通过哺乳动物细胞的培养制备人血小板生成素多肽的方法 【发明背景】
在每个正常的成年人中，血细胞是在骨髓处从干细胞中通过一个称为“血细胞生成”的过程产生的。在几个增殖和分化步骤后，这些先祖多潜能细胞能够自体复制而不分化自身(核内倍增/自我复制)或者能够以4种主要分化方式产生一系列先祖细胞：a)细胞胞类(红血细胞或红细胞)；b)骨髓样(多形核白细胞和单核细胞)；c)淋巴样(淋巴细胞)和d)megakaryiotic(巨核细胞/血小板的产生源)。骨髓产生的量和细胞类型是受通过靶细胞上结合膜的受体起作用的复杂的细胞因子或生长因子的系统细微调节的过程。这些细胞因子包括异源组的生长因子，其包括白介素(其中有TNF-α、IL-3、IL-6、IL-8e IL-11)和称为“菌落刺激因子”(粒细胞集落刺激因子和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子[分别是G-CSF y GM-CSF]的糖蛋白激素；作为红细胞祖先的刺激因子的红细胞生成素和作为血小板先祖的刺激物的血小板生成素。
随着对血细胞生成和它的调节的了解地增加，人们利用了各种造血的细胞因子在医药治疗中。以这样的方式，已经包括在医学治疗中的有：
-红细胞生成素(EPO)，用于在慢性肾衰竭中治疗二次贫血。
-集落刺激因子(G-CSF y GM-CSF)，能够使接受化学治疗的癌症患者或那些接受骨髓移植的患者的免疫系统加速恢复。
-IL-2和干扰素-α，两者已经广泛用于化学治疗剂的结合治疗中。干扰素已经使用在慢性肝炎的治疗中，以及IL-2在AIDS治疗中与抗逆病毒剂结合使用，都有一定的疗效。
循环的血液血小板是在骨髓中产生的，并且在血液的凝结中起关键的作用。血小板与组织损伤位点黏连并且募集其他物质与之聚集，形成“初级止血栓子”。另外，它可以作为凝集因子受激产生纤维凝块的表面。在没有血小板时，这两种功能都没有，继而发生出血(1)。血小板的产生意味着骨髓干细胞增殖和分化成巨核细胞，其将产生在外周血液中正常循环的成熟的血小板(凝血细胞)。
产生血小板的生理过程需要来自巨核细胞谱系的作为生长和发育因子称为“血小板生成的”因子的存在。在临床医学中，血小板数目的降低(血小板减小)是涉及下面两个相关情况的一个很严重的并发症a)影响血小板的正常产生的疾病(初级血小板缺少症)和b)是癌症患者或接受骨髓移植的患者中治疗起源的并发症的后果(次级血小板缺少症)。这些患者中出血风险的增加实际需要施用来自有相关的生物学危险(变态反性、感染、免疫超敏感性)的正常供体的血小板浓缩物。从Kelemaen和cols(2)于1958年对血小板减少的动物中的血小板生成素活性的早期描述开始，我们不得不一直等到1994年才鉴定了该因子，通过了若干次的纯化和克隆，作为能够结合细胞受体MPI(应答鼠骨髓增殖白血病病毒的癌基因)的糖蛋白(3)，其鉴定为血小板生成素(或者称为：c-MPI配体；巨大生成素(Megapoietin)或巨核细胞生长和发育因子(MGDF))，能够特异地刺激巨核细胞的生成或血小板的生成(4-8)。具有血小板生成活性的其他因子已有叙述(9)，包括IL-6和IL-11，虽然它们是非特异的并且具有多效作用。分别施用高剂量的IL-11和IL-6已经导致了循环中血小板少量增加(10)。人血小板生成素的基因(hTPO)以单个拷贝定位于染色体3(3q26-27)。它编码353个氨基酸的蛋白质(10590个碱基对的可读框)，包括21个氨基酸(aa)的信号肽(63个碱基对)。成熟的蛋白质具有332个aa(996bp)并且估计分子量为38kDa(非糖苷化)。它具有6个便于产生70-80kDa的完全糖苷化蛋白质的N-糖苷化位点和一个在第153位和第154位的精氨酸之间的切割位点，其中蛋白质分成两个区：a)与已知的蛋白质没有同源性的高度糖苷化的C末端区，和b)与EPO有23％同一性的153个氨基酸的类似EPO区或N末端区。允许保守氨基酸取代，序列的保守性达到50％。重要的是强调，由于稳定性降低和在循环中快速净化，非糖苷化形式在体外而不是体内具有完全的活性。除了天然分子(70-80kDa)，已经叙述了几个循环中的TPO形式，作为它的部分蛋白质水解的结果，由30、25和18kDa形式组成，所有形式都截断在C末端区(9，11和12)。
目前，具有可获得的血小板生成活性和FDA(食品和药品管理局)批准的唯一因子是人重组IL-11。本发明的一般叙述
从一般的观察点来看，本发明涉及：
在一个方面，本发明提供了在哺乳动物宿主细胞中可复制的表达载体。这些载体包括下面的可操作连接的元件：1)转录启动子；2)编码天然hTPO的分泌性前导物或信号肽的第一DNA区段；3)编码完整的hTPO多肽的第二DNA区段；4)转录增强子；5)聚腺苷酸化信号和6)转录终止子。
在本发明的第二方面，提供了含有如上公开的DNA构建体的已培养的真核细胞系。优选的细胞系是哺乳动物细胞。
在第三方面，提供了对hTPO产生方法的叙述，其具有用前面所述的表达载体转染的细胞质起源的鼠细胞系。所以，这一细胞系获得了合成和分泌与它的天然等当物相同的生物活性人重组hTPO(rhTPO)的能力。本发明的详细说明
