一种温敏性智能荧光纳米探针及其制备方法.pdf

一种温敏性智能荧光纳米探针，其特征在于它以温敏性聚合物修饰的量子点作为供体、有机荧光分子作为受体组装而成，所述量子点的发射光谱与有机荧光分子的吸收光谱有重叠。本发明提供了一类对温度敏感的新型智能荧光纳米探针，将温敏性和荧光性相结合，具有温敏性和荧光性双重响应，通过宏观可视的荧光性质，达到实时监测的目的。

1.  一种温敏性智能荧光纳米探针，其特征在于它以温敏性聚合物修饰的量子点作为供体、有机荧光分子作为受体组装而成，所述量子点的发射光谱与有机荧光分子的吸收光谱有重叠。

2.  根据权利要求1所述的一种温敏性智能荧光纳米探针，其特征在于所述量子点为ZnS单核量子点、CdS单核量子点、CdSe单核量子点、CdSe/ZnS核/壳量子点、CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳量子点、Cd_xZn_1-xS量子点、CdSe/Cd_xZn_1-xS核/合金壳量子点中的任意一种。

3.  根据权利要求1所述的一种温敏性智能荧光纳米探针，其特征在于所述温敏性聚合物为温敏性双端氨基聚合物或一端带氨基一端带巯基的聚合物，其分子量在3000以下。

4.  根据权利要求1所述的一种温敏性智能荧光纳米探针，其特征在于所述有机荧光分子为含羧基的有机荧光分子。

5.  一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于其是先用温敏性聚合物对量子点进行修饰，然后将温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子进行可控组装，从而制得温敏性的新型智能化荧光纳米材料。

6.  根据权利要求5所述的一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所述温敏性聚合物对量子点进行修饰的方法，具体包括如下步骤：
1)将量子点溶于氯仿中，并加入温敏性聚合物，待完全溶解后于20～45℃下超声2～8h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8～10的缓冲溶液，继续超声12～24h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤以除去有机杂质，再经透析，即得到温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。

7.  根据权利要求6所述的一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所述步骤1)中温敏性聚合物相对于量子点过量。

8.  根据权利要求5所述的一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装的方法，具体包括如下步骤：
a)将有机荧光分子、1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在水中搅拌2～4h，然后加入温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液，搅拌1～4h；
b)加碱调节步骤a)所得溶液pH为8～10，并搅拌30min～2h；然后滴加pH为6.8～8.2的缓冲溶液并超声12～24h，再经透析、真空干燥，即得到得温敏性智能荧光纳米探针。

9.  根据权利要求8所述的一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所述步骤a)中有机荧光分子、1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比范围为1：1～1.2：1～1.2。

10.  根据权利要求8所述的一种温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所述步骤b)中的碱为四甲基氢氧化铵。

