DNA微阵列的质量控制方法 【技术领域】
本发明涉及DNA微阵列，更具体地涉及DNA芯片的质量控制方法。
背景技术
DNA微阵列指的是通过使寡核苷酸探针(每个探针具有几个至数百个核苷酸的已知序列)固定在固体表面上的数百至成千上万个适当位置而制备的DNA芯片，其中所述固体表面由，例如，硅，表面-改性的玻璃，聚丙烯，或活化的聚丙烯酰胺制成。当将待分析的靶DNA上样于DNA芯片时，靶DNA的片段与固定于DNA芯片上的寡核苷酸探针互补杂交。通过光学或放射化学可以检测和分析杂交，从而鉴定出靶DNA的核苷酸序列，这就是所谓地杂交测序(SBH)。
利用制备成微阵列的DNA芯片能使DNA分析系统的规模变小，并且能够用极少量的样品进行遗传学分析。另外，还可以同时分析靶DNA的多个序列，从而能经济快速地提供靶DNA的遗传信息。DNA微阵列芯片可以在短时间内分析大量遗传信息，并可分析基因的相关性。因此，DNA芯片有望能广泛应用于例如遗传疾病和癌症的诊断，突变体和病原体的检测，基因表达分析，药物筛选等。此外，DNA芯片也可用作微生物或污染物的检测器(detector)，以找出解毒基因，并进一步基于基因重组技术大规模生产解毒剂。DNA芯片可大大改善包括药用作物或低脂肉类生产在内的大多数生物产业。
根据其表面所固定的探针类型，将DNA微阵列分为寡核苷酸-芯片(oligo-chip)和cDNA芯片。根据制备方法，可将DNA微阵列分为平版影印芯片(lithography chip)，针式点样芯片(pin-type spotting chip)和喷墨式点样芯片(ink-jet spotting chip)。根据固定化探针的类型，采用各式各样的复杂的化学方法来制备DNA微阵列。由于极少量的DNA探针被固定于玻璃表面很小的区域内，点与点和芯片与芯片之间探针的量有相当大的差异，因此杂交结果不一致。
为了着手解决这一问题，有人提出了在杂交前对DNA芯片进行质量控制的技术。Brown等(“Quantitative Monitoring of Gene Expression Pattemswith a Complimentary DNA Microarray″M.Schena，D.Shalon，R.W Davis andP.O.Brown.Science 270：467-470(1995).)研究出一种通过用激光扫描玻璃表面上因固定化DNA探针斑点中存在的盐所导致的光散射，来检查DNA探针斑点的均一性(uniformity)和玻璃表面损害的方法。该方法仅方便在DNA探针点样后立即使用，在完成DNA芯片制备之后使用受限，因为点样之后，通过固定化和清洗过程从DNA探针斑点中除去了盐。
最近，有人研究出使用能与DNA探针结合的荧光材料染色玻璃表面上的DNA斑点(spot)的方法(Battaglia C，Salani G，Consolandi C，RossiBernardi L，De Bellis G.，Analysis of DNA Microarrays by Non-destructiveFluorescent Staining Using SYBR Green II，Biotechniques，2000 July，29：78-81)。根据此方法，用对单链DNA(ssDNA)具有高亲和力的荧光SYBR GreenII处理DNA芯片玻璃表面上固定化的DNA探针，并通过激光扫描进行检测。据报道，通过清洗可以完全除去与DNA探针结合的荧光材料。与Brown的方法相比，荧光染色方法可在芯片制备完毕之后用于检查DNA微阵列，但染色和除去染料时需要多个清洗过程。不幸的是，清洗之后，荧光材料仍然很可能残留在玻璃表面，从而会影响随后的杂交过程。
【发明内容】
因此，本发明提供了一种便利的，非破坏性的控制DNA微阵列上DNA斑点的质量和大小的方法，该方法无需染色和除去染料的过程。
一方面，本发明的DNA芯片质量控制方法包括：制备含有荧光染料的DNA点样溶液；将DNA点样溶液点样于基质以制备DNA芯片；和检测DNA斑点发出的荧光信号。
【附图说明】
