抗IV型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白 【技术领域】
本发明涉及一种融合蛋白scFv-LDP的构建产生，它是一种新型兼具细胞毒和抑制侵袭转移的双功能小型化单抗导向药物。背景技术
IV型胶原酶又叫明胶酶，属于基质金属蛋白酶(MMPs)家族。其降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，是肿瘤细胞侵袭与转移的必经过程。实验证实肿瘤细胞的侵袭力及其恶性进展与IV型胶原酶活性正相关。肿瘤的生长依赖于新生血管的形成，肿瘤诱导的血管生成不仅对绝大多数实体瘤的生长必不可少，同时也是肿瘤细胞发生转移的主要通路。新生血管内皮细胞的IV型胶原酶活性呈增高水平。抑制IV型胶原酶等基质金属蛋白酶活性可以抑制肿瘤侵袭转移和血管生成。因此，IV型胶原酶是抗肿瘤研究的重要分子靶点。力达霉素(Lidamycin，LDM又称C1027)是从我国湖北省土壤中分离的一株链霉菌产生的大分子抗肿瘤抗生素，由包含110个氨基酸残基的辅基蛋白(LDP)和烯二炔结构的发色团(LDC)两部分组成。LDC是LDM分子的活性部分，有极强的细胞毒作用但不稳定。LDP对LDC的稳定性起保护作用。二者以非共价键结合，可拆分和重建，重建后的分子与天然分子具有相同的活性，且LDC与LDP的结合有特异性和牢固性。LDM除具极强的细胞毒作用外，还有很强地抑制肿瘤转移和血管生成作用。LDM以其独特的结构、高效的活性和广泛的作用机制而成为构建单抗导向药物重要的“弹头”药物。单克隆抗体(单抗)具有高度特异性，可以专一地与特定的抗原结合。单抗导向药物利用单抗对肿瘤的高度特异性实现对肿瘤的靶向性、选择性治疗，同时减轻对正常组织的毒副作用。但是一般单抗导向药物由于分子量过大、免疫原性强，导致临床疗效欠佳。发明内容
本发明的目的主要是从小型化、高效化以及选用新型靶点着手研制新型单抗导向药物。本发明目前未见类似报道。
酵母属于单细胞低等真核生物，一方面具有原核生物易于培养、生长繁殖快、便于基因工程操作等特性，另一方面又具有真核生物的蛋白翻译后加工能力。因此，用酵母表达体系高效表达真核外源蛋白目前受到广泛研究和应用。本发明是在甲醇营养型酵母Pichia pastoris中生产重组融合蛋白。
本项发明的内容和要点包括以下步骤：
1.抗IV型胶原酶单抗片段scFv基因的克隆构建：本部分使用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统试剂盒产生scFv片段。以抗IV型胶原酶杂交瘤细胞3D6mRNA为模板，分别扩增出抗体轻、重链可变区基因。然后用一段编码(GGGGS)3的linker序列，经重组PCR将抗体轻、重链可变区基因连接构建成scFv片段(图1)。将此基因片段克隆进质粒pCANTAB5E(Pharmacia公司)构建重组噬菌体抗体库。用IV型胶原酶对文库进行两轮免疫淘选后得到一株对抗原有最高亲和力的重组噬菌体抗体43#。ScFv-43基因片段由上海生工生物工程公司进行序列测定，全长744bp，编码248个氨基酸。该基因序列与专利99121668.7中的scFv基因序列92.2％同源(图2)。两个scFv片段都是抗IV型胶原酶，但本发明所涉及的scFv片段的起源杂交瘤细胞3D6比专利99121668.7中的scFv片段的起源杂交瘤细胞C2H5对抗原具有更强的亲和力，因此具备更高的肿瘤靶向性。
2.ScFv-LDP融合基因的构建：重组质粒pCANscFv、pC由本实验室构建，分别含有scFv和LDP基因片段。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PH1(scFv 5’端引物)：5’ATCTCGAGAAAAGAGAGGCCCAGGTGAAGCTG 3’
XhoIPL2(scFv 3’端引物)：5’CGCCATGG TGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTC3’
Nco I spacerPLD1(LDP 5’端引物)：5’CATGCCATGGGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’
Nco IPLD2(LDP 3’端引物)：5’GTGAATTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC 3’
EcoR I
以质粒pCANscFv为模板，PH1、PL2为引物进行PCR扩增，获得长约800bp的scFv基因片段(图3)，分离纯化后用Xho I和Nco I双酶切。同时以质粒pC为模板，PLD1和PLD2为引物PCR扩增LDP基因，获得约340bp的扩增片段(图3)，分离纯化后用Nco I和EcoR I双酶切。将上述两个片段与经Xho I和EcoRI酶切的质粒pPIC9(Invitrogen公司)进行连接，获得重组质粒pPIC9-Fv1027。由上海生工生物工程公司进行序列测定，融合基因读码框插入正确，整个基因全长1095bp，编码365个氨基酸。通过分析计算机同源模建的scFv三维结构以及LDP的X-衍射三维结构，在scFv的C-端和LDP的N-端附加一段小肽spacer，以使两部分的空间构象不至于相互影响。为了以后克隆替换的方便，在两个基因之间还引入Nco I酶切位点(图9)。
3.融合蛋白在酵母中的产生：本发明所使用的表达体系是甲醇营养型毕赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K(Invitrogen公司)。构建的融合基因两端分别是Xho I、EcoR I酶切位点，但质粒pPIC9K有两个Xho I酶切位点。因此首先是将融合基因经Xho I、EcoR I位点亚克隆至质粒pPIC9构建重组质粒pPIC9-Fv1027，然后选定Sph I、EcoR I酶切将含融合基因片段亚克隆至表达载体pPIC9K构建重组表达质粒pKFv1027(图4)。重组质粒pKFv1027经酶切分析鉴定插入正确(图5)。重组质粒pKFv1027经Bgl II酶切线性化并纯化后，电转化PichiapastorisGS115，用MD培养基(含YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖1％)及含不同浓度G418的YPD培养基(含酵母浸出物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)平板筛选阳性多拷贝重组转化子。挑取转化子G34，提取基因组DNA，以5’AOX1引物(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’)和3’AOX1引物(5’GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’)进行PCR鉴定(图6)，表明外源融合基因通过5’AOX1序列和3’AOX1序列双交换同源重组整合进酵母基因组中，其表型为His+Muts。将G34接种至50ml BMGY培养基(Invitrogen公司)，30℃振荡培养至OD600约3。离心收集菌体，用5ml BMMY培养基(Invitrogen公司)重悬，30℃振荡培养进行诱导表达。每隔24小时补加甲醇至终浓度1％，4天后离心收集上清。用抗LDM单抗F9(本实验室构建)做为一抗进行Western blot分析，G34成功地表达了可溶性重组融合蛋白(图7)。