一种温敏性智能荧光纳米探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种温敏性智能荧光纳米探针及其制备方法，属于生化领域。
背景技术
随着生命科学不断深入研究，一些研究细胞环境的传统方法在应用时，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内微环境进行动态监测。荧光共振能量转移技术(FRET)技术成功解决了这一难题。该技术适用于活细胞和固定细胞的各类分子，灵敏度和分辨率高，并能清晰成像，能够直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息。蛋白质传感器作为一种蛋白质与其他分子之间作用力的手段已经越来越显示出其优点。在FRET中，选择合适的供体-受体对能够保证高效的能量转移。半导体量子点(Qdots)由于其可调谐的发射波长、狭窄且对称的发射峰、宽的激发波、抗光漂白性和可同时连接多个染料分子等优点，使其成为比有机荧光分子更好的荧光共振能量转移的供体。
使用功能高分子对Qdots和有机荧光分子进行可控组装，可实现荧光共振能量转移(FRET)，通过调控功能高分子的分子结构和聚集态结构，通过环境的刺激，在不同pH值、温度、溶剂等环境下改变Qdots和有机荧光分子的间距，FRET效率随之发生相应的变化。
Medintz I L，Clapp A R等把量子点修饰的麦芽糖结合蛋白(MBP)和染料标记的β-环糊精(β-CD)作为FRET的供体、受体对，提出了麦芽糖粘附蛋白(MBP)的麦芽糖生物传感器的设计方案。他们还利用多个麦芽糖粘附蛋白(MBP)标记光敏性的1,3,3-三甲基-螺[2,2-吲哚啉2H-1-苯并吡喃](简称BIPS)来反向调节量子点的发射光谱，调节的效率可以通过改变BIPS的数量来进行控制，以此实现光敏性开关的装置或生物传感器。Medintz I L，Trammell S A等将抗-TNT特定抗体片段通过金属吸附作用连接到亲水的荧光量子点上，完成了溶液相纳米尺度传感器的组装。Wei Q D，Lee M等以量子点作为一种新型的荧光探针，标记雌激素受体β(ER-β)的单克隆抗体，用有机荧光染料Alexa Fluor(AF)标记ER-β的多克隆抗体，而后通过量子点与有机荧光染料之间的FRET检测探针间的距离。但是目前，对于将温敏性聚合物与量子点进行可控组装制备温敏性智能化荧光纳米探针的研究还鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种温敏性智能荧光纳米探针及其制备方法，具有温敏性和荧光性双重响应，通过宏观可视的荧光性质，达到实 时监测的目的。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的量子点作为供体、有机荧光分子作为受体组装而成，所述量子点的发射光谱与有机荧光分子的吸收光谱有重叠。
按上述方案，所述量子点为ZnS单核量子点、CdS单核量子点、CdSe单核量子点、CdSe/ZnS核/壳量子点、CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳量子点、Cd_xZn_1-xS量子点、CdSe/Cd_xZn_1-xS核/合金壳量子点等中的任意一种。
按上述方案，所述温敏性聚合物为温敏性双端氨基聚合物或一端带氨基一端带巯基的聚合物，分子量在3000以下。其中，所述温敏性双端氨基聚合物可以选自双端氨基聚乙二醇(AT-PEG)、双端氨基偶氮聚合物、端氨基聚醚、聚邻苯二胺、双氨基聚氨酯(如双端氨基甲酸酯)等聚合物；所述一端带氨基一端带巯基的聚合物选自巯基苯胺聚合物、氨基-聚乙二醇-巯基等聚合物。该类温敏性聚合物具有一定生物相容性和特定官能团，其分子链的末端距随周围环境pH值、溶剂、温度的变化而变化，分子链末端的距离变化范围为1-20nm，pH值的变化幅度为4-10，温度和溶剂随分子结构的不同而不同。
按上述方案，所述有机荧光分子为含羧基的有机荧光分子，可以选自含羧基的罗丹明B、异硫氰酸荧光素和羧基荧光素(如5-FAM、6-FAM)、二氢醋酸荧光素等中一种。由于本发明中的量子点经温敏性聚合物修饰，温敏性聚合物修饰的量子点含有氨基或巯基，所以有机荧光分子选用含羧基的有机荧光分子。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法是：先用温敏性聚合物对量子点进行修饰，然后将温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子进行可控组装，从而制得温敏性的新型智能化荧光纳米材料。
按上述方案，所述温敏性聚合物对量子点进行修饰的方法，具体包括如下步骤：
1)将量子点溶于氯仿中，并加入温敏性聚合物，待完全溶解后于20～45℃下超声2～8h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8～10的缓冲溶液，继续超声12～24h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤以除去有机杂质，再经透析，即得到温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
上述方案中，所述步骤1)中温敏聚合物相对于量子点是过量的以保证修饰的充分进行，本发明中温敏性聚合物与量子点的摩尔比在80以上，其中过量的温敏聚合物会在后续的透析步骤中除去。
上述方案中，所述步骤2)中所述缓冲液为的pH范围为8～10，可以选用PBS缓冲液或者Tris-HCl缓冲液等。其中PBS缓冲液，是磷酸二氢钾与磷酸氢二钠的混合溶液；Tris-HCl缓冲液的pH范围也为8～10，是三羟甲基氨基甲烷溶液与盐酸的混合液。
上述方案中，所述步骤2)中的缓冲液的体积为步骤1)所得溶液1～2倍为宜。
上述方案中，所述步骤2)中透析的时间为24～72h。
按上述方案，温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装的方法，具体包括如下步骤：
a)将有机荧光分子、1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在水中搅拌2～4h，然后加入温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液，搅拌1～4h；