在描述本发明之前，和为了简化对它的理解，对本发明中利用的一些术语和方法进行概括和解释是有帮助的：
血小板生成素(TPO)其是在正常个体中主要由肝和肾细胞产生的糖蛋白。它能够特异地与刺激血小板生产的来自相同物种的MPI受体结合。MPI受体主要存在于多潜能干细胞、巨核细胞和血小板上。词头“h”参考了人TPO(hTPO)。术语hTPO包括了展示完整分子的定量的生物学活性(受体结合和体内血小板生产的刺激)的全长血小板生成素分子。
重组蛋白质当为了产生不是由细胞正常产生的蛋白质，通过重组DNA技术遗传修饰来自某起源的细胞时，获得了重组蛋白质的名称。通常，词头“r”表示它是重组生物分子。
cDNA(互补的脱氧核糖核酸)其代表称为逆转录的过程中所得到的核糖核酸(RNA)的互补拷贝，其中DNA聚合酶利用RNA作为模板(逆转录酶)。cDNA可以是单链或双链的。
表达载体其是线性或环状的DNA分子，包括编码与提供转录的其他区段可操作地连接的目的多肽的区段。这样的其他区段包括启动子和终止子序列。表达载体亦可以包括一个或多个复制起点、一个或几个可选择的标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常起源于质粒或病毒DNA，或者可以含有这两个元件。术语“可操作地连接”表示这些区段排列成使它们的作用与它们的使用目的一致，例如，转录起始在启动子，并通过编码区到终止子前行。在宿主生物中表达载体的复制可以是自身的或者通过整合进宿主基因组中。
前导或信号序列编码分泌性肽的DNA序列。信号序列亦称为前导或前序列。分泌性肽是指导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌的氨基酸序列。分泌性肽的特征是具有疏水氨基酸的核，并且通常(并非唯一)是在新合成的蛋白质的氨基末端发现的。十分常见情况下，分泌性肽是在分泌过程中经过一次或多次切割后从成熟蛋白质中切割出来的。这样的分泌性肽含有当它们通过分泌通道时，允许从成熟蛋白质切割分泌肽的加工位点。
启动子为了启动基因转录和产生对应的信使RNA而被RNA聚合酶识别的DNA序列。
转染通过导入DNA构建体遗传地修饰真核细胞的方法，所述构建体能够产生不是细胞正常产生的蛋白质。它们被描述为“转染细胞”。
本发明提供了用于获得具有已证明的生物活性的人重组TPO的材料和方法，总的实验设计具有如下步骤：
1.从已经进行了hepatobilliar手术的志愿者供体得到的正常人的肝中分离总RNA。
2.通过逆转录过程从RNA得到总cDNA，和利用特异引物从cDNA扩增hTPO的完整的序列(表II)。
3.进行了含有hTPO的特异cDNA的表达载体的构建，它的形式是能够导入真核细胞的，以便诱导人血小板生成素的表达和产生。
4.在可以体外培养的哺乳动物细胞系中，通过常规电穿孔技术导入载体。
5.在细胞生长的人工培养基中加入新霉素抗生素。选择已经成功掺入表达载体的细胞，因为这些细胞携带编码对抗生素新霉素有抗性的基因。
6.通过限制稀释的方法，选择含有表达载体的个体细胞。产生明显量的重组人血小板生成素的细胞称为“克隆”。
7.利用培养上清液，通过它们可选择性诱导的能力，在体外和体内分析中测试它的生物学活性：a)在体外培养物中，造血前体向巨核细胞分化；b)TPO依赖的细胞系增殖；c)在血小板减少的动物中，血液循环中的血小板增加(体内刺激血小板生产)。
鉴定为NM000460的核苷酸序列和鉴定为对应于成熟的hTPO的SEQ N°1的氨基酸序列表示在表I(5)中。序列NM 000460和SEQ N°1表示hTPO的单个等位基因，其中可能存在不同的等位基因变体。从已克隆的细胞、人组织或DNA制备物中可以得到那些变体。该序列用于获得对扩增特异的TPO物质和其后的克隆和纯化所需要的引物。在本发明中，我们进行了从正常的肝组织中克隆和获得对应于包括它的信号肽的完整hTPO的cDNA。在本发明中未利用相同的序列的部分或修饰的片段。
在本发明中构建的表达载体(在哺乳动物细胞中可复制)，如前所述，按顺序包括：a)转录启动子，派生自人B淋巴细胞的基因组文库得到的人免疫球蛋白的κ链的可变基因；b)编码hTPO的特异信号肽的DNA的第一区段；c)编码全长的成熟hTPO多肽的DNA的第二区段；d)转录增强子，派生自人κ基因的内含子区域(来自人B淋巴细胞的基因组文库)；e)聚腺苷酸化信号；f)转录终止子；g)对作为细菌系统中选择性标记的氨苄青霉素有抗性的基因的完整序列；h)对作为真核细胞系统中选择性标记的新霉素有抗性的基因的完整序列；I)允许在细菌中扩展的细菌复制起点。编码成熟hTPO多肽的DNA区段的转录和转导的直接产物可以依赖于转导后的加工，即通过称为“N-连接糖基化或O-连接糖基化”的化学键加入不同的化学基团，其中包括碳水化合物的联合。这一转导后修饰的准确性质将最大地，但不是唯一地由用于生产重组hTPO的宿主细胞的类型来决定。
