一种胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列分子免疫增强剂的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种分子免疫增强剂的制备方法，尤其涉及一种含胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)序列质粒的分子免疫增强剂的制备方法。
背景技术
我国是世界第二大肉类产品生产大国，年产量达六千万吨以上，年人均占有量超过50Kg。2002年全国生猪出栏量超过6亿头，广东省超过3200万头。由于药物残留和品质欠佳，出口量不到产量的3％。随着发达国家绿色贸易避垒的加强，我国畜禽产品市场将面临着更为剧烈的竞争，“绿色”产品成为需求的方向。为减少畜禽病害发生，同时为避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，以发展优质、无公害的农业畜禽产品，保证我国畜牧业持续健康发展并参与国际市场的竞争，分子免疫增强剂将起着极其重要的作用。
CpG称为免疫刺激序列(immunostimulatory DNA sequence，ISS)，是具有免疫刺激功能的DNA短序(CpGOND)，一种非甲基化具有回文结构的六聚体。近来大量免疫学研究证实：含CpG基序的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生地细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。从而既能诱导强的体液免疫，又可以诱导细胞免疫和CTL反应，唤醒机体先天性的免疫保护机制，国际上被称为第三代非特异性免疫增强剂。
从另一方面---佐剂而言，铝盐作为佐剂用于人类的免疫接种已有70多年的历史，并且一直是唯一的用于人类疫苗的佐剂。但铝盐佐剂有其明显的缺点，即不能诱导产生Th1反应，并干扰细胞免疫，阻断CD8+CTL的激活，使得疫苗的免疫保护不全面、不持久。弗氏完全佐剂(CFA)可引起接种抗原的Th1反应，诱导有效的细胞和体液免疫，但由于其严重的副作用未能批准用于人体，在动物免疫过程中，对动物有较大的副作用，引起应急反应。ODN具有较好的安全性，在反义治疗研究中，超过100mg/kg的剂量仍是安全的，而CpGODN免疫佐剂的用量仅为10μg～100μg。大量的实验证明，CpGODN能够诱导比铝盐佐剂更强的免疫反应，无法与铝盐佐剂混用的减毒活疫苗或多价疫苗，可以利用CpGODN来增强免疫反应。特别是低免疫原性抗原或减轻超敏反应或无反应需要特殊的佐剂时，可以利用铝盐佐剂和CpGODN的协同增强效果，表明了CpGODN作为佐剂的明显优势。因此，开展分子免疫增强剂CpG的研究，避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展，对发展绿色食品的生产和保障人民的身体健康有重要意义。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种CpG分子免疫增强剂的制备方法，以有效地提高养殖动物机体的免疫力。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明提供的一种胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列分子免疫增强剂的制备方法为，将含CpG序列的质粒导入细菌，并在细菌中表达而形成含CpG序列质粒的工程菌；将所述工程菌培养繁殖后，用碱裂解法提取质粒DNA制得CpG分子免疫增强剂。
本发明所述的工程菌培养繁殖以及碱裂解法的步骤为：
a.将所述工程菌用LB培养基培养过夜，收集菌液；
b.将收集到的菌液在5000-10000rpm下离心3-5min，用0.3-0.5ml由30-50mmol/l葡萄糖、10-25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和8-10mmol/l EDTA组成的溶液重悬；
c.在上述重悬后的菌液中加入8-10mg/ml的溶菌酶40-50μl，处理10-15min后，加入由0.1-0.2mol/l NaOH和0.8-1％SDS组成的溶液0.8-1ml充分混匀，静置5-10min；
d.然后加入由3-5mol/l乙酸钾40-60ml、冰醋酸10-11.5ml和蒸馏水20-28.5ml组成的溶液0.5-0.75ml充分混匀，于冰上放置5-10min；
e.将混合后的菌液在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液；
f.在沉淀中加入比例相同的酚和氯仿，在5000-10000rpm下离心3-5min，倒出上清液；
