重组质粒PDSBCM，转化微生物， 产生一种碱性蛋白酶VAPK的方法 【技术领域】
本项发明涉及一种包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的基因vapk二聚体的重组性质粒载体pDSBCm，该重组性质粒载体转化的一种微生物metschnikovii弧菌，以及应用该微生物来产生一种碱性蛋白酶VapK的方法。背景技术
一般而言，一种来源于弧菌的碱性蛋白酶，常常作为一种酶所提及，在碱性条件下，它可降解蛋白质成为氨基酸和小分子肽，并且，有许多众所周知的微生物，诸如杆菌和沙门氏菌均能分泌碱性蛋白酶。
应用上述的微生物来产生碱性蛋白酶的最重要的因素，是碱性蛋白酶的高生产率问题，这可以影响生产过程中的成本。
根据最近的发明，为了提高碱性蛋白酶的生产率，包含有编码碱性蛋白酶的重组性载体可以应用基因工程的技术加以制备，并且由此制备而来的转化体。
本发明人此前所申报的一份名为“用于洗衣店去污剂地碱性蛋白酶VapK，vapk基因，重组性表达载体，以及经转化的微生物”专利申请(KR1999-12588)，其中的微生物是metschnikovii弧菌KS1，并且重组性表达载体为pSBCm。本发明应用了与之相同的微生物和重组性表达载体。
为了得到具高度活性碱性蛋白酶的转化微生物，本发明人曾经进行了深入细致和广泛地研究并加以验证，并且制备了一种包含有双重碱性蛋白酶基因的重组性质粒载体，分离自metschnikovii弧菌KS1，而且，转化的metschnikovii弧菌带有上述的重组性质粒载体，因此，产生了带有已提高了蛋白酶活性的质粒载体的转化微生物。发明内容
本发明提供一种重组性质粒载体pDSBCm，这种载体包含有双重vapk基因，该基因可编码一种碱性蛋白酶。
本发明还提供了一种得到上述重组性质粒载体pDSBCm的方法，得到重组性质粒载体pDSBCm包括以下步骤：
将par基因插入到包含编码碱性蛋白酶的vapk基因以制备重组性质粒载体pSP1，其中的par基因具有改善质粒载体自身的稳定性的功能；
反向定位重组性质粒载体pSP1的基因vapk，以制备一种重组性质粒载体pSPR1；
应用限制性内切酶EcoRI在pSPR1的vapk基因和par基因之间进行酶切消化，经核酸外切酶Bal31进行处理，并且应用连接酶加以连接制备而成缩短了长度的一种质粒性载体pSPR1-47；
应用HindIII对质粒性载体pSPR1-47进行酶切消化，并将vapk基因插入到经HindIII酶切过的pSPR1-47中。
还有，本发明提供了一种已转化的宿主细胞，它包含有所述重组性质粒载体pDSBCm。
此外，本发明提供了一种已转化的宿主细胞，该宿主细胞包括埃菲氏属大肠杆菌或者metschnikovii弧菌。
本发明还提供了一种应用上述的转化的宿主细胞产生一种碱性蛋白酶VapK的方法。附图的简要说明
在下文中，参考附图对本发明作一详细的描述。
图1说明了包含有编码一种碱性蛋白酶vapk基因的重组性质粒载体pSBCm的电泳结果。电泳泳道M代表的是标准参照物的大小，电泳泳道1代表的是重组性质粒载体pSBCm，电泳泳道2代表的是重组性质粒载体pSBCm/HindIII，它由一种2.2千碱基对的运载体pKF3和一种2.9千碱基对的弧菌的碱性蛋白酶基因所组成。
图2说明了分离自应用pSBCm转化过的metschnikovii弧菌KS1和埃菲氏属大肠杆菌的每个碱性蛋白酶VapK的SDS-PAGE结果。电泳泳道M代表的是标准参照物的大小，电泳泳道1代表的是已转化的埃菲氏属大肠杆菌的碱性蛋白酶的表达，电泳泳道2代表的是metschnikovii弧菌KS1表达的2.9千碱基对的碱性蛋白酶。
图3说明了在脱脂乳琼脂培养基中的每个碱性蛋白酶VapK的活性检测的结果，碱性蛋白酶VapK分离自应用pSBCm转化过的metschnikovii弧菌KS1和埃菲氏属大肠杆菌。电泳泳道1代表的是已转化的埃菲氏属大肠杆菌表达的碱性蛋白酶的活性，电泳泳道2代表的是mestchnikovii弧菌KS1表达的碱性蛋白酶的活性。
图4说明了包含有碱性蛋白酶基因vapk的重组性质粒载体pSBCm的限制性内切酶谱。