在本发明中利用的适当的宿主细胞包括可经改造以表达异源DNA、可以在培养基中生长并且具有有效的分泌途径的任何类型真核细胞。符合这些要求的优选的细胞有本领域已知、并且可以从公共保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，马里兰州(ATCC)得到、由鼠骨髓瘤派生的那些。为了给出一个参考，细胞系是X-63(P63X63Ag.563(ATCC N°CRL-1580)和SP2(ATCC N°CRL-1581和CRL-8287)。为了指导hTPO多肽进入宿主细胞的分泌途径，将编码分泌性前导物的DNA序列和编码hTPO多肽的DNA序列组合使用。在本发明中，利用的信号肽对应于天然hTPO(在表I中SEQ 1以黑字体出现的氨基酸序列)。通常需要强的转录启动子，如便于参考包括在此的免疫球蛋白、派生自SV40、腺病毒或巨细胞病毒的病毒启动子。
药物选择是允许选择那些已经成功掺入表达载体的哺乳动物培养细胞的广泛使用的方法。这些细胞通常称为“转染体”。在存在选择剂时培养的并且能够将目的基因传递给它们的子代的细胞称为”稳定转染体”。优选的可选择标记是编码对抗生素新霉素有抗性的基因。筛选在新霉素型药物如G-418等存在下进行。选择系统也可以用于增加目的基因的表达水平，一个称为“扩增”的过程。扩增是在存在低水平选择剂下培养转染体，然后增加选择剂的量从而选择产生高水平的导入基因产物的细胞来进行的。可以使用的其他药物抗性基因可以是潮霉素、多药物抗性基因、二氢叶酸还原酶和嘌呤霉素乙酰基转移酶。
有许多方法可以在哺乳动物的细胞中掺入外源DNA，其中我们强调的有：a)磷酸钙介导的转染；b)电穿孔(14)；c)DEAE葡聚糖介导的转染(Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方案)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)和d)阳离子脂质体介导的转染。用于本发明的优选的方法是电穿孔。转染细胞是在常规的培养基中培养的，培养基中含有细胞生长的必需营养物，以及必需的抗生素，以便选择已经掺入了外源DNA的细胞。
根据本发明制备的hTPO多肽可以治疗性地用于需要增加血小板生产的地方，如各种疾病包括再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合症、化疗或先天性血小板减少所诱导的血小板减少症的治疗中。
血小板减少症的特征是血液循环中血小板的减少，并且明显是皮肤和粘膜出血增加。血小板数量的降低可能是由于例如血小板生产的缺陷、血小板的异常分布、大量输血导致的稀释性损失或血小板的不正常破坏而造成的。另外，某些恶性肿瘤可以损伤血小板的生产和血小板的分布。用于杀死恶性细胞的放射性治疗也杀死血小板的先祖细胞。血小板减少症也可出现由药物、新生儿同种免疫性或血小板输血性同种免疫性诱导的各种血小板自身免疫紊乱。hTPO多肽可以减少或消除对输血的需要，从而降低血小板同种免疫性的发生率。血小板的不正常破坏可以是下面因素导致的：1)在血管移植中或受外伤的组织中的血小板消耗的增加；或2)与例如药物诱导的血小板减少、自发性的血小板减少症紫瘢(ITP)、自身免疫疾病、血液学紊乱如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的转移性癌症相关的免疫机制。hTPO的其他适应症包括再生性障碍贫血和由例如化学治疗或AZT对HIV感染的治疗所导致的药物诱导的骨髓抑制。
rhTPO也可以于其他细胞因子如SCF、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF相关。rhTPO的治疗剂量范围是每天0.1到100μg/kg(优选0.5-50μg/kg/天)。准确的剂量必须通过每个特殊病例中的临床评估来确定。rhTPO是在化学治疗或骨髓移植后给药28天，或直到血小板数大于20,000/μl，优选50,000/μl。
rhTPO多肽也是体外研究造血细胞分化和发育的的有价值的工具，如用于阐述细胞分化的机制，或用于决定成熟细胞的谱系，并且也可以发现作为细胞培养中的增殖剂的实用性。
rhTPO多肽也可以离体使用，如用于自身的骨髓培养。简要地说，在化学治疗前，将骨髓从患者体中移出，并用rhTPO多肽处理，任选与一个或多个其他细胞因子组合使用。然后，将经处理的骨髓在化学治疗之后返回到患者，以加速骨髓的恢复。另外，rhTPO多肽也可以用于离体扩展骨髓或外周血先祖(PBPC)细胞。在化学治疗之前，可以用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以将早期的先祖细胞释放到外周循环中。可以从外周血中收集并浓缩这些先祖细胞，然后用一个或多个rhTPO多肽，任选结合一个或多个其他的细胞因子在培养物中处理，这些其他的细胞因子包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，从而分化和增殖成高密度的巨核细胞培养物，然后可以将培养物在高剂量化学治疗之后返回到患者体中。
rhTPO的另一个潜在的用途是它在几个诊断方法中的用途，进行这些诊断是为了确定抗TPO抗体的存在，这些抗体已经证实在自身免疫血小板减少症中。
本发明进一步通过下面的非限制性实施例说明。实施例实施例1