4.融合蛋白scFv-LDP的免疫反应性：将IV型胶原酶按1μg/100μl/孔包被96孔酶标板，以100μl 10％脱脂奶粉进行封闭。加入酵母表达上清，孵育后洗去。加入抗LDM单抗F9再次孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，以邻苯二氨为底物进行显色，酶标仪测定490nm处吸光值。结果表明，融合蛋白仍保留了单抗对抗原IV型胶原酶的免疫反应性(图8)。
5.融合蛋白scFv-LDP抑制血管生成：将表达上清用截留分子量为10kDa的超滤浓缩膜浓缩20倍后，用鸡胚尿囊膜法检测对血管生成抑制作用。结果表明，在酵母中产生的融合蛋白scFv-LDP能抑制血管生成(表1)。
本发明的优点与积极效果是：运用基因工程手段获得小型化的单抗片段，在此基础上构建产生融合蛋白scFv-LDP，这为加入LDC生成组装型单抗导向药物scFv-LDM奠定了基础。该策略可以最大限度地确保维持LDM的活性。运用酵母表达体系可以经济、方便、大量地生产融合蛋白，因而为研制兼具强烈杀伤肿瘤细胞活性和抑制侵袭转移活性的双功能小型化单抗导向药物打下了基础。附图说明图1：单链抗体基因片段的PCR扩增电泳结果其中：A.DNA分子量标准DL2000
B.抗体重链可变区基因片段(约360bp)
C.抗体轻链可变区基因片段(约330bp)
D.抗IV型胶原酶单链抗体基因片段(约740bp)图2：单链抗体基因片段43与M97的同源性比较图3：琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果其中：A.DNA分子量标准DL2000
B.单链抗体基因片段(约800bp)
C.力达霉素辅基蛋白基因片段(约340bp)图4：重组表达质粒pKFv1027的构建示意图 图5：重组质粒pKFv1027的限制性内切酶酶切分析其中：A.DNA分子量标准DL2000+15000
B.pPIC9-Fv1027
C.pPIC9-Fv1027/Xho I+EcoR I
D.pKFv1027
E.pKFv1027/Xho I+EcoR I图6：毕赤酵母重组子的PCR产物电泳鉴定其中：1.DNA分子量标准DL2000+15000(由上而下依次为15，10，7.5，5，2.5，2，1，0.75，0.5，0.25，0.1kb)
2.Pichia pastoris GS115(2.2kb)
3.Pichia pastoris GS115 No.G49(带空载质粒pPIC9K)(0.5kb)
4.Pichia pastoris GS115 No.G34(带重组质粒pKFv1027)(1.6kb)图7：重组融合蛋白的Western blot分析其中：A.低分子量蛋白标准
B.Pichia pastoris GS115 No.G49(带空载质粒pPIC9K)
C.Pichia pastoris GS115 No.G34(带重组质粒pKFv1027)图8：ELISA测定表达产物与抗原IV型胶原酶的免疫反应性图9：酶切点与小肽spacer位置示意图具体实施例
表1：鸡胚尿囊膜检测表达融合蛋白抑制血管生成作用
样品量/鸡胚 血管生成抑制情况*
0.9％NaCl -
10μl -/+
20μl +
40μl ++
氢化可的松(60μg) ++*-/+：血管变细，毛细血管稀疏+：出现锲形空斑，直径约为2mm++：出现锲形空斑，直径约为4mm
序列表<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>抗IV型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白<160>1<170><210>1<212>DNA<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)<220><221>misc_feature<222><223><400>1atggcccagg tgaagctgca gcagtctgga actgaagtgg taaagcctgg ggcttcagtg 60aagttgtcct gcaaggcttc tggctacatc ttcacaagtt atgatataaa ctgggtgagg 120cagacgcctg aacagggact tgagtggatt ggatggattt ttcctggaga ggggagtact 180gaatacaatg agaagttcaa gggcagggcc acactgagtg tagacaagtc ctccagcaca 240gcctatatgg agctcactag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgctaga 300ggggactact ataggcgcta ctttgacttg tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 420actcagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccat atcctgcaga 480gccagtgaaa gtgttgatac ttatggcgat acttttatgt actggtacca gcagaaacca 540ggacagccac ccaaactcct catctatctt gcaaccaacc taggatctgg ggtccctgcc 600aggttcagtg gcagtgggtc taggacaaac ttcaccctca ccattgatcc tgtggaggct 660gatgatgctg caacctatta ctgtcagcaa aataatgagg atccgtacac gttcggaggg 720ggcaccaagc tggaaatcaa acgt 744