图5说明了包含有碱性蛋白酶基因vapk和par基因的重组性质粒载体pSP1的限制性内切酶谱。
图6说明了包含有par基因和反向碱性蛋白酶基因vapk的重组性质粒载体pSPR1的限制性内切酶谱。
图7说明了包含有par基因和反向碱性蛋白酶基因vapk的长度缩短的重组性质粒载体pSPR1-47的限制性内切酶谱。
图8说明了包含有编码双重碱性蛋白酶的vap堪因的重组性质粒载体pDSBCm的限制性内切酶谱。
图9说明了的metschnikovii弧菌KS1、metschnikovii弧菌pSBCm、和metschnikovii弧菌pDSBCm之间碱性蛋白酶活性比较的结果。本发明的详细描述
本发明提供了一种由包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的基因二聚体的重组性质粒载体转化的微生物，并且提供了一种应用上述的微生物生产出更高产量的碱性蛋白酶VapK的方法。
其中所应用的专业术语“基因二聚体”的意思是把带有相同核苷酸序列的两个基因可操作性的连接在一起。
本发明中，编码碱性蛋白酶的基因是经过以下的几个步骤加以分离的：培养metschnikovii弧菌KS1，离心并回收metschnikovii弧菌KS1细胞，使这些细胞破裂并将其离心以获得无细胞的上清液，以及从这种无细胞的上清液中提取metchnikovii弧菌KS1的染色体DNA。应用以上提取的metschnikovii弧菌KS1的染色体DNA，形成转化的埃菲氏属大肠杆菌，即通过应用如HindIII的限制性内切酶，酶切消化上述的metschnikovii弧菌KS1的染色体DNA，形成DNA片段，将这些DNA片段克隆入质粒载体中，构建成为pSBCm、pSP1、pSPR1、pSPR1-47和pDSBCm，并将这些载体转化入埃菲氏属大肠杆菌中。
首先，碱性蛋白酶的表达是通过应用上面所提及的重组埃菲氏属大肠杆菌加以引导的，该大肠杆菌中包含有质粒载体pSBCm，并且在碱性的情况下，由转化的埃菲氏属大肠杆菌所产生的碱性蛋白酶的表达水平是可以测量的。在这种结果的基础上，正如我们以前所知道的，上面所提及的转化的埃菲氏属大肠杆菌的碱性蛋白酶的表达水平是较低的。
为了解决上述问题，本发明人将重组性质粒载体pDSBCm，克隆入metschnikovii弧菌中形成了metschnikovii弧菌pDSBCm。结果，由metschnikovii弧菌pDSBCm菌株表达出的碱性蛋白酶的活性，比由宿主菌株metschnikovii弧菌KS1表达出的碱性蛋白酶的活性高了2.5倍。
本发明中应用的metschnikovii弧菌KS1菌株，收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年12月15日，编码为KFCC-10141。该菌株通过应用N，N-亚硝基胍(NTG)作为突变剂，处理metschnikovii弧菌RH530 N-4-8而产生的，并且metschnikovii弧菌RH 530 N-4-8则收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年2月23日，编码为KFCC-11030。结果，由metschnikovii弧菌KS1菌株产生的碱性蛋白酶的量，是metschnikovii弧菌RH 530 N-4-8菌株的两倍。
还有，包含有本项发明中重组性质粒载体pSBCm的埃菲氏属大肠杆菌Top10F′菌株，则收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年12月15日，编码为KCCM-10142。
在下文中，将通过以下提供的诸多例证，更加详细地描述了本项发明的特殊功效，没有限制在本项发明应用范围。实施例实施例1碱性蛋白酶基因vapk的克隆
