG
primer10：3’-引物(插入一个A，从而产生一个Age I酶切位点)CAG TCA CCG GTG TCG GAG C
primer11：5’-引物(插入一个T，从而产生一个Age I酶切位点)GCT CCG ACA CCG GTG ACT GA
primer12：3’-引物(含有Xba I酶切位点)TTC TCT AGA CAC AGGTGA TG采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-E1a。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示：在pXC.1质粒bp552位点中插入T，从而产生一个新的Age I酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用EcoR I与Xba I双酶切pGEM-T-E1A及pXC.1质粒，将pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1质粒中EcoR I及BamH I位点中，使pXC.1中552插入一个T，从而产生一个Age I酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，将该质粒命名为pXC.1-Age I。
CHEB分别用Age I酶切，其酶切片段分别插入pXC-Age I质粒中Age I酶切位点中，分别应用引物24及19进行PCR扩增，扩出2050bp，这表明EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-Age I质粒Age I位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pXC-FRSVE1A。为进一步证实EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-Age I质粒Age I位点，本发明将pXC-FRSVE1A载体应用EcoR I加Xba I作双酶切，回收2823bp片段，插入pBluescript II SK载体EcoR I及Xba I酶切位点进行测序，结果证实EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-SV40启动子已正向插入pXC-Age I质粒Age I位点。
pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中1686bp处创立多个酶切位点，包括Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I，该酶切位点位于E1B转录位点与起始密码之间，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见上述文献1)。其引物分别为
primer13：5’-引物(含有Hind III及Hpa I酶切位点)TTT TGCAAG CTT GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA
primer14：3’-引物(产生四个酶切位点)CTC GAG GGA TCC AGATCT GCG CAT TAT ATA CCC TTT AAG
primer15：5’-引物(产生四个酶切位点)AGA TCT GGA TCC CTC GAGTGA TCT AGA GGG CTA ATC TTG GTT ACA TC
primer16：3’-引物(含有Kpa I酶切位点)CCA GAA AAT CCA GCAGGT AAC采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段经Hind III和Kpn I酶切，插入pUC19载体中Hind III和Kpn I酶切点，pUC19购于美国ATCC公司，命名为pUC-E1B。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示：在E1b转录起始位点与编码起始位点中插入Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I酶切位点，其它序列与pXC.1相同。
将CHEB-FRTK用Xho I和Xba I双酶切，其片段插入pUC-E1B中XhoI和Xba I酶切位点，即在E1B转录起始位点与编码起始位点中正向插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats联合mini-TK启动子，命名pUC-E1B-FRTK，应用引物28及23进行PCR扩增，扩出1159bp，这表明EB病毒Orip中的FR联合mini-TK启动子已正向插入pUC质粒Xho I和Xba I位点。
例3.携带人内皮抑素(endostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建
pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40 poly A加尾信号。应用多聚酶链反应(PCR)技术人内皮抑素(endostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应，在扩增人内皮抑素(endostatin)基因，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见文献1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信号肽及信号肽前、基因结尾引入EcoRI和XbaI两个酶切位点。
Primer17：GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGGACG CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC
Primer18：CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGCATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAG
Primer19：GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTGTTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TG
Primer18与primer19进行第一次PCR扩增，回收615bp片段，再用primer17与primer19对615bp片段进行第二次PCR扩增，回收647bp片段，应用EcoR I+Xba I对酶切，将该基因插入pbluescriptIIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下：
GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG
将其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。
例4、携带血管生成抑素(angiostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建
应用多聚酶链反应(PCR)技术血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应后进行第一轮PCR，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见文献1)在基因结尾引入EcoR I和Xho I两个酶切位点，
primer20：5’-AGCGAATTCCAAAATGGAACATAAGG-3’
EcoR I血浆纤维蛋白溶酶原：49-67
Primer21：5’-ACACTTTTCCTTGACCTGATTTCAG-3’
血浆纤维蛋白溶酶原：348-343+111-94
primer22：5’-CTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCA
GAGTGC-3’
血浆纤维蛋白溶酶原：94-111+343-363
primer23：5’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’
Xho I(2 Stop)血浆纤维蛋白溶酶原：1431-1416
Primer20与primer21、primer22与primer23分别进行第一次PCR反应，将其反应产物混合，用prime20与primer23进行再次PCR反应，回收1168bp片段。应用EcoR I+Xho I对酶切，将该基因插入pbluescript IIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下：
GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG
将其EcoR I+Xho I切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xho I中，命名pCA13-human angiostatin。
例5：携带内皮抑素或血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的腺病毒载体的构建：