b)加碱调节步骤a)所得溶液pH为8～10，并搅拌30min～2h；然后滴加pH为6.8～8.2的缓冲溶液并超声12～24h，再经透析、真空干燥，即得到得温敏性智能荧光纳米探针。
上述方案中，所述步骤a)中有机荧光分子、1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比范围为1：1～1.2：1～1.2。其中，步骤a)中水的加入量为有机荧光分子质量的200-400倍为宜，有机荧光小分子约为量子点质量的10-30倍。
上述方案中，所述步骤b)中的碱为四甲基氢氧化铵(TMAOH)。
上述方案中，所述步骤b)中缓冲液pH范围为6.8～8.2，可以选用HEPES缓冲溶液，是4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液与NaOH溶液的混合液。
上述方案中，所述步骤b)中透析的时间为24～72h，真空干燥的时间为24～48h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一，本发明所述的温敏性智能荧光纳米探针具有温敏性和荧光性双重响应性，通过环境刺激，荧光共振能量转移效率随之发生变化，可以通过宏观荧光达到实时监测的目的；
第二，本发明所述的温敏性智能荧光纳米探针荧光共振能量转移效率高，并且随着环境变化，荧光共振能量转移效率变化大，即反应灵敏。
附图说明
图1为CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的荧光发射谱和罗丹明B的吸收谱。
图2～5分别为实施例1、2、3、4制备温敏性智能荧光纳米探针在25℃下的荧光共振能量转移图谱，荧光共振能量转移效率按E＝1-F_DA/F_D关系式计算出，其中F_DA为受体存在时供体的荧光强度，F_D为受体不存在时供体的荧光强度。
图6为实施例4制备温敏性智能荧光纳米探针在不同温度下得到荧光共振能量转移图谱。
其中，QDs表示量子点，RhB表示罗丹明B，FRET-1、FRET-2、FRET-3、FRET-4分别对应实施例1、2、3、4制备温敏性智能荧光纳米探针。
图7为实施例1～4中所用CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的透射电镜(TEM)图像。
图8为实施例5～6中所用Cd_xZn_1-xS量子点的TEM图像。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1～4中所用CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的制备：
准确称取4mmol乙酸锌(ZnAc₂)、0.2mmol的CdO、5ml油酸和15ml的1-十八烯(ODE)放入100ml的三口烧瓶中，在150℃左右反复抽真空30min后，通入氮气作为保护气体，将温度升高到300℃，以得到澄清透明溶液，即制得Zn和Cd的前驱体混合溶液；称取4mmol硫粉和0.1mol硒粉放入反应管中，反复抽真空后将0.5ml三正辛基膦(TOP)快速注入反应管，60℃下搅拌3h使Se、S完全溶解，即得Se、S前驱体；在300℃下将Se、S前驱体快速注入到Zn和Cd的前驱体混合溶液中，混合液在300℃下剧烈搅拌10min后降至室温，随后将反应得到的混合液加入体积比为3:1的丙酮和三氯甲烷离心数次，最后将得到的CdSe/Cd_xZn_1-xS纳米晶体在60℃下干燥，待用。
实施例5～6中所用Cd_xZn_1-xS量子点的制备：
准确称取10mmol的ZnAc₂、1mmol的CdO、5ml油酸和15ml的ODE放入100mL的三口烧瓶中，在150℃左右反复抽真空30min后，通入氮气作为保护气体，将温度升高到300℃，以得到澄清透明溶液，即制得Zn和Cd的前驱体混合溶液；称取10mmol硫粉放入反应管中，反复抽真空后将1mmol的TOP快速注入到反应管中，60℃下搅拌3h使S完全溶解，即得S前驱体；在300℃下将S前驱体快速注入到Zn、Cd的前驱体混合溶液中，混合液在300℃下剧烈搅拌10min后降至室温，随后将反应得到的混合液加入体积比为3:1的丙酮和三氯甲烷离心数次，最后将得到的CdSe/Cd_xZn_1-xS纳米晶体在60℃下干燥，待用。
实施例1
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点作为供体、有机荧光分子罗丹明B作为受体组装而成，所述CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点发射峰在500～ 600nm处，罗丹明B的最大吸收峰在470～600nm处，CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的发射光谱与罗丹明B的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用分子量为400的双端氨基聚乙二醇AT-PEG400。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将过量的2.5g分子量为400的双端氨基聚乙二醇AT-PEG400加入其中，并在20℃下在超声仪中超声8h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8的Tris-HCl溶液5ml，继续超声24h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析48h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1:1.2的34mg罗丹明B、14mg EDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌2h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌1h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为8，并搅拌30min；然后滴加15ml pH为6.8的HEPES缓冲溶液并超声12h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析24h，真空干燥24h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