在30℃，用表1中的成分在LSC培养基中培养Vibrio metschnikovii KS1以后，收集和碎裂生长细胞。以每分钟6,000转离心碎裂液，然后收集上清液。自上清液中纯化metschnikovii弧菌KS1的染色质DNA，并用HindIII进行部分消化，把该片段插入载体pKF3，以克隆2.9kb的碱性蛋白酶基因。结果得到的重组质粒载体命名为pSBCm。用HindIII消化重组质粒载体pSBCm，并在1％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳后，用溴化乙锭作染色剂染色琼脂糖凝胶。上述琼脂糖凝胶电泳的结果证实，碱性蛋白酶基因克隆入了一个质粒载体(图1)。表1 LSC培养基的成分 LSC培养基的成分 量(g/L) 胰蛋白胨 10 酵母抽提物 5 氯化钠 10 1M碳酸钠缓冲液， pH10.5 100(ml/L)实施例2碱性蛋白酶的分离和纯化
离心在上述实施例1的LSC培养基中培养的metschnikovii弧菌KS1菌株，获得上清，作为本项发明的酶的样本。培养转化的埃菲氏属大肠杆菌pSBCm菌株后，收集和碎裂生长细胞。以每分钟6,000转离心碎裂液，留取上清液，作为本项发明的另一酶的样本。把上述的每一个酶样本按同样的比率，加入到含有6M尿素、2.5％的十二烷基磺酸钠、5％(w/v)β-巯基乙醇、0.01M的tris-HCl、pH6.8、10％(w/v)甘油和0.002％溴酚兰的缓冲液中。在沸水中加热该混合物15分钟，然后电泳。用0.05％的考马斯亮兰R-250染色电泳完的凝胶，并且用50％的甲醇和10％的醋酸混合物脱色。SDS-PAGE的结果如图2，证实有一个29kDa的碱性蛋白酶条带。实施例3在脱脂乳琼脂中测定碱性蛋白酶VapK的活性
以每分钟6,000转离心在上述实施例1的LSC培养基中培养的metschnikovii弧菌KS1菌株10分钟，获得上清，作为本项发明的一个酶的样本。转化的埃菲氏大肠杆菌pSBCm菌株生长后，收集和碎裂生长细胞。以每分钟6，000转离心碎裂溶液，留取上清液，作为本项发明的另一酶的样本。把上述的每一个酶样本按同样的比率，加入到含有50mM浓度的磷酸缓冲液、pH7.0、10％(w/v)甘油和0.002％溴酚兰的缓冲液中，然后在凝胶中电泳。在含有脱脂乳和酸碱度为10.0、50毫摩尔浓度的碳酸钠的缓冲液的琼脂平板中，分析碱性蛋白酶的活性。结果如图3所示，证实了碱性蛋白酶的活性。实施例4碱性蛋白酶基因二聚物的克隆
制备重组质粒载体pSP1、pSPR1和pSPR1-47，作为制备包含碱性蛋白酶基因二聚体重组质粒载体的中间产物。
为了增加重组质粒载体pSBCm的稳定性，把基因par克隆入pSBCm的PvuII和HincII的识别位点之间，制备包含碱性蛋白酶基因vapk和par的重组质粒载体pSP1(图5)。
在图6中，制备含有反向vapk和par基因的重组质粒载体pSPR1作为中间产物，目的是为了减少碱性蛋白酶基因vapk在重组质粒载体pSP1中的长度。
为了减少碱性蛋白酶vapk在重组质粒载体pSPR1中的长度，制备含有反向碱性蛋白酶基因的重组质粒载体pSPR1(图6)。用EcoRI消化上述的重组质粒载体pSPR1，EcoRI识别位点在碱性蛋白酶基因vapk和par之间，然后用核酸外切酶Bal31处理，用连接酶退火后制备重组质粒载体pSPR1-47(图7)。
再把实施例1中克隆的2.9kb的碱性蛋白酶基因vapk插入到重组质粒载体pSPR1-47的HindIII识别位点，制备重组质粒pDSBCm(图8)。实施例5包含单个碱性蛋白酶基因的重组质粒载体转化埃菲氏大肠杆菌
把包含实施例1或实施例2中的2.9kb的碱性蛋白酶基因的重组质粒载体pSBCm、pSP1、pSPR1、pSPR1-47和pDSBCm转化埃菲氏大肠杆菌，产生埃菲氏大肠杆菌转化体。
埃菲氏大肠杆菌HB101菌株在LB培养基中培养后，把100mM浓度的氯化钙添加到埃菲氏大肠杆菌HB101的发酵培养基中。该混合物在0℃储存15分钟，然后离心收集埃菲氏大肠杆菌HB101。将沉淀细胞悬浮在100mM氯化钙溶液中，在0℃储存15分钟。把重组质粒载体pSBCm添加到悬浮溶液中，在0℃储存1小时。该上清液在42℃加热90秒，然后在0℃储存5分钟。在上清液中加入1ml的LB培养基，然后铺在含有34μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基中，30℃孵化24小时，挑选生长的克隆。实施例6应用包含有碱性蛋白酶基因的重组性质粒载体进行metchnikovii弧菌的转化
