一个超强融合启动子及其融合方法与应用 (一)技术领域
本发明涉及一个超强启动子及其融合方法与应用，属于真核基因表达调控技术研究领域。将该启动子构建入植物表达载体可以驱动外源基因在转基因植株中高效表达。
(二)背景技术
启动子作为启动基因转录的重要元件被人们所详细研究。人们从不同生物中陆续发现了一些强启动子，但随着基因工程的深入，仅靠这些天然的启动子来提高基因表达活性已不能满足人们的需要。融合启动子和双元启动子能高效驱动外源基因表达，成为启动子的研究热点。融合启动子即将异源启动子的核心启动子和增强子序列连接起来构建超强转录的启动子。双元启动子即将两个天然启动子融合在一起以提高启动子活性。例如，人们将mas启动子和CaMV 35S启动子融合构建新的异源启动子，或两拷贝CaMV 35S启动子融合，可以大大提高启动子活性，参见卡欧麦等人于1990《植物分子生物学》，一个CaMV35S和mas元件融合启动子的新用途，15：373-381(Comai L，et al.Novel and useful properties ofa chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements.Plant Mol Biol15：373-381)。由嵌合启动子、外源结构基因及Nos 3′端的非编码区域组成的嵌合基因，能在植物细胞中高效表达，所以融合方法是获得高强启动子的重要策略。Ti质粒虽然来源于农杆菌，但其上的章鱼碱合成酶基因(mas)和甘露碱合成酶基因(ocs)却能在植物细胞中表达，因此，它们的启动子元件能作为构建嵌合基因启动子的基本序列。国外已有利用ocs增强子序列与mas的核心序列构建了启动子的报道，国内未见相关报道。本发明人以与国外不同长度的ocs增强序列和mas核心启动子序列为基本序列，采用一种高效的融合方法研制成功了一个新的超强启动子。该启动子代替35S启动子，可以使外源基因在烟草叶中的表达增强47倍，根中表达增强23倍，能应用于高效植物表达载体的构建，提高外源基因在转基因植株中的高效表达。
(三)发明内容
本发明针对转基因技术中外源基因表达量过低的问题，融合不同拷贝数章鱼碱合成酶(ocs)增强子序列和甘露碱合成酶(mas)启动子核心序列，得到能驱动外源基因在转基因植物中高效表达的强启动子，用来构建高效表达载体。为我国分子生物学及生物技术工作者提供具有我国独立知识产权的高效表达载体。
本发明的超强融合启动子是由以下方法获得的：
利用聚合酶链式反应(PCR)方法将农杆菌Ti质粒上mas核心启动子(-189至+65)扩增克隆，在克隆载体中的mas启动子片段用Hind III、Xba I双酶切，电泳回收目的片段。同时将pBI121质粒同样用Hind III、Xba I进行双酶切，电泳回收剩余的载体片段。将pBI121质粒酶切剩余的载体片段与克隆载体中的mas启动子片段用Hind III、Xba I双酶切后的回收片段连接，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，重组子命名为：pMAS。同样利用PCR方法将农杆菌Ti质粒上ocs增强子(-294至-116)扩增克隆，将在克隆载体中的ocs增强子片段用Hind III单酶切，电泳回收目的片段。同时将pBIMAS质粒同样用Hind III进行单酶切，电泳回收剩余的载体片段。将pMAS质粒酶切剩余的载体片段与克隆载体中的ocs增强子片段用Hind III单酶切后的回收片段连接，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子并测序，得到的不同拷贝数ocs增强元件以不同方向和mas核心启动子融合的启动子。
通过冻融法将含有融合启动子的pOMS系列表达载体转化农杆菌LBA4404，用叶盘法转化烟草，在含有羧苄和卡那霉素的MS培养基上筛选抗性植株，然后将其移到生根培养基上生根，最后移栽到基质中在温室中长大。取转基因烟草底部第五片叶片150mg进行GUS酶活检测。检测表明pOMS4融合启动子驱动的GUS基因表达活性比CaMV 35S启动子显著提高，在叶片组织中其活性比CaMV35S启动子高47倍，在根组织中高23倍，增强效果显著。说明我们构建成功了一个效果优良的通用融合启动子及其植物表达载体。
本发明的超强融合启动子pOMS4是由4个ocs增强子片段顺向与mas核心启动子连接而成，具有SEQ ID NO.1的所示的序列：序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征：
*长度：970碱基对
*类型：核酸
*链型：双链型