为了得到hTPO的特异cDNA，从正常成年人的肝组织获得mRNA。为了分离总RNA，对来自正常成年人的肝组织碎片(50mg)进行加工。利用经典的萃取方法进行这一过程，方法中利用了硫氰酸胍酚-氯仿。通过260/280吸光度的比例来确定总RNA的纯度和浓度。实施例2
hTPO特异mRNA的cDNA合成(逆转录)。利用合成Oligo(dT)12-18和逆转录酶(SuperScriptTM II，Gibco-BRL-Life Technologies)，从5ug总RNA中，通过逆转录合成cDNA的第一链。进行分析的总体积为20μl，其中含有：4μl缓冲液5X(250mM Tris-HCl pH8.3；350mM KCl；15mMMgCl2；0.1M DTT)；1μl的Oligo(dT)500μg/ml；2μl DTT 0.1M；1μl10mM dNTP；5μg总ARN和用水补齐20μl。实施例3
扩增编码完整hTPO的特异cDNA。通过“嵌套式PCR”技术(聚合酶链式反应)扩增目的序列。这是通过设计双引物对和结合热稳定DNA聚合酶进行的，以便扩增编码具有高度特异性和保真度的成熟蛋白质的序列。在这个意义中，利用了高保真度的扩增系统。这一系统是由Taq聚合酶和Pow DNA聚合酶的适当混合物组成的(EHF；ExpandTM High Fidelity PCR System，Boehringer Mannheim)。两轮扩增中所用引物的序列在表II中描述。扩增反应的总体积是100μl，其中加入了：
-2μl(dNTPs 200□M)
-3μl(10mM正向引物)
-3μl(10mM反向引物)
-10μl(缓冲液10X)
-0.75μl(热稳定聚合酶EHF)
-5μl(cDNA)
-76.25μl(水)
用外引物TPOEXT-FOW y TPOEXT-REV(参见表II A)进行第一轮扩增，然后将反应进行30个扩增循环的温育(先在95℃温育2分钟)。
- 循环1-10：95℃30秒、58℃30秒和72℃120秒。
- 循环10-20：95℃30秒、58℃30秒和72℃240秒。
- 循环20-30：95℃30秒、58℃30秒和72℃360秒。
- 最后的延伸阶段：72℃10分钟。
用内引物TPOFOW y TPOREV(参见表II B)在相同条件下进行第二轮扩增，但以2μl的第一轮扩增反应产物来代替第一轮中5μl的cDNA。反应条件是20次扩增循环，并先在95℃温育2分钟，描述如下：
- 循环1-10： 95℃30秒、62℃30秒和72℃120秒。
- 循环10-15：95℃30秒、62℃30秒和72℃240秒。
- 循环15-20：95℃30秒、62℃30秒和72℃30秒。
- 最后的延伸阶段：72℃10分钟。实施例4
为了克隆，纯化和制备hTPO扩增的cDNA。通过电泳，在低融点的琼脂糖凝胶(1％)中分离和鉴定扩增产物。含有1107个碱基对的条带的凝胶部分被切出，分离和纯化出DNA(Nucleiclean Sigma)。其中利用了纤维-玻璃微球体的容量的技术以便在饱和的碘化钠介质中强结合该DNA，同时此介质能够溶解琼脂糖(16)。DNA采用酚/氯仿抽提、乙醇洗涤、乙醇沉淀并最后悬浮于10μl的水中。为了在3′OH的末端掺入腺嘌呤核苷酸用于A-T载体中克隆，用Taq DNA聚合酶、缓冲液和dATP，在72℃温育纯化的片段10分钟。利用酚/氯仿萃取、乙醇沉淀，再次抽提和纯化此片段，然后重悬浮于20μl的水中。准备连接cDNA片段，并克隆进A-T克隆载体系统中。实施例5
将扩增的cDNA片段克隆到A-T克隆载体系统中。把实验4中的纯化片段与pCR2.1质粒(Original TA Cloning Kit；invitrogen)连接。利用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)、pCR2载体和纯化的cDNAhTPO，在下面的盐性介质中进行连接：
-2μl的实施例4中纯化的TPO片段
-1μl的连接缓冲液10X
-2μl的pCR2.1载体(25ng/μl)
-1μl的T4 DNA连接酶(4个单位)
-4μl的水
在14℃酶连接温育16小时。
用已连接的质粒转化感受态的大肠杆菌菌株(One ShotTM TOP 10F′；Invitrogen)。这些载体允许：a)由于存在氨苄青霉素的抗性基因，获得包括质粒的细菌菌落；b)鉴定具有含编码hTPO的cDNA插入体的质粒的细菌菌落。这是根据在载体中存在lacZa□基因来进行的，是IPTG异丙基硫代-β-半乳糖苷诱导的，允许追踪，根据X-Gal水解鉴定白色/蓝色细菌菌落；c)从阳性细菌菌落中通过在LB(Luria-Bertani)中的微型培养分离大量的质粒(微型制备)，以便进行限制分析和利用M13引物对插入体进行测序以便证明该序列。
在限制分析后，得到了10个阳性菌落，相关性地称为pCR2 TPO-1到pCR2 TPO-10。
将分离的菌落分成3组：
-菌落pCR2-1、-2、-4和-9，匹配hTPO的对应序列，其中12个碱基(4aa)缺失，与前面所述的称为TPO2(17)的同工型相同。
-菌落pCR2-5、-6、-7、-8和-10，匹配天然hTPO的完整序列，其中没有氨基酸取代。
