一种诊断非典型性肺炎试剂盒的制备方法 技术领域
本发明涉及诊断非典型性肺炎的试剂盒领域，尤其涉及一种SARS冠状病毒S蛋白或其部分多肽和前两者的免疫血清的诊断非典型肺炎试剂盒的制备方法。
背景技术
我国称为非典型肺炎的严重急性呼吸综合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)已经在全世界100多个国家和地区发生。据世界卫生组织13日在瑞士日内瓦公布的全球最新萨斯(非典)疫情报告说，截止6月13日国际标准时间17点整，全球共有萨斯病人和部分疑似病人8454例，其中死亡792例，痊愈6793例。这3个数字分别比前一天的统计数据增加了10例、2例和125例。有疫情的国家和地区的数目仍然是32个。其中中国大陆有病人和疑似病人5327例，343人死亡；中国香港1755例，293人死亡；中国澳门1例；中国台湾693例，81人死亡；新加坡206例，31人死亡；加拿大242例，32人死亡；越南63例，5人死亡；泰国9例，马来西亚5例，菲律宾14例，这3个国家的死亡病例都为2人；南非1例，1人死亡。
由于在感染到发病之间存在着长达十天左右的潜伏期，快速大范围的筛选出已经感染而尚无临床症状地带病原体者以及疑似病例的确切诊断现得十分重要：首先在普通人群中筛选出已经感染而尚无临床症状的带病原体者，可以阻止非典型肺炎传给健康人，避免更大范围的感染；其次，对疑似病例的确切诊断可以区分真正感染者和非感染者，使感染者能够得到及时而全面的治疗，而对未感染者能够解除隔离，避免国家和个人在时间和经济上的损失。由此可见对非典型肺炎的早期和准确诊断具有十分重大的意义。但是目前市面上大量使用的非典型肺炎诊断试剂盒不能在非典型肺炎的发病早期对其进行诊断，而且准确率非常低，约为40％，往往病人已经有了明显的临床症状后，仍然不能用检测试剂盒检测出来。目前的非典型肺炎诊断试剂盒的缺陷是由其设计的原理所造成的：它是以病毒颗粒或通过基因工程表达的蛋白质作为包被物，检测人血清中的特异性抗体来判断。该原理的缺陷在于：1.直接将引起非典型肺炎的SARS冠状病毒进行包被可能会造成检测人员感染上非典型肺炎；2.人血清中的特异性抗体的产生必须是在被引起非典型肺炎的SARS冠状病毒后的一到两周后才能产生，而被感染一到两周后病人已经表现出明显的临床症状，这使得使用该种原理制成的非典型肺炎诊断试剂盒失去了意义；3.有相当多的非典型肺炎病人在被引起非典型肺炎的SARS冠状病毒并未产生对应的特异性抗体，这使得使用该种原理制成的非典型肺炎诊断试剂盒完全不能鉴别出非典型肺炎患者。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诊断非典型肺炎试剂盒的制备方法，制备简便，方法易行，早期诊断，准确诊断，该试剂盒可检测全血中引非典型肺炎传染病的SARS冠状病毒颗粒及其抗原。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：本发明涉及SARS冠状病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳动物所制得的单克隆抗体或多克隆抗体，涉及含有用于所述目的的基因疫苗中的SARS冠状病毒S蛋白的全长或部分基因片段，涉及以SARS冠状病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳动物所制得的单克隆抗体或多克隆抗体为材料制成非典型肺炎诊断试剂盒的制备方法。本发明中，构建了若干重组质粒，以便包括编码SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列。
编码SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列见序列表，本发明涉及SARS冠状病毒S蛋白的核苷酸序列包括序列表所示的完整序列(见表1)和其片段(见表2)。
本发明的实施步骤为：
1.以基因合成方法或RT-PCR从病人血清扩增的方法得到编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段；
2.将1所得到的编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段克隆到原核表达载体上；
3.将2所得到的带有编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的重组原核表达载体，通过转化的方法转入到大肠杆菌中，并进行诱导表达；
4.将3所得到的编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白通过蛋白质纯化的方法如硫酸氨法或亲和层析法得到提纯的编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白；
5.将4所得到的蛋白以单独形式或与佐剂混合的方式免疫哺乳动物，如小鼠，兔，马，牛，猪等；
6.收集5所免疫的哺乳动物的血清；
7.将6所得到的血清，参照Harlow等人描述的ELISA方法包被到以塑料为材料的96孔板上；并用牛奶或牛血清白蛋白封闭处理。
8.将5所得到的血清，参照Harlow等人描述的ELISA方法标记上同底物反应后能显色的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或者标记上荧光基团。
9.将7所得到的包被有抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体的96孔板和经过8所标记的抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体及其现色底物和反应终止液，组成非典型肺炎诊断试剂盒。
本发明所得到的非典型肺炎诊断试剂盒的各组分：
1.包被有抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体的96孔板。
2.标记有显色的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体溶液。
3.20％双氧水。
4.四氯萘酚
本发明所得到的非典型肺炎诊断试剂盒的使用方法如下：
1.取待测者全血150微升，加入到包被有抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体的96孔板中，温育30分钟；