应用Bgl II分别酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分别回收1237bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40poly A加尾信号)及1758bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-E1B-FRTK中Bgl II酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的正反方向：其Bgl II上游引物
primer24：GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA
分别与人内皮抑素5’及3’-primer进行扩增
primer25人内皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA G
primer26人内皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C
分别与人血管生成抑素5’及3’-primer进行扩增
primer27人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT C
primer28人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC
其primer24与primer26能扩增到1122bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-endostatin1。其primer24与primer25能扩增到818bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40poly A加尾信号反向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位点。命名为pUC-E1B-FRTK-endostatin2。
其primer24与primer28能扩增到1364bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信号正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-angiostatin1。其primer24与primer27能扩增到1440bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-E1B-FRTKBgl II酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK-angiostatin2。
应用Hpa I和Kpn I双酶切pUC-E1B-FRTK-endostatin1、pUC-E1B-FRTK-endostatin2、pUC-E1B-FRTK-angiostatin1及pUC-E1B-FRTK-angiostatin2，回收片段，分别插入pXC-FRSVE1A中Hpa I和Kpn I酶切位点，分别命名为pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angio-statin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2。
例6：携带内皮抑素或血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的重组。
293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B- angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。PBHG10购于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A及E1B受EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子控制的腺病毒，并携带人内皮抑素或血管生成抑素，分别命名为EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1、EBVFRSVEIA-FRTKE1B-endostatin2、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin1及FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin2，分别记为CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2。
由上述方法构建的重组病毒的列表如下：
病毒 名称 含Ad5左臂质粒 含Ad5右
臂质粒EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-
PBHG10E1B-endostatin1 endostatin1 endostatin1EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-
PBHG10E1B-endostatin2 endostatin2 endostatin2EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-
PBHG10E1B-angiostatin1 angiostatin1 angiostatin1EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-
PBHG10E1B-angiostatin2 angiostatin2 angiostatin2
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1(CNHKEBV-endostatin1)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-endostatin2(CNHKEBV-endostatin2)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin1(CNHKEBV-angiostatin1)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及OripFR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin2(CNHKEBV-angiostatin2)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
例7：携带人内皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的体外在EB感染或潜伏感染的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人内皮抑素或人血管生成抑素因子并特异性杀灭肿瘤细胞。
将CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2分别感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1、CNHKEBV-angiostatin2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为：
正常成纤维细
293 Jijoye
胞 野生型5型腺
病毒 1×105 7×104 5×104
CNHKEBV-
1×105 4×105 3×10 endostatin1
CNHKEBV-
1×105 4×105 4×10 endostatin2
CNHKEBV-
1×105 2.5×105 2×10 angiostatin1
CNHKEBV-
1×105 2.5×105 2×102 angiostatin1
将感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Bloodmini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用Nhe I和Xho I双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104、4×104、4×104及0、0、0、0。将上述CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-humanendostatin，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human endostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104及＜10、＜10。
将上述CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human angiostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为4×104、4×104及＜10、＜10。
例8：携带人内皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的在SCID小鼠体内治疗EB病毒感染或潜伏感染的肿瘤细胞移植瘤
将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye细胞5×107，两周后给予5×108pfu增殖型重组腺病毒CNHK101治疗或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-LacZ，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。