*拓扑结构：线性*ocs增强子(-294至-116)数目：4个*ocs增强子(-294至-116)方向：正向*mas核心启动子(-189至+65)数目：1个*mas核心启动子(-189至+65)方向：正向(b)分子类型：DNA(c)假设：否(d)反义：否(e)最初来源：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(f)序列描述：SEQ ID NO.1AAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCTTATC 60GACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTGTTGT 120GGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCATCGC 180ACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCT 240TATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTG 300TTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCA 360TCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTT 420TTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTA 480GCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGG 540GGCATCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTG 600CCTTTTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACT 660GGGTAGCCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTAC 720GATGGGGGCATCGCACCGAAGCTTCCAACTTTTTCTTGATCCGCAGCCATTAACGACTTT 780TGAATAGATACGCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTCAAAAGTGTACCAAACAACGCTTTA 840CAGCAAGAACGGAATGCGCGTGACGCTCGCGGTGACGCCATTTCGCCTTTTCAGAAATGG 900ATAAATAGCCTTGCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACATTACACTAGCATCT 960GAATTTCATAACCAATCTCGATACACCAAATCGATGAGATCT 1002
将该超强启动子构建入植物表达载体可以驱动外源基因在转基因植物中高效表达。当用oms4替换植物表达载体pBI121中的35S启动子，可以使外源基因在转基因植物中的平均表达水平在叶和根中分别提高47倍和23倍。
本发明的优点在于利用一种简便高效的方法融合得到的启动子能高效驱动外源基因在转基因植物中高效表达，适合构建高效植物表达载体用于转基因研究和产业化，能显著提高转基因效果和植物基因工程产品的产量。
(四)附图说明
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述：
图1是植物表达载体构建过程简图
图2是超强启动子及融合基因结构图
图3是植物表达载体pOMS4和对照pBI121在转基因烟草中的GUS酶活比较图。
(五)具体实施方式实施例1：启动子的融合与植物表达载体的构建
利用PCR方法将农杆菌Ti质粒上mas启动子(-189至+65)扩增克隆，在克隆载体中的mas启动子片段用Hind III、Xba I双酶切，电泳回收目的片段。同时将pBI121质粒同样用Hind III、Xba I进行双酶切，电泳回收剩余的载体片段。回收方法见上海生工生物公司的DNA胶回收试剂盒说明书。将pBI121质粒酶切剩余的载体片段与克隆载体中的mas启动子片段用Hind III、Xba I双酶切后的回收片段连接，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，重组子命名为：pMAS。利用PCR方法将农杆菌Ti质粒上ocs增强子(-294至-116)扩增克隆，将在克隆载体中的ocs增强子片段用Hind III单酶切，电泳回收目的片段。同时将pBIMAS质粒同样用Hind III进行单酶切，电泳回收剩余的载体片段。回收方法同上。将pMAS质粒酶切剩余的载体片段与克隆载体中地ocs增强子片段用Hind III单酶切后的回收片段连接，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选重组子并测序，oms1，oms1′分别代表1个ocs增强元件正向和反向与mas核心启动子融合，oms2，oms2′分别代表2个ocs增强元件正向和反向与mas核心启动子融合，oms3，oms3′分别代表1个ocs增强元件正向和反向与mas核心启动子融合，oms4代表4个ocs增强元件正向与mas核心启动子融合，oms5代表5个ocs增强元件正向与mas核心启动子融合。实施例2：烟草转化与GUS表达活性的检测a.烟草转化与鉴定 将植物表达载体pOMS1、pOMS1′、pOMS2、pOMS2′、pOMS3、pOMS3’、pOMS4、pOMS5和对照pBI121通过冻融法转化农杆菌LBA4404。用叶盘法转化烟草，在含有羧苄和卡那霉素的MS培养基(3mg/L 6 BA+0.2mg/L NAA+100mg/L Km+250mg/L Crb)上筛选抗性植株，然后将其移到生根培养基(MS基本培养基+50mg/L Km+250mg/L Crb)上生根，最后移栽到基质中在温室中长大。