数据测试
1、用RF-5301PC型荧光分光光度计(激发波长为380nm)观测CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的荧光发射光谱，用岛津UV-2550型紫外-可见分光光度计(UV-vis)观测罗丹明B的紫外吸收光谱，如图1所示。由图1可知：罗丹明B的最大吸收峰在555nm左右，CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的发射峰在544nm处，该量子点的发射谱与罗丹明B的吸收谱有一定程度重叠，因而制备得到的该温敏性智能荧光纳米探针满足荧光共振能量转移发生的条件。
2、将实施例中制备得到的智能荧光纳米探针配制成一定浓度的溶液进行荧光强度测试，由图2可知：实施例1中得到的荧光纳米探针，在544nm处的荧光强度相对于量子点的荧光强度减弱，在578nm处的荧光强度相对于罗丹明B的荧光强度增加，说明发生了荧光共振能量转移，计算得到的在25℃荧光共振能量转移效率为49.39％。
实施例2
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点作为供 体、有机荧光分子罗丹明B作为受体组装而成，所述CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的发射峰在500～600nm处，罗丹明B的最大吸收峰在470～600nm处，CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的吸收光谱与罗丹明B的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用聚邻苯二胺，分子量约为2000。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将过量的2.5g聚邻苯二胺加入其中，并在45℃下在超声仪中超声2h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为10的Tris-HCl溶液8ml，继续超声12h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析48h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1:1.2的34mg罗丹明B、14mgEDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌2h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌4h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为10，并搅拌2h；然后滴加15ml pH为8.2的HEPES缓冲溶液并超声24h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析72h，真空干燥48h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
由图3可知，实施例2中温敏性智能荧光纳米探针在25℃时，荧光共振能量转移效率分别为52.84％。
实施例3
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点作为供体、有机荧光分子罗丹明B作为受体组装而成，所述CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的发射峰在500～600nm处，罗丹明B的最大吸收峰在470～600nm处，CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的吸收光谱与罗丹明B的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用分子量为800的端氨基聚氧化丙烯醚。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将过量的2.5g端氨基聚氧化丙烯醚加入其中，并在 30℃下在超声仪中超声6h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8的Tris-HCl溶液10ml，继续超声18h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析72h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1.2:1.2的34mg罗丹明B、16mgEDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌2h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌2h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为9，并搅拌2h；然后滴加15ml pH为6.8的HEPES缓冲溶液并超声18h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析72h，真空干燥48h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
由图4可知实施例3中温敏性智能荧光纳米探针在25℃时，荧光共振能量转移效率分别为55.70％。
实施例4