通过参照附图详细描述本发明例举的实施方案，本发明的上述目的和优点将更加显而易见，其中
图1显示了实施例1中进行的，在与靶DNA杂交之前(质量控制检验(QCTest))和之后(应用检验(Use Test))对固定于DNA微阵列上的寡核苷酸探针斑点进行扫描的结果；和
图2显示了实施例2中进行的，在与靶DNA杂交之前(QC Test)和之后(Use Test)对固定于DNA微阵列上的cDNA探针斑点进行扫描的结果。
【具体实施方式】
常规的DNA芯片质量控制方法是将DNA探针点样于DNA芯片基质上，然后使荧光染料与DNA探针结合，与之不同的是，在本发明的DNA芯片质量控制方法中，用荧光染料制备将要上样于DNA芯片基质的DNA点样溶液，荧光染料与基质表面共价结合，而DNA探针被固定于DNA芯片基质上。DNA芯片制备完毕之后，扫描DNA斑点发出的荧光，从而非-破坏性地测定DNA斑点的均一性。
通过DNA探针斑点的直径和外形以及荧光的强度，测定DNA探针斑点发出的荧光信号的均一性。
本发明所用荧光染料具有用于产生荧光信号的染料基团(F)和与固体基质共价结合的官能团(R)，其结构式如下所示：
F：FITC，荧光素，Cy3，Cy5，德克萨斯红，TAMRA
R：胺，活化酯，异硫氰酸盐，醛
用于产生荧光信号的适当染料基团，对于用来标记靶DNA，以便在DNA芯片制备完毕之后用于检测杂交的染料没有光谱干扰，其包括无光谱干扰作用的异硫氰酸荧光素(FITC)，荧光素，Cy3，Cy5，德克萨斯红(Texas Red)，N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)等。
根据DNA微阵列的类型，与固体基质结合的官能团应能与固体基质表面的官能团，如胺，醛或聚-赖氨酸共价结合。荧光染料的适当官能团包括胺，异硫氰酸盐(-NCS)，活化酯和醛。
可根据所用荧光染料的类型改变按上述制备的DNA芯片上的DNA斑点的质量控制方法。例如，当荧光染料的染料基团是FITC或荧光素时，用氩离子激光可在波长为488nm时激发该染料基团，使用520nm波长的滤光片可分析荧光信号。
本发明的DNA微阵列质量控制方法可适用于另一种类型的微阵列，如RNA芯片或蛋白质芯片。
下文将参照实施例详细描述本发明。给出下列实施例是为了阐明本发明，并不想限制本发明的范围。在下列实施例中，实验性地测定了，制备DNA芯片时与DNA探针一起被固定于基质上的荧光染料，在DNA探针与经荧光标记的靶DNA在DNA芯片上杂交之后，是否会影响DNA斑点发出的荧光强度。使用了两种DNA芯片，即寡核苷酸探针-固定化DNA芯片和cDNA-固定化DNA芯片。
实施例1寡核苷酸探针-固定化DNA芯片的斑点质量控制
A.使用凝胶基质制备DNA-寡核苷酸芯片
在凝胶基质溶液中搅拌加入两种寡核苷酸探针(精确匹配的(PM)-5’-TGTAGACACGCACCTCCGTG-3’；或错配的(MM)-5’-TGTAGACACCCACCTCCGTG-3’)和荧光染料4’-(氨基甲基)荧光素(0μM，1μM，和2μM)，于37℃放置14小时以形成基质-DNA缀合物(conjugate)。将所得溶液用作点样溶液。将点样溶液点在经处理已暴露出胺基团的玻璃表面，于37℃的湿槽(wet chamber)中放置4小时。接着，对玻璃表面未加载点样溶液的区域进行处理，使该区域的胺基团带负电，从而防止靶DNA吸附于非一点样区域，这是控制背景噪声所必需的过程。为此，将5g琥珀酐溶解于315ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在溶液中搅拌加入35ml硼酸钠。用该溶液处理玻璃表面，用蒸馏水清洗并置于干燥器中。
用作荧光材料的4-(氨基甲基)荧光素具有下式：B.通过Cy3的荧光测定杂交敏感性
使用扫描仅(ScanArray Scanner，GSI Lunonics)，以10-μm-象素的分辨率检测经荧光标记的靶物质发出的荧光信号，所述靶物质与DNA微阵列上的探针杂交。使用GenePix软件得出斑点的强度。