-菌落pCR2-9，匹配hTPO的对应序列，具有与前面所述的TPO3的同工型相同的116个bp的缺失(17)。
对插入体进行测序，以便准确地鉴定，方法如Sanger和cols所述(18)。对两条链完全地进行测序。
选择对应于菌落pCR TPO-5的质粒制备物以继续下面的实验步骤。实施例6
用编码成熟的hTPO(pK-eTPO)的序列设计载体。根据下面的特征构建真核生物表达载体
1.新霉素-抗性基因(Neor)，以在含有新霉素(G-418)的培养基中阳性选择转染细胞
2.免疫球蛋白基因的启动子序列
3.含有限制位点ClaI和NotI的克隆区域
4.人免疫球蛋白转录的增强子
5.大肠杆菌的原核复制起点(ColE1 ori)
6.氨苄青霉素抗性基因(Ampr)
7.派生自SV40的真核生物复制起点(SV 40ori)
所有这些部分是按逻辑排列的，以保证对应rhTPO基因的转录和转导。构建的表达载体鉴定为pK，并在图1中有图解。实施例7
利用编码成熟hTPO的序列构建真核生物表达载体(pK-eTPO)。具有编码hTPO的DNA片段并且其序列完全证实的pK表达载体的构建体称为pK-eTPO。图1中描述了包括所有功能区段的pK-eTPO结构的图解。在下面的各个实验时期进行了构建；时期1
首先，设计含有ClaI和NotI限制位点的表达引物(参见表II C)，并且称为Cla-eTPOFOW和Not-eTPOREV。它们允许：
(1)扩增编码hTPO的序列，该序列包含在从pCR2 TPO-5得到的克隆载体中。
(2)在酶连接反应后，为了在pK载体中导入编码包括信号肽的hTPO的完整序列，导入两个限制位点(ClaI和NotI)。
在pCR2 TPO-5中含有的，并且经修饰含有ClaI和NotI限制位点的扩增hTPO片段被称为eTPO-5。扩增反应在下列总体积为50μl(TaqDNA聚合酶试剂盒；Gibco BRL-Life Technologies)中进行：
-2.5μl(dNTP 10mM)
-2.5μl(10mM Cla-eTPOFOW)
-2.5μl(10mM Not-eTPOREV)
-5μl(缓冲液10X)
-0.5μl(Taq聚合酶)
-5μl(pCR2 TPO-5的1/100,000的稀释液)
-1.5μl MgCl2(50mM)
-30.5μl(水)
温育条件：95℃下一个4分钟的循环；25个循环的95℃30秒、65℃30秒、72℃30秒；和最后的一个延伸循环是72℃10分钟。时期2
利用电泳技术在低融点的琼脂糖凝胶(1％)中分离和鉴定扩增产物。切出含有1090个bp的带的凝胶部分，并分离和纯化该DNA(Nucleiclean，Sigma)。这是通过利用纤维-玻璃微球体的容量的技术进行的，以便在饱和的碘化钠介质中强烈地结合该DNA，同时所述碘化钠介质能够溶解琼脂糖(16)。然后，用乙酚/氯仿萃取DNA，洗涤，乙醇沉淀，最后再悬浮于15μl的水中。时期3
为了进行酶限制分析和核苷酸测序以便证实该片段与天然hTPO具有完全的同一性，根据下面的反应方案将纯化的eTPO片段连接进pCR2-1载体中：
-1μl的eTPO片段
-1μl的连接缓冲液10X
-2μl的pCR2.1载体(25ng/μl)
-1μl T4 DNA连接酶(4个单位)
-5μl水
在4℃，温育反应16小时。利用连接产物转化感受态大肠杆菌菌株(One ShotTM TOP 10F′；invitrogen)，允许根据销售商的技术说明书进行扩展。鉴定和分离了含有准确携带eTPO插入体的质粒的6个细菌菌落。它们称为pCR2-eTPO 1到6。把它们中的每一个用含氨苄青霉素的LB培养基进行微型培养，以便分离质粒物质(微型制备)。时期4
对插入体eTPO-1到6进行鉴定和测序。利用BamHI限制图谱达此目的，然后在全自动测序仪(ALF-EXPRESS；Pharmacia)中采用Sanger和cols(18)所述的方法进行测序以证实两条DNA链中完整的核苷酸序列。表1表示了鉴定为“ETPO”的核苷酸序列，其对应于质粒pCR2-eTPO2质粒，相比较的序列是NM000460(Sauvage等，1994)。如所描述，得到的序列与用作参考的序列相同。选择pCR2-eTPO2质粒进行随后的步骤。时期5
在连接到eTPO片段之前，用ClaI和NotI酶消化真核生物pK表达载体。为了进行消化，在37℃温育如下的酶反应4小时：
-10.0μl载体pK质粒制备物
-2.0μl Cla I酶制剂(Sigma)
-1.5μl NotI酶制剂(Sigma)
-5.0μl缓冲液10X
-31.5μl水
利用低融点琼脂糖凝胶(1％)的电泳技术分离和鉴定酶消化后的线性载体。切出其中包含载体的区域，并通过透析膜电洗脱分离和纯化DNA。用酚/氯仿萃取DNA，洗涤，和乙醇沉淀，最后再悬浮在15μl水中。时期6
为了得到eTPO-2片段，利用ClaI和NotI酶消化pCR2-eTPO2。对于消化，利用了下面的酶反应，在37℃温育4小时：
-5.0μl pCR2-eTPO2质粒制备物
-2.0μl ClaI酶制剂(Sigma)
-1.5μl NotI酶制剂(Sigma)