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点作为供体、有机荧光分子罗丹明B作为受体组装而成，所述CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的发射峰在500～600nm处，罗丹明B的最大吸收峰在470～600nm处，CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点的吸收光谱与罗丹明B的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用分子量为600的端氨基聚氧化乙烯醚。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的CdSe/Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将过量的2.5g端氨基聚氧化乙烯醚加入其中，并在30℃下在超声仪中超声4h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8的PBS溶液10ml，继续超声12h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析24h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1.2.:1.2的34mg罗丹明B、16mgEDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌3h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌2h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为9，并搅拌30min； 然后滴加15ml pH为6.8的HEPES缓冲溶液并超声12h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析24h，真空干燥24h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
由图5可知实施例4中温敏性智能荧光纳米探针在25℃时，荧光共振能量转移效率分别为58.99％。
由图6可知，当温度分别为15℃、25℃、35℃时，温敏性智能荧光纳米探针的荧光共振能量转移效率分别为73.98％、58.99％和42.43％，可见：随着温度的变化，荧光共振能量转移的效率逐渐降低，说明制备得到的荧光纳米探针对环境变化具有灵敏的响应性。
实施例5
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的Cd_xZn_1-xS量子点作为供体、有机荧光分子作为二氢醋酸荧光素受体组装而成，所述Cd_xZn_1-xS量子点发射峰在450～530nm处，二氢醋酸荧光素的吸收峰在460～520nm处，Cd_xZn_1-xS量子点的发射光谱与二氢醋酸荧光素的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用分子量为400的双端氨基聚乙二醇AT-PEG400。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将2.5g分子量为400的双端氨基聚乙二醇AT-PEG400加入其中，并在20℃下在超声仪中超声8h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为8的Tris-HCl溶液5ml，继续超声24h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析48h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1:1.2的30mg二氢醋酸荧光素、14mgEDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌2h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌1h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为8，并搅拌30min；然后滴加15ml pH为6.8的HEPES缓冲溶液并超声12h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析24h，真空干燥24h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
实施例6
一种温敏性智能荧光纳米探针，其以温敏性聚合物修饰的Cd_xZn_1-xS量子点作为供体、 有机荧光分子作为二氢醋酸荧光素受体组装而成，所述Cd_xZn_1-xS量子点发射峰在450～530nm处，二氢醋酸荧光素的吸收峰在460～520nm处，Cd_xZn_1-xS量子点的发射光谱与二氢醋酸荧光素的吸收光谱重叠。其中，温敏性聚合物采用分子量为600的端氨基聚氧化乙烯醚。
上述温敏性智能荧光纳米探针的制备方法，具体包括如下两步：
第一步：温敏性聚合物对量子点进行修饰
1)取10mg的Cd_xZn_1-xS量子点溶于30ml氯仿中，配置成量子点的氯仿溶液；取5ml所配置的量子点的氯仿溶液，将过量的2.5g分子量为600的端氨基聚氧化乙烯醚加入其中，并在20℃下在超声仪中超声4h；
2)向步骤1)所得溶液中滴加pH为10的PBS溶液5ml，继续超声18h，然后静置分层，分离出上层水溶液并用氯仿洗涤3次以上以除去有机杂质，再将所得水溶液透析24h，即得到纯净的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液。
第二步：温敏性聚合物修饰后的量子点与有机荧光分子可控组装
a)将摩尔比约为1:1:1.2的30mg二氢醋酸荧光素、14mgEDC和9.5mg NHS在10ml水中搅拌2h，然后加入3ml上述所制得的温敏性聚合物修饰后的量子点水溶液继续搅拌1h；
b)将步骤a)所得溶液滴加25wt％的四甲基氢氧化铵直至pH调为8，并搅拌30min；然后滴加15ml pH为6.8的HEPES缓冲溶液并超声12h；将超声后的混合物在蒸馏水中透析24h，真空干燥24h，即得到温敏性智能荧光纳米探针。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。