图1显示了在与靶DNA杂交之前扫描按上述使用凝胶基质制备的DNA微阵列上斑点的结果(质量控制(QC)检验(Test))，以及与靶DNA杂交之后扫描DNA微阵列上斑点的结果(应用检验(Use Test))。
对QC Test而言，在扫描DNA斑点时，通过用氩离子激光在波长为488nm时进行扫描而激发DNA斑点，使用520nm波长的滤光片获得荧光发射信号。在Use Test中，与DNA斑点杂交的靶DNA在550nm处被激发，使用570nm波长的滤光片获得荧光发射信号。在Use Test中，将20个核苷酸长的序列用作靶DNA，该序列中间(middle)具有对应于肝细胞核因子(HNF)-1α基因外显子4的密码子264的核苷酸C(胞苷)碱基，5’-末端结合有Cy3，被表示为(5’-Cy3-CACGGAGGTGCGTGTCTACA-3’)。
如图1所示，用精确匹配的和错配的探针各点9个斑点。斑点的直径为170±15μm，将斑点之间的间隔调整为375μm。
C.实验结果
如图1所示，在Use Test中，与4’-(氨基甲基)荧光素一起被固定化的探针斑点的荧光强度与无染料的探针斑点的荧光强度没有显著差异。显然，使用4’-(氨基甲基)荧光素不会影响靶DNA与探针斑点的杂交。
表1.QC Test和Use Test中使用凝胶基质的
DNA微阵列上的探针斑点的荧光强度4’-(氨基甲基)荧光素 QC Test Use TestPMMMPMMM0μM53845836034184381μM77069935153175452μM130611783476518661实施例2：cDNA芯片的斑点质量控制A.通过聚合酶链反应(PCR)扩增探针基因
使用DNA提取试剂盒(GAIGEN)分离能产生甘油醛孑-磷酸脱氢酶(GAPDH)的重组基因。在终体积为100μL的反应溶液中，通过PCR选择性扩增经分离的重组GAPDH基因。
使用50g纯的重组GAPDHDNA，2.5U热稳定的DNA聚合酶，每种dNTP(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)各200μM，50mM Tris-HCl，40mMKCl，1.5mMMgCl2，以及有义引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反义引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’)各100pmol。进行35轮PCR循环，每轮循环包括94℃变性30秒，55℃退火60秒，和72℃延伸90秒。于94℃预变性5分钟，最后于72℃再延伸5分钟。使用DNA提取试剂盒(GAIGEN)纯化扩增子，并将其用作探针固定于玻璃基质上。
B.点样经扩增的GAPDH基因：制备cDNA微阵列
在两个独立的试管中将扩增的GAPDH基因与50％ DMSO混合，使基因的终浓度为0.25mg/mL。在其中一个试管中加入FITC染料至终浓度为8uM。用Voltex混合器充分混合每个试管中的扩增基因，DMSO和FITC染料。将试剂混合物转移至384-孔板中以进行点样。以20×4的阵列将点样溶液点在经处理具有胺基团的玻璃基质上，80℃加热4小时。接着，处理玻璃表面未加载点样溶液的区域，使该区域的胺基团带负电，从而防止靶DNA吸附于非-点样区域，这是控制背景噪声所必需的过程。为此，将5g琥珀酐溶解于315ml1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在该溶液中搅拌加入35ml硼酸钠。玻璃表面用该溶液处理，用蒸馏水清洗并置于干燥器中。
用作荧光染料的FITC具有下式：
C.通过PCR制备经荧光标记的靶DNA
将上述实验中使用DNA提取试剂盒分离得到的，产生GAPHD的重组基因用于制备经荧光标记的靶DNA。在终体积为50μL的反应溶液中，通过PCR选择性扩增经分离的重组GAPDH基因。