-5.0μl缓冲液10X
-36.5μl水
利用低融点琼脂糖(1％)的电泳技术从eTPO2片段上分离酶消化后的线性载体。切出其中含有eTPO2片段的凝胶区，通过利用纤维-玻璃微球体的容量的技术分离和纯化DNA，以便在同时能溶解琼脂糖的饱和碘化钠介质中强烈地结合DNA(16)。用酚/氯仿萃取DNA，洗涤，乙醇沉淀，最后再悬浮于15μl的水中。时期7
利用T4 DNA连接酶(Pharmacia)，按照供应商的技术说明书，将pK载体与eTPO-2纯化片段连接。用酚/氯仿萃取方法纯化称为pK-eTPO的这一连接反应产物，用乙醇沉淀，最后再悬浮于15μl的水中。时期8
通过电穿孔，用构建的pK-eTPO转染大肠杆菌(菌株XL1)。在1mm杯中，将40μl的电感受态XL-1菌株与2μl的第7时期得到的纯化连接物放置在一起。用电阻129Ω、电容50uF的1380v的脉冲激发5毫秒。脉冲后加入800μl的LB培养基。在37℃下200rpm的轨道温育器中温育45分钟后，接种在LB琼脂氨苄青霉素的平板中。
分离两个阳性菌落，并在LB-氨苄青霉素中扩展，过夜微培养。用常规方法(“微型制备”)萃取质粒以便通过扩增和限制酶分析来证明插入体。以这种方法，获得pK-eTPO的纯化的质粒片段。实施例8
用PuvI线性化pKeTPO载体和选择待转染的哺乳动物细胞系。一旦得到pK-eTPO，尽管从哺乳动物派生的任何细胞最后都可以利用这一表达质粒，但是选择从已知为X-63的鼠骨髓瘤(P3X63Ag8.653，ATCC N° CRL 1580)派生的哺乳动物细胞系。在不同的细胞系中，选择这一个是因为它具有如下的优点：a)因为它包括与免疫球蛋白的转录增强子连接的免疫球蛋白基因的启动子，因此在本发明中，它具有完全适应设计的表达载体的蛋白质(免疫球蛋白)的高效合成和分泌系统。另外，在体外培养基如用胎牛血清(FBS)10％补充的RPMI-1640中能够不确定地生长。根据下面的反应，用PvuI(Boehringer Mannheim)将pKeTPO载体线性化：
-20μl质粒pKe TPO部分
-5μl缓冲液H(10X)
-2μl PvuI
-23μl水
在37℃将反应物温育4小时，用酚/氯仿萃取纯化该物质，用乙醇沉淀，最后回收在10μl的水中。实施例9
用pKeTPO载体转染X-63细胞。在含有10％FBS的RPMI-1640(Gibco BRL-Life Technologies)中体外扩展实施例8中所述的哺乳动物细胞(X-63)，然后在无FBS的RPMI-1640中洗涤。将它们以下面的浓度再悬浮：在800μl不含FBS的RPMI 1640中有150万个细胞。然后，将800μl的细胞放置于2mm的电穿孔杯中，加入10μg的pKeTPO质粒。在下面的条件下，电穿孔(BTX电穿孔系统600；GenetronicsBiomedical LTD)进行13毫秒：
-C：1200uF；R：48Ω；V：210V；E：1.050kV/cm
在37℃和5％CO2下，在含有20％FBS的RPMI中使电穿孔细胞培养24小时。实施例10
筛选和选择生产rhTPO的克隆细胞。如实施例9所述，在转染细胞后，它们分布在有新霉素的3个不同的培养物组(培养物I、II和III)。基本培养基是RPMI 1640，其中含有10％的FBS和链霉素-青霉素(分别为50mcg/ml和100UI/ml)、2mM L-谷氨酰胺、1μM丙酮酸钠以及10mM Hepes(生长培养基)。在培养了15天后，培养基中有微弱的变化，利用抗-hTPO抗体(RDI；Research Diagnostics，Inc.)进行蛋白质印迹来分析上清液中分泌的rhTPO。作为阴性对照，利用了用pKκ载体转染的X-63细胞的上清液。这些程序与包括免疫球蛋白的κ人链的TPO而不是rhTPO插入体的那些程序相同。
培养物II的上清液产生rhTPO的微弱阳性，通过限制稀释(细胞稀释：在含有20％FBS和1mg/ml新霉素的RPMI1640的96孔平板中放置0.3个细胞/孔)进行克隆。在15天后，分离58个新霉素抗性克隆。加工上清液，通过蛋白质印迹来评估rhTPO的存在。分析发现存在产生和分泌rhTPO的16个克隆。分离称为2A4的克隆，由于在培养上清液中检测到显著量的rhTPO，所以通过限制稀释再次克隆，以保证它的克隆性(clonaility)。
如图2所示，在通过蛋白质印迹分析后，选择来自2A4的亚克隆16，称为亚克隆24A-16。在不间断地培养8星期后，测试利用亚克隆24A-16的rhTPO的生产稳定性(参见图2)。来自称为24A-16的X-63细胞和以稳定方式生产可溶性rhTPO的克隆称为克隆X-63 eTPO。实施例11
分析这一表达系统中产生的rhTPO的存在和生物活性。利用X-63eTPO培养物的上清液，以0.6×106细胞/培养的浓度，有RPMI 1640、10％FBS存在时，体外进行测试生物活性的实验：
通过ELISA测定TPO的浓度。利用人TPO的试剂盒(Quantikine，R&D系统)进行ELISA实验。在标准培养条件下，经确认大约的浓度是0.5mcg/ml。
