一株解淀粉芽孢杆菌及其应用.pdf

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1、10申请公布号CN104152382A43申请公布日20141119CN104152382A21申请号201410389174122申请日20140808CGMCCNO823020130925C12N1/20200601A01N63/02200601A01P3/00200601C12P21/04200601C05F11/08200601C12R1/0720060171申请人中国农业大学地址100193北京市海淀区圆明园西路2号申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所72发明人李平兰韩玉竹尚庆茂王洋游成真张宝张志刚董春娟74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅何叶喧54发明名称。

2、一株解淀粉芽孢杆菌及其应用57摘要本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSIVFCAAS0003，保藏登记号为CGMCCNO8230。本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在抑制植物病原菌和/或固氮和/或溶磷和/或解钾中的应用。本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的发酵物。本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书15页序列表2页附图14页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利。

3、申请权利要求书1页说明书15页序列表2页附图14页10申请公布号CN104152382ACN104152382A1/1页21解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENS，其保藏编号为CGMCCNO8230。2权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的应用；所述应用为抑制植物病原菌和/或固氮和/或溶磷和/或解钾。3权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为、和中的至少一种抑制植物病原菌；固氮；溶磷；解钾。4一种产品，其活性成分为权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌；所述产品的用途为、和中的至少一种抑制植物病原菌；固氮；溶磷；解钾。5权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在制备式所示化。

4、合物中的应用；6一种发酵权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的方法，包括如下步骤将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中，使其初始浓度为3107CFU/ML，然后30、160RPM振荡培养48H。7权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的发酵物。8一种抗植物病原菌的产品，为如下A或BA将权利要求8所述发酵物离心，收集上清液；B取A得到的上清液，加入HCL水溶液直至PH为20，静置后离心，收集沉淀，用丙酮抽提并收集上清液，抽干有机溶剂。9一种生物菌肥，其制备方法包括如下步骤1将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的单菌落接种到液体NB培养基，30、160RPM振荡培养24H，得第一培养物；2将。

5、3体积份所述第一培养物与97体积份YSB液体培养基混合，30、180RPM振荡培养48H，得第二培养物；3将所述第二培养物按10体积比的接种量转接至固态发酵培养基，混匀后30静置培养5天，得到第三培养物；所述固态发酵培养基的组成如下50质量比为小麦麦麸、30质量比的花生壳粉末、10质量比的棉籽粕、05质量比的葡萄糖和95质量比的草炭；4将所述第三培养物进行风干，直至含水量为15以下，即为生物菌肥。10权利要求9所述生物菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用。权利要求书CN104152382A1/15页3一株解淀粉芽孢杆菌及其应用技术领域00。

6、01本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。背景技术0002立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANI为无孢科、丝核菌属半知菌真菌,是一种严重为害农作物的土传病原菌，可引起稻、麦、棉和多种蔬菜瓜果等的病害，一般用化学农药防治。0003尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUM是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌属半知菌类IMPERFECTIFUNGI、从梗孢目MONILIALES、瘤座孢科TUBERCULARIACEAE、镰刀菌属FUSARIUM。0004辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSICI是具。

7、有重大危险性的病原卵菌，其寄主范围较广，可引致辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物的疫病。0005利用生物防治土传病害是一种行之有效的防治措施，是植物保护中不可缺少的组成部分。特别是利用自然界原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用,来控制病原微生物的危害,具有较小的环境风险,是一种与环境友好的防治技术。随着人们对食品安全、生态安全的重视,生物防治是实现现代农业可持续发展的重要策略之一。发明内容0006本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。0007本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSIVFCAAS0003，已于2013年9。

8、月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO8230。解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSIVFCAAS0003简称解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003。0008本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在抑制植物病原菌中的应用。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124、尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACC。

9、C37438、辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300、草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576、串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127或黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。0009本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在固氮和/或溶磷和/或解钾中的应用。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷例如蛋黄中的卵磷脂转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾例如钾长石中的矿物质形式的钾转变成植物能利用的可溶性钾。说明书CN1041。