使用50g纯的重组GAPDHDNA，2.5U热稳定性的DNA聚合酶，每种dNTP(dATP，dGTP，和dCTP)200μM，65μM dTTP，130μMCy3-dUTP，50mMTris-HCl，40mMKCl(pH8，3)，1.5mMMgCl2，以及有义引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反义引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGC CT-3’)各为100pmol。按照与上述实验相同的条件进行PCR。扩增子使用DNA提取试剂盒(GAIGEN)纯化，通过分光光度法测定其浓度。为了保持杂交的有效性，将纯化的GAPDH DNA的浓度恒定地调节至50ng/μL。在PCR过程中，通过加入Cy3-dUTP，用Cy3对GAPDH基因靶DNA进行荧光标记，所述靶DNA包括600个碱基对。
D.经荧光标记的靶DNA与cDNA微阵列杂交
于50℃，在4X SSC(标准的盐水-柠檬酸盐)，0.1％ SDS(十二烷基硫酸钠)，和10mg/mL BSA(牛血清白蛋白)的溶液中，将按上述制备的cDNA芯片预杂交45分钟，并用异丙醇和纯水洗涤。通过以500rpm离心3分钟从cDNA芯片上除去水。
于95℃将1μg上述实验中制备的经荧光标记的靶DNA变性5分钟，于冰上放置3分钟，与3XSSC，0.1％SDS，0.5mg/mL酵母tRNA和30μg/mL鲱精(herring sperm)DNA的溶液混合，并滴在cDNA芯片上。用盖玻片覆盖cDNA芯片以便所述溶液扩散，于50℃杂交过夜。于25℃用0.1XSSC(1.5mM柠檬酸钠，15mMNaCl，pH7.0)和0.1％ SDS的溶液将芯片基质洗涤1次，时间为5分钟，并用0.1XSSC洗涤2次，每次5分钟。接着，按照与上述相同的条件通过离心除去芯片基质中的水。
E.通过Cy3的荧光测定杂交敏感性
按照与实施例1相同的方法测定杂交敏感性。
图2显示了按上文所述进行的，在与靶DNA杂交之前扫描cDNA微阵列上斑点的结果(QC Test)，和与靶DNA杂交之后扫描cDNA微阵列上斑点的结果(Use Test)。
对QC Test而言，在扫描DNA斑点时，通过用氩离子激光在波长为488nm时进行扫描而激发DNA斑点，使用520nm波长的滤光片获得荧光发射信号。在Use Test中，与DNA斑点杂交的靶DNA在550nm处被激发，使用570nm波长的滤光片获得荧光发射信号。
如图2所示，在每个DNA芯片上点80个斑点。斑点的直径为170±15μm，将斑点之间的间隔调整为375μm。
F.实验结果
根据图2的结果，比较两种情况，即，使用FITC染料和不使用荧光染料时的荧光强度，结果示于下表2。
如表2所示，与FITC一起被固定的探针斑点的荧光强度与无染料的探针斑点的荧光强度没有显著差异。显然，使用FITC不会影响靶DNA与探针斑点的杂交。
表2.QC Test和Use Test中使用GAPDH扩增子的
cDNA微阵列上探针斑点的荧光强度 QCTest Use Test斑点直径强度斑点直径强度DNA探针--1489359DNA探针+FITC165189051509852
如上所述，在本发明的DNA微阵列质量控制方法中，检测与DNA探针一起共价固定于DNA芯片固体表面的荧光染料所发出的信号，并将其用于DNA微阵列的质量控制。与包括独立染色过程的常规质量控制方法相比，本发明的方法无需进行染色和除去染料的过程。
此外，在与靶DNA杂交之后，与DNA探针一起共价结合于DNA芯片固体基质上的荧光染料几乎不会影响DNA斑点的荧光强度，从而消除了常规方法中荧光染料影响杂交的可能性。
通过上述方法制备的DNA微阵列无需染色过程即可进行质量控制，所述DNA微阵列可提供可靠的，稳定的杂交结果。
与常规的质量控制方法不同的是，由于荧光染料与DNA探针一起与玻璃芯片表面的反应性基团共价结合，荧光信号的强度不会受DNA探针序列和长度的影响，从而能对不同的DNA探针斑点进行准确的质量比较。
尽管参照本发明优选的实施方案具体显示和描述了本发明，但本领域技术人员应理解在形式和细节上的多种变化并不偏离所附权利要求书中限定的本发明的精神和范围。