利用Baf-MPI细胞系进行体外生物实验。Baf-mpI细胞系(1994年9月28日根据布达佩斯条约以ATCC N° CRL-11723保藏)对应于用MpI受体(TPO受体)转染的鼠系Baf-BO3。亲本系Baf-BO3依赖于IL-3，转染的系Baf-mpI依赖于IL-3或TPO。实验是基于在48小时的过程中，有不同浓度的细胞因子或正在测试的上清液存在下温育细胞。在这一时期后，用[3H]-胸腺嘧啶温育12小时，其后通过滤器回收细胞，然后放置于瓶中，其中通过液体闪烁计数测试放射性。在96孔板中进行两个实验，在不同浓度时测试上清液：10％、3％、1％、0.3％、0.1％、0.03％、0.01％和0.003％，对Baf-mpI细胞(30,000细胞/孔)做三份。以10ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml、0.1ng/ml、0.03ng/ml、0.01ng/ml和0.003ng/ml的浓度用标准TPO制作剂量-依赖的曲线。为了保证该细胞系对分析的细胞因子应答，用IL-3进行内控的测试。在没有生长因子时做阴性对照的测试。用亲本系Baf-BO3同样操作，以便在测试上清液中消除IL-3的影响。实验显示了相同的结果，在X-63eTPO上清液培养物中显示0.4mcg/ml的rhTPO标准活性。
体外增殖和分化来自CD34+骨髓细胞的先祖巨核细胞。通过采用Ficoll-Hypaque的梯度密度离心获得骨髓细胞CD34+，然后进行免疫磁性选择(Miltenyi，MiniMACS)。在允许向巨核细胞谱系分化的条件下将这些细胞培养在液体培养基中。这些条件是：用运铁蛋白(transferrine)、胰岛素、牛血清白蛋白、脂质体补充的无FBS的Iscove培养基和有TPO的存在。在24孔的平板中(100,000个细胞/孔)，用不同稀释度的标准rhTPO或X-63eTPO克隆的上清液培养CD34+骨髓细胞。在10天后，测试细胞的增殖(细胞数)，和用结合FITC的抗-CD41单克隆抗体标记它们产生巨核细胞的百分数，并用流式细胞仪分析。测试4个不同浓度的rhTPO(20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml)。观察到70％的细胞属于巨核细胞谱系(CD41阳性细胞)。在3个不同浓度：10％、5％y 2.5％测试来自X-63 eTPO的上清液。分别观察细胞数有3、2和1.5倍的增加。关于巨核细胞的生长，我们得到了75％的CD41+细胞，在三种情况下，巨核细胞的绝对数目是根据涉及细胞增殖的上清液的浓度而发生变化。通过流式细胞仪分析的代表性的结果表示在图3，其中可以理解的是，2.5％的上清液培养物能够诱导与5ng/ml标准hTPO诱导相等同的表达水平。表I.hTPO NM 000460的参照核苷酸和氨基酸序列 [de Sauvage等，Nature 369，533-538(1994)] SEQ N°1 NM 000460 ETPO M E L T E L L L V V M L L L T A CATATCGATTTCTCACAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA ................................................ - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM O00460 ETPO R L T L S S P A P P A C D L R V L S K L L R AGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGT .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO D S H V L H S R L S Q C P E V H P L P T P V GACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO L L P A V D F S L G E W K T Q M E E T K A Q CTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAG .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO D I L G A V T L L L E G V M A A R G Q L G P GACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO T C L S S L L G Q L S G Q V R L L L G A L Q ACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAG .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO S L L G T Q L P P Q G R T T A H K D P N A I AGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO F L S F Q H L L R G K V R F L M L V G G S T TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO L C V R R A P P T T A V P S R T S L V L T L CTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO N E L P N R T S G L L E T N F T A S A R T T AACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACT .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 G S G L L K W Q Q G F R A K I P G L L N Q T GGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACC ETPO .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO S R S L D Q I P G Y L N R I H E L L N G T R TCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGT .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO G L F P G P S R R T L G A P D I S S G T S D GGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGAC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO T G S L P P N L Q P G Y S P S P T H P P T G ACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGA .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO Q Y T L F P L P P T L P T P V V Q L H P L L CAGTATACGCTCTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTT .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO P D P S A P T P T P T S P L L N T S Y T H S CCTGACCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCC .................................................................. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SEQ N°1 NM 000460 ETPO Q N L S Q E G # CAGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGCGGCCGCTCT .................................... - - - - - - - -
(.)相同的核苷酸序列
(-)相同的氨基酸序列
(#)终止密码子
ETPO代表本发明中得到的hTPO的序列
分泌肽以黑字体描写
内引物以下划线字体表示表II.用于扩增人TPO的引物的序列A.第一轮嵌套式PCR中所用的引物 -TPOEXT-FOW.(外正向引物)CAG GAA GGA TTC AGG GGA GAG G -TPOEXT-REV.(外反向引物)GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA CB.第二轮嵌套式PCR中所用的引物 -TPOFOW.(内正向引物) AGC CAC GCC AGC CAG ACA CCC C -TPOREV.(内反向引物)GCA GTG TCT GAG AAC CTT ACC CC.用于将限制位点ClaI y Not I插入到编码hTPO的DNA片段中的引物 -Cla-eTPOFOW.CAT ATC GAT TTC TCA CAA TGG AGC TGA CTG AAT TGC TCC -Not-eTPOREV.AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TTC TGG G
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