2.弃加入的待测者全血，用200微升PBS或PBST洗涤五次，并拍干；
3.加入标记上同底物反应后能显色的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或者标记上荧光基团的抗编码SARS冠状病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗体，温育30分钟；
4.弃3所加入的液体，用200微升PBS或PBST洗涤五次，并拍干；
5.如3所加入的是标记上同底物反应后能显色的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，则加入其对应底物，现色15分钟；用硫酸终止反应；
6.测量反应后反应孔的吸光值或荧光强度。如果测量值大于2.1倍阴性对照值，则本次测量结果为阳性，待测者为非典型肺炎患者；如果测量值小于2.1倍阴性对照值，则本次测量结果为阴性，待测者为不是非典型肺炎患者。
与上述现有原理制备非典型肺炎诊断试剂盒相比，本发明使用另一策略来制备非典型肺炎诊断试剂盒，即以引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗体为包被物，检测人全血中的引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗原。一旦引起非典型肺炎的SARS冠状病毒入侵人体，就会在机体中存在着引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗原，这包含着两层含义：1.可以早期诊断，只要引起非典型肺炎的SARS冠状病毒入侵人体，使用本发明所涉及的非典型肺炎诊断试剂盒就能检测出来；2.可以准确诊断，机体中是否存在着引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗原与病人是否患有非典型肺炎存在着必然的联系：a.使用本发明所涉及的非典型肺炎诊断试剂盒检测出引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗原，则该被检测者必然患有非典型肺炎；b.使用本发明所涉及的非典型肺炎诊断试剂盒不能检测出引起非典型肺炎的SARS冠状病毒的抗原，则该被检测者必然没有患非典型肺炎。
SARS冠状病毒S蛋白是介导SARS冠状病毒识别宿主细胞以及入侵过程中的膜融合过程的关键蛋白，与SARS冠状病毒入侵人体的致病过程密切相关。SARS冠状病毒S蛋白位于病毒囊膜表面，在病毒入侵时介导病毒与宿主细胞膜表面受体的相互作用，并留在细胞表面，成为受病毒感染细胞的表面标志。因此SARS冠状病毒S蛋白存在SARS冠状病毒囊膜表面和受病毒感染细胞的表面，这成为机体是否被感染的重要的判断标准。
附图说明
图1为一种诊断非典型肺炎试剂盒的制备方法原理图。
具体实施方式
1.构建含SARS冠状病毒S蛋白S2亚基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列的真核表达载体
合成SARS冠状病毒S蛋白S2亚基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列，然后通过PCR法以引物对：
5’ggggaattcgacatggaatcacttacaacaacatcaactgc 3’
5’cccggatcctactaagcttgctcctgggatggcacatacg 3’
为引物，合成SARS冠状病毒S蛋白S2亚基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列为模板，扩增得到两端分别加上EcoRI和HindIII限制性酶切位点的在该段核苷酸序列的两端分别加上EcoRI和HindIII限制性酶切位点的SARS冠状病毒S蛋白S2亚基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列。PCR反应总体积为50μl，反应条件为：94℃预变性3分钟；PCR循环参数：94℃60秒，48℃30秒，72℃20秒，最后一次循环在72℃延伸7分钟。
然后用限制性内切酶EcoRI和HindIII将该PCR产物和真核表达载体pET28a进行双酶切，使两者两端成为粘端。其后于16℃在T4 DNA连接酶的作用下将两个片段连接起来，连接产物转化处于感受态的大肠杆菌DH5α。从转化平皿上挑取单菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基培养过夜。次日按Sambrook等人描述的小量碱法提取质粒[Sambrook J，et al，1989]。用限制性内切酶EcoRI作酶切鉴定，选出含有片段较大的重组质粒，然后用限制性内切酶EcoRI和HindIII作酶切鉴定，挑出其中能切出SARS S2的重组质粒。按照前述给片段两端加上EcoRI和HindII]位点的PCR方法进行PCR，对含有SARS S2片段的重组质粒进一步鉴定，将能够扩增出SARS S2的重组质粒定名为pET-S2。
2.接种BL21(DE3)/pET-S2于5mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基，在37℃下250rpm振荡培养过夜，次日将过夜培养物全部转种于50mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝1.0，加入10％乳糖使其终浓度为1％，在37℃下继续培养5小时后，收集菌体，按5mL/g(湿重)重悬于含1mmol/LEDTA，0.5mmol/L PMSF的PBS(pH8.0)。超声破菌后，4000rpm离心10分钟，除去菌体残渣。上清在4℃下，12000rpm离心15分钟。上清和沉淀分别上样进行12％的SDS-PAGE电泳检测。
3.将表达带6-His标记的S2蛋白的大肠杆菌离心收集菌体，置冰上15分钟。以每克菌体2-5ml裂解缓冲液的比例重悬菌体于裂解缓冲液中。加溶菌酶置终浓度1mg/ml，置于冰上30分钟。在冰上用超声波破碎菌体。4℃4000g离心10分钟以去处细胞碎片，保留上清于-20℃。
往4ml大肠杆菌裂解液中加入1ml 50％Ni-NTA浆液，4℃缓慢摇动。将上述混合液倒入底部有盖子的柱子中。去掉柱子底部的盖子让混合液流出。用4ml洗杂液洗柱两次。用0.5ml洗脱液洗脱四次。