g.在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在5000-10000rpm下离心8-10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；
h.加入1倍体积的3-5M氯化锂，在5000-10000rpm下离心8-10min，弃上清液，沉淀用含10-20μg/ml RNA酶TE溶解，在室温下反应10-15min；
i.加入0.1倍体积的3M乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇溶液于上述反应溶液中，于-20℃温度下放置20min，在10000rpm下离心8-10min，倒弃上清液，再用70％乙醇洗涤沉淀，用200μl TE溶解沉淀，即得所需的CpG分子免疫增强剂。
本发明所述步骤a中的LB培养基的组分为：5-10g/l蛋白胨、3-5g/l氯化钠和3-5g/l酵母膏。
本发明具有以下有益效果：CpG是全谱非特异性免疫增强剂，能够提升动物的自身免疫能力。用本发明制备的CpG分子免疫增强剂能够增强灭活及减毒疫苗的免疫效果，也能有效增强基因工程疫苗的免疫效果，尤其是能够增强全谱的DNA疫苗免疫效果。避免了长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调、耐药性菌株增加及药物残留等负面影响，保证我国畜牧业持续健康发展。
【具体实施方式】
本发明的一种胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列分子免疫增强剂的制备方法，其实施例如下：
使用的CpG DNA片断的序列为：
5’ TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’
(德国HMG BiotechGmbH公司)
采用《分子克隆实验指南》中常规的基因工程技术即可将该CpG DNA片断克隆入pUC18质粒中，而获得含CpG DNA片断的重组质粒。
再用《分子克隆实验指南》中的CaCl2转化法将该质粒导入细菌中，即为含CpGDNA片断的基因工程菌。
将上述工程菌用组分为10g/l蛋白胨、5g/l氯化钠和5g/l酵母膏的LB培养基培养过夜后收集10ml菌液的菌体。用0.5ml由50mmol/l葡萄糖、25mmol/l Tris.cl(Ph8.0)和10mmol/l EDTA组成的溶液重悬。在重悬后的菌液中加入10mg/ml的溶菌酶50μl，处理15min后，加入由0.2mol/l NaOH和1％SDS组成的溶液1ml充分混匀，静置10min。然后加入由5mol/l乙酸钾60ml、冰醋酸11.5ml和蒸馏水28.5ml组成的溶液0.75ml充分混匀，于冰上放置10min；将混合后的菌液在10000rpm下离心10min，倒出上清液；在沉淀中加入比例相同的酚和氯仿，在10000rpm下离心5min，倒出上清液；在沉淀中加入2倍体积乙醇于-20℃温度下放置20min，在10000rpm下离心10min，倒出上清液，沉淀用TE溶解；加入1倍体积的5M氯化锂，在10000rpm下离心10min，弃上清液，沉淀用含20μg/ml RNA酶TE溶解，在室温下反应15min；加入0.1倍体积的3M乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇溶液于上述反应溶液中，于-20℃温度下放置20min，在10000rpm下离心10min，倒弃上清液，再用70％乙醇洗涤沉淀，用200μl TE溶解沉淀，即得CpG DNA纯度在99％以上的CpG分子免疫增强剂。
采用ELISA法及MTT法检测由本实施例制备的CpG分子免疫增强剂对动物的免疫增强效果，结果如下：
(1)以0.5μg/mlCpG溶液与鸡新城疫疫苗(联合免疫组)混合，滴鼻免疫SPF鸡，在免疫14，21天血清抗体滴度是只加鸡新城疫疫苗组(疫苗组)的2-5倍。联合免疫组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是疫苗组的1.5、2倍。
(2)以0.5μg/mlCpG溶液滴鼻免疫SPF鸡(CpG组)，CpG组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是空白对照组的2.6～3倍。
(3)以0.5μg/mlCpG溶液与猪伪狂犬疫苗(联合免疫组)混合，滴鼻免疫初生小猪，在免疫3，7天血清抗体滴度是只加猪伪狂犬疫苗组(疫苗组)的4-6倍。联合免疫组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是疫苗组的1.5～1.8倍。
(4)以0.5μg/mlCpG溶液滴鼻免疫初生小猪，免疫组淋巴细胞刺激指数(SI)和白细胞介数-2(IL-2)的水平是空白对照组的1.7～4倍。