应用包含有碱性蛋白酶基因的重组性质粒载体，采用一种电穿孔法，进行metschnikovii弧菌KS1的转化。
在30℃下的LB培养基中孵育培养metschnikovii弧菌KS1菌株后，通过在4℃下，每分钟6,000转离心10分钟，重新获得生长的细胞，并且将它们以20∶1的体积比，悬浮于一种H-缓冲溶液中，该缓冲液包含有200mM浓度的蔗糖，1mM浓度的HEPES和10％的丙三醇。在重复上述实验步骤两次以后，细胞被悬浮在80μl的H-缓冲溶液中。将重组性质粒载体添加入悬浮液中，并且将这种溶液倒入-0.2厘米的试管中。在1,500V的电压、10μF和200Ω下，将含有细胞悬液的试管放入由Bio-Rad公司制造的基因电脉冲仪II中。添加600μl的LB培养基入电穿孔处理溶液并在30℃下孵育。培养基覆盖在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上面，挑选生长的克隆。实施例7在重组的metschnikovii弧菌的转化体中，对碱性蛋白酶表达水平的检测
对碱性蛋白酶的活性的检测，可通过一种修改了Yanagida等的方法(1986)加以进行。将2克的酪蛋白溶解于100毫升10mM浓度的碳酸盐缓冲液中，酸碱度为10.5，加热产生出2％的酪蛋白溶液。在30℃下的LB培养基中孵育培养metschnikovii弧菌KS1菌株后，通过在4℃下，每分钟6,000转离心10分钟，获得上清液，并将其稀释在酸碱度为10.5的10mM浓度的碳酸盐缓冲液中。将2.5毫升的上述2％的酪蛋白溶液与0.5毫升的上述稀释的metschnikovii弧菌溶液相混合。该混合物在37℃下反应10分钟后，将由0.22M浓度的三氯乙酸、0.22M浓度的醋酸和0.22M浓度的醋酸钠组成的溶液加入至混合物中以终止其反应。将混合物在冰浴中冷却15分钟，通过在4℃下每分钟12,000转的离心15分钟，蛋白质从混合物中沉淀出来而得到了上清液。将千分之一毫升的上述上清液与9毫升的蒸馏水混合后，在280纳米下测定混合物的光密度。专业术语“1个单位的蛋白酶”指的是在反应10分钟后，能够增加反应溶液的光密度值0.1的量。
检测结果是，由转化的菌株metschnikovii弧菌pDSBCm所表达碱性蛋白酶的活性，比由宿主菌株metschnikovii弧菌KS1表达出的碱性蛋白酶的活性高了2.5倍。本发明的重组性质粒载体的保藏
metschnikovii弧菌pDSBCm菌株包含有发明中的重组性质粒载体pDSBCm贮存收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是2000年7月4日，编码为KFCC-11180，并且根据布达佩斯条约的规则，在2001年7月9日，在同一中心，其贮存编码改变为新的入册编码KCCM-10292。产业上的适用性
根据本项发明的方法所制备的包含有碱性蛋白酶基因二聚体的重组性质粒载体转化体，其生产碱性蛋白酶的能力明显强于以前的弧菌菌株。因此，包含有本项发明中的重组性质粒载体的转化的metschnikovii弧菌菌株，能够作为一种碱性蛋白酶的生产菌株，更有效地加以应用。
国际表至：Shin，Kyung Shik
第一制糖株式会社
韩国汉城市中区 根据条约7.1条，本页下面指明的国际
南大门路5街500 保藏单位出具的原始保藏存单I.微生物确认保藏人给出的确认编号：Vibrio metschnikovii KS1(pDSBCm)国际保藏单位给出的保藏号：KCCM-10292II.科学描述和/或建议分类学的名称I确认的微生物带有：□科学描述□建议分类学的名称(用X标记为可适用)III.接收和存单国际保藏单位于2000年7月10日收到并接受I确认的微生物，且将原始保藏转移至根据布达佩斯条约接受它的请求于2000年7月09日收到。IV.国际保藏单位名称：韩国微生物培养中心地址：(略)国际保藏单位代表人签名日期：2001年7月12日