用CTAB法提取叶片基因组DNA，以基因组DNA为模板，用gus基因引物P1(ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA)和P2(TTCCGGCATAGTTAAAGAAAT)进行PCR扩增，检测gus基因的整合情况，转化的烟草植株中能扩出508bp的gus片段，而未转化的植株不能扩增出此片段。PCR检测证明为阳性的植株用于GUS表达活性的定量测定。b.GUS表达活性的定量测定：取转基因烟草底部第五片叶片150mg，加入500μl提取缓冲液在研钵中研成匀浆，3000g离心10min，收集上清液。在1ml预热的反应缓冲液中(提取液中加入1mmol/L MUG)加入20μl上清，混匀，于37℃下反应30min后取出100μl加入到900μl反应终止液中终止反应，用日立-850型荧光分光光度计测定各样品Ex365/Em455值。蛋白质含量按Bradford的方法测定，取上清20μl，用重蒸水定容至4ml，加入1ml考马斯亮蓝溶液，测定595nm光吸收值。用4-甲基伞形酮(4-MU)的纳摩尔数与蛋白质含量及时间的比值(nmol MU/mg·蛋白/min)表示GUS活性。GUS酶活测定表明，其中4个拷贝的ocs增强子(Poms4)无论在叶片(155859pmole/min/mg protein)还是在根中(244551pmole/min/mgprotein)活性的提高都是最大，在叶和根中Poms4启动GUS基因表达的程度分别是CaMV 35S启动子的47倍和23倍，证明该Poms4融合启动子是超强融合启动子，构建的高效表达载体可以用于作为一个高效表达载体用于外源基因在转基因植物中的表达。
序列表<110>山东农业大学<120>一个超强融合启动子及其融合方法与应用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1002<212>DNA<213>Agrobacterium tumefaciens<221>ocs<222>(1)..(744)<221>mas<222>(745)..(1002)<400>1aagcttggat ccctgaaagc gacgttggat gttaacatct acaaattgcc ttttcttatc 60gaccatgtac gtaagcgctt acgtttttgg tggacccttg aggaaactgg tagctgttgt 120gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc acctacgatg ggggcatcgc 180accgaagctt ggatccctga aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct 240tatcgaccat gtacgtaagc gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg 300ttgtgggcct gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac gatgggggca 360tcgcaccgaa gcttggatcc ctgaaagcga cgttggatgt taacatctac aaattgcctt 420ttcttatcga ccatgtacgt aagcgcttac gtttttggtg gacccttgag gaaactggta 480gctgttgtgg gcctgtggtc tcaagatgga tcattaattt ccaccttcac ctacgatggg 540ggcatcgcac cgaagcttgg atccctgaaa gcgacgttgg atgttaacat ctacaaattg 600ccttttctta tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggaccct tgaggaaact 660gggtagcctg ttgtgggcct gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac 720gatgggggca tcgcaccgaa gcttccaact ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt 780tgaatagata cgctgacacg ccaagcctcg ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta 840cagcaagaac ggaatgcgcg tgacgctcgc ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg 900ataaatagcc ttgcttccta ttatatcttc ccaaattacc aatacattac actagcatct 960gaatttcata accaatctcg atacaccaaa tcgatgagat ct 1002