例9：携带白细胞介素-12融合基因的E1区缺失的腺载体的构建
pCA14载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA14含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。
应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增白细胞介素-12融合基因，自新鲜的正常人T细胞中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应后进行第一轮PCR，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见1)在基因结尾引入Sal I酶切位点，
primer29：TTT GTC GAC CAT GGG TCA CCA GCA GTT GGT CAT
Primer30：AGA TCC GCC GCC ACC GCC ACC ACT GCA GGG CAC AGA
TGC CCA
Primer31：GGT GGC GGT GGC GGC GGA TCT AGA AAC CTC CCC GTG
GCC ACT
Primer32：TAT AAA GTC GAC TCA TTA GGA AGC ATT CAG ATA GCT
CG
Primer29与primer30、primer31与primer32分别进行第一次PCR反应，将其反应产物混合，用prime29与primer32进行再次PCR反应，回收1610bp片段。应用Sal I酶切，将该基因插入pbluescriptIIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果正确。
将其Sal I切下，插入pCA14载体Sal I中，应用BamH I酶切来鉴定基因插入正反方向，其BamH I酶切可见1422bp与6919bp，这表明hIL-12融合基因正向插入pCA14载体中，命名pCA14-humanIL-12。
例10：携带人白细胞介素12的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的腺病毒载体的构建：
应用Bgl II部分酶切pCA14-human IL-12，分别回收2191bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人IL-12融合基因及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-E1B-FRTK中Bgl II酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的正反方向：其Bgl II上游引物
primer24：GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA
分别与人白细胞介素12的primer29及primer32进行扩增
其primer24与primer32能扩增到2122bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人IL12融合基因及SV40poly A加尾信号正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位点，命名为pUC-E1B-FRTK1-IL12。其primer24与primer29能扩增到2122bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人IL12融合基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位点。命名为pUC-E1B-FRTK2-IL12。
应用Hpa I和Kpn I双酶切pUC-E1B-FRTK1-IL12及pUC-E1B-FRTK2-IL12，回收片段，分别插入pXC-FRSVE1A中HpaI和Kpn I酶切位点，分别命名为pXC-FRSVE1A-FRTKE1B1-IL12、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B2-IL12。
例11：携带白细胞介素-12融合基因的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的重组。
293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-FRSVE1A-FRTKE1B1-IL12及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B2-IL12与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。PBHG10购于加拿大MicrobixBiosystems Inc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A及E1B受EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及OripFR联合mini-HSV-TK启动子控制的腺病毒，并携带人白细胞介素12融合基因，分别命名为EBV FRSVEIA-FRTKE1B1-IL12及FRSVEIA-FRTKE1B2-IL12，分别记为CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12。
由上述方法构建的重组病毒的列表如下：
含Ad5右
病毒 名称 含Ad5左臂质粒
臂质粒EBV FRSVEIA-FRTK pXC-FRSVE1A-
CNHKEBV1-IL12 PBHG10
E1B1-IL12 FRTKE1B1-IL12EBV FRSVEIA-FRTK pXC-FRSVE1A-
CNHKEBV2-IL12 PBHG10
E1B2-IL12 FRTKE1B2-IL12
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(方法参见文献2)。EBV FRSVEIA-FRTK E1B1-IL12(CNHKEBV1-IL12)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglII酶切位点，在该酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人白细胞介素12融合基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B2-IL12(CNHKEBV2-IL12)为5型腺病毒，在E1A及E1B转录起始位点与编码起始位点之间分别插入EB病毒顺式作用元件Orip FR联合mini-SV40启动子及Orip FR联合mini-HSV-TK启动子，并在E1A终止密码子后与Orip FR联合mini-HSV-TK启动子上游区之间新建一个BglII酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人白细胞介素12融合基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
例12：携带人白细胞介素12融合基因的EB病毒顺式作用元件控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒的体外在EB感染或潜伏感染的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人白细胞介素12并特异性杀灭肿瘤细胞。
将CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12分别感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHKEBV1-IL12、CNHKEBV2-IL12及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为：
正常成纤维细
293 Jijoye
胞野生型5型腺病毒 1×105 7×104 5×104CNHKEBV1-IL12 1×105 3×105 2×10CNHKEBV2-IL-12 1×105 2×105 3×10
将感染EB病毒感染的淋巴瘤细胞株Jijoye及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood minikit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用Nhe I和Xho I双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104、及＜10、＜10。将上述CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA14-human IL12，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human endostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12在Jijoye及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为5×104、5×104及＜10、＜10。