一种鱼类血清淀粉样P成分及其应用技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)血清淀粉样P成分及其应用。
背景技术
血清淀粉样P成分(SerumamyloidPcomponent,SAP)，属于正五聚蛋白(Pentraxins，PTX)家族，是一个典型的胞外分泌型急性反应期蛋白，分子量约为25.2kDa，含有一个PTX结构域区。在哺乳动物非特异性免疫中SAP发挥作用，其配体种类多样；SAP能结合细菌表面的脂多糖、磷酸乙醇氨和多糖，也能结合DNA、组蛋白、染色质和小核糖核酸蛋白，被认为在识别损伤细胞及其胞内组分和清除凋亡及坏死细胞的过程中发挥重要作用。另外，SAP可与C1q相互作用而激活补体经典途径，进而调节炎症反应和调理作用。因此，SAP是非特异性免疫反应中一种重要的体液模式识别分子。目前有关鱼类SAP的研究很少，其功能几乎完全未知。
发明内容
本发明目的在于提供一种鱼类(半滑舌鳎)血清淀粉样P成分及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鱼类血清淀粉样P成分重组蛋白，鱼类(半滑舌鳎)血清淀粉样P成分重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物SapF1和SapR1进行PCR扩增血清淀粉样P成分基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为半滑舌鳎血清淀粉样P成分重组蛋白，所述SapF1为5’-GATATCATGGTAACACAAGATCTCTCAGGAAA-3’；SapR1为5’-GATATCCATATCATCTGGTGCATCATC-3’。
所述半滑舌鳎血清淀粉样P成分重组蛋白在与细菌特异性结合中的应用。
所述半滑舌鳎的血清淀粉样P成分重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌，病毒为细胞肿大病毒。
本发明具有如下优点：本发明的血清淀粉样P成分能够结合多种细菌，并且能够显著提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的血清淀粉样P成分蛋白电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,血清淀粉样P成分。
图2为本发明实施例提供的血清淀粉样P成分蛋白与各种细菌的结合能力检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
血清淀粉样P成分重组蛋白的制备
1)表达血清淀粉样P成分重组蛋白的质粒pCsSap的构建：
本发明的血清淀粉样P成分氨基酸序列已公布(GenBankaccessionnumberKT025856)：
MMEKLFLFTALMISTCCAVTQDLSGKVFVFPKETNTDHVKLLTTRSTFYNVTVCLRFLTDLNRAYSLFSMSTPTVENAFLIYGEPANHVLHVYSGSGPTFHAVPFPQNTWHSLCSTWGHGSGVAQIWLNGKPYVKKFVTNQPIGGKPISILGQEQDSYGGGFDAAQSFVGMISDVHMWDQVLTPTEIKSYMNHRHVTPGNVFNWRSLQYEITGLVLVDDAPDDM
血清淀粉样P成分由224个氨基酸组成，含有一个PTX结构域，由21-218氨基酸残基组成。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物SapF1和SapR1进行PCR扩增血清淀粉样P成分基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,58℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678–86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCsSap。通过DNA测序分析证明了pCsSap为含有上述PTX结构域的血清淀粉样P成分序列的表达质粒，其中，pCsSap质粒中血清淀粉样P成分序列与GenBankaccession公开的numberKT025856序列一致。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述SapF1为5’-GATATCATGGTAACACAAGATCTCTCAGGAAA-3’；SapR1为5’-GATATCCATATCATCTGGTGCATCATC-3’。
2)血清淀粉样P成分重组蛋白的诱导表达和纯化
将上述的质粒pCsSap用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pCsSap。将BL21/pCsSap于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.4mM的IPTG，28℃继续以转速160rpm摇动培养5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。发现它的蛋白质质量与血清淀粉样P成分相同。将此纯化的蛋白命名为rCsSAP。
所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。
实施例2
血清淀粉样P成分的应用-血清淀粉样P成分与细菌的相互作用
1)细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2008年1月9日，编号为CGMCCNo.2329)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2008年1月9日,编号为CGMCCNo.2330)、大肠杆菌(Escherichiacoli)(DH5α,购于“天根生化科技(北京)有限公司”)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2012年6月21日,编号为CGMCCNo.6250)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2007年3月22日,编号为CGMCCNo.1985)以及革兰氏阳性细菌海豚链球菌(Streptococcusiniae)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；,编号为CGMCCNo.1984,保藏日2007年3月22)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(购买自CGMCC，编号为CGMCC1.460)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(购买自CGMCC，编号为CGMCC1.363)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)(购买自CGMCC，编号为CGMCC1.8591)至OD600为0.8,离心(5000g，4℃离心10min)收集菌体，重新悬于包被液(包被液为0.159％Na2CO3,0.293％NaHCO3,pH9.6)至108CFU/ml。
2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)。将96孔ELISA板用包被液处理1h，随后用PBS洗三次。将上述步骤1)的各种细菌悬液加入ELISA板(每孔100ul)。将ELISA板于4℃保温15h，每孔加入200ul3％(重量/体积比)的脱脂奶粉，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次。将上述实施例1纯化的rCsSAP在PBS中稀释至200ug/ml，即为rCsSAP稀释液。将rCsSAP稀释液或PBS(对照)加入ELISA板(每孔/100ul)，22℃保温2h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul鼠抗His抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入100ul羊抗鼠IgG－HRP抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37℃保温1h。将ELISA板用PBS洗三次，用TMB试剂盒(购于北京“天根生化科技有限公司”)显色，随后在450nm测定吸光值。rCsSAP与细菌的结合指数(Bindingindex)计算如下：ELISA反应中含有rCsSAP的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常Bindingindex大于2即被认为是特异性结合。
结果表明，rCsSAP与所检测的细菌的Bindingindex皆大于3(参见图2)，说明血清淀粉样P成分能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌发生显著结合。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例3
血清淀粉样P成分的应用-血清淀粉样P成分的抗菌作用
将上述实施例1纯化的rCsSAP在PBS中稀释至200ug/ml，即为rCsSAP稀释液。将荧光假单胞菌按照实施例2方法培养至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为107cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与rCsSAP稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.8g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul细菌+rCsSAP稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul细菌+PBS。在注射后第24h，取A和B组鱼肾脏和脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为324和733)显著(P<0.01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为1137和2538)
这些结果表明，本发明的血清淀粉样P成分具有杀菌作用，能够显著增强鱼类抵抗细菌侵染。
实施例4
血清淀粉样P成分的应用-血清淀粉样P成分的抗病毒作用
将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,HuY,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes.2012；43:55664)于PBS中稀释至106copies/ml，即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的rCsSAP在PBS中稀释至200ug/ml，即为rCsSAP稀释液。将病毒悬液与rCsSAP稀释液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约13.8g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C组的每条鱼分别注射100ul病毒+rCsSAP稀释液，将D组(对照组)的每条鱼分别注射100ul病毒+PBS。在注射后第3天，取鱼脾脏和肾脏组织。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明，C组鱼脾脏和肾脏的病毒数(分别为2.6x105和1.7x104)显著(P<0.01)低于D组鱼脾脏和肾脏的病毒数(分别为7.5x105和4.8x104)。
这些结果表明，血清淀粉样P成分能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。
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