4.将提纯后蛋白S2经SDS-PAGE分离，切下目的带后，在无菌的瓷研钵中破碎使之能够通过4.5号注射器针头。取五只昆明系小鼠，按照每只小鼠每次50微克蛋白质的用量皮下免疫小鼠。每两星期加强免疫一次，第二次加强免疫一周后采血。
最后一次免疫后采用小鼠眼眶取血法采全血。采血前小鼠应禁食6小时。血样收集在无菌的离心管中，放于37℃30～60分钟使之凝聚。用无菌的枪头将凝块与管壁分离，4℃放置过夜。次日从离心管中吸出血清，4℃下离心(1000g，10分钟)去除不溶物。
5.以戊二醛法将4所得到的抗体标记上辣根过氧化物酶。
6.参照Harlow等人描述的ELISA方法将4所得到的血清用包被缓冲液稀释至1ng/μL，往酶标板每孔加入200μL，4℃包被过夜。次日，洗涤液洗涤一次，用封闭液于37℃封闭2小时。洗涤液洗涤，共重复5次，倒置于37℃烘干。
7.将5和6所得到的产品与四氯萘酚和双氧水组成非典型肺炎诊断试剂盒
按照前述本非典型肺炎诊断试剂盒的使用双盲法检测83例血清，准确率为96.39％，其中阳性符合率为97.62％；阴性符合率为95.12％，远远高于目前市面上所用的产品。
SEQUENCE LISTING
表1 SARS冠状病毒S蛋白的完整基因序列表<110>武汉大学<120>一种诊断非典型性肺炎试剂盒的制备方法<130>一种诊断非典型性肺炎试剂盒的制备方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3768<212>DNA<213>SARS coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI：29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(3768)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttg8aga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattettt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatetaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt 1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac 1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct 2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt 2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt 2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc 2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca 2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt 2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt 2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc 2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt 2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt 2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt 2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag 2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt 2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca 2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat 2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768表2
SARS冠状病毒S蛋白全长基因片段的2752bp-3162bp的基因序列表<110>武汉大学<120>一种诊断非典型性肺炎试剂盒的制备方法<130>一种诊断非典型性肺炎试剂盒的制备方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>411<212>DNA<213>SARS coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI：29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(411)<400>1gaatcactta caacaacatc aactgcattg ggcaagctgc aagacgttgt taaccagaat 60gctcaagcat taaacacact tgttaaacaa cttagctcta attttggtgc aatttcaagt 120gtgctaaatg atatcctttc gcgacttgat aaagtcgagg cggaggtaca aattgacagg 180ttaattacag gcagacttca aagccttcaa acctatgtaa cacaacaact aatcagggct 240gctgaaatca gggcttctgc taatcttgct gctactaaaa tgtctgagtg tgttcttgga 300caatcaaaaa gagttgactt ttgtggaaag ggctaccacc ttatgtcctt cccacaagca 360gccccgcatg gtgttgtctt cctacatgtc acgtatgtgc catcccagga g 411