10、52382A2/15页40010本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在制备产品中的应用；所述产品的用途为、和中的至少一种抑制植物病原菌；固氮；溶磷；解钾。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124、尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438、辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300、草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576、串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127。

11、或黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷例如蛋黄中的卵磷脂转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾例如钾长石中的矿物质形式的钾转变成植物能利用的可溶性钾。0011本发明还保护一种产品，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003；所述产品的用途为、和中的至少一种抑制植物病原菌；固氮；溶磷；解钾。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124、尖孢镰刀。

12、菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438、辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300、草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576、串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127或黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷例如蛋黄中的卵磷脂转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾例如钾长石中的矿物质形式的钾转变成植物能利用的可溶性钾。0012本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在制备式所示。

13、化合物中的应用；00130014本发明还保护一种发酵解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的方法，包括如下步骤将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中，使其初始浓度为3107CFU/ML，然后30、160RPM振荡培养48H。0015本发明还保护解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的发酵物。所述发酵物具体可为如下方法制备得到的发酵物将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中，使其初始浓度为3107CFU/ML，然后30、160RPM振荡培养48H，得到发酵物即整个发酵体系。0016本发明还保护一种抑制植物病原菌的产品，为如下A或BA将所述发酵。

14、物离心离心参数具体可为4、10000RPM离心10MIN，收集上清液；B取A得到的上清液，加入HCL水溶液直至PH为20，静置静置条件具体可为4静置12小时后离心说明书CN104152382A3/15页5离心参数具体可为4、12000RPM离心10MIN，收集沉淀，用丙酮抽提并收集上清液，抽干有机溶剂。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124、尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438、辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC3730。

15、0、草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576、串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127或黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。0017本发明还保护一种生物菌肥，其制备方法包括如下步骤00181将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003单菌落接种到液体NB培养基，30、160RPM振荡培养24H，得第一培养物；00192将3体积份所述第一培养物与97体积份YSB液体培养基混合，30、180RPM振荡培养48H，得第二培养物；00203将所述第二培养物按10体积比的接种量转接至固态发酵培养基，混匀后30静置培养5天，得到第三培养物。

16、；所述固态发酵培养基的组成如下50质量比为小麦麦麸、30质量比的花生壳粉末、10质量比的棉籽粕、05质量比的葡萄糖和95质量比的草炭；00214将所述第三培养物进行风干，直至含水量为15以下含水量具体可为10，即为生物菌肥。0022本发明还保护所述生物菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或抑制植物病原菌植物侵染植物中的应用。所述植物为黄瓜或番茄。所述促进植物生长体现为促进株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重、根体积和壮苗指数中的至少一项增加。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIAC。

17、CC36124、尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438、辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300、草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576、串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127或黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。0023本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。附图说明0024图1为在LB固体培养基上30培养48H后的单菌落形态照片。0025图2为革兰氏染色后镜检的照片。0026图3为固氮能力定性测定的。

18、照片。0027图4为溶磷能力定性测定的照片。0028图5为解钾能力定性测定的照片。0029图6为菌株对蔬菜苗期病害的拮抗能力的照片。0030图7为实施例4中培养基的优化的实验结果。0031图8为实施例4中发酵条件的优化的实验结果。0032图9为实施例5的结果立枯丝核菌。0033图10为实施例5的结果尖孢镰刀菌。说明书CN104152382A4/15页60034图11为实施例5的结果辣椒疫霉。0035图12为实施例5的结果草酸青霉菌。0036图13为实施例5的结果串珠镰刀菌。0037图14为实施例5的结果黑曲霉。0038图15为实施例6中洗脱过程的图谱。0039图16为实施例6中部分洗脱峰的抑菌。

19、效果。0040图17为实施例6中MALDITOFMS分析的结果。0041图18和图19为为实施例6中ESIQTOFMS分析的结果。0042图20为实施例8的结果。0043图21为实施例9的结果。0044图22为实施例10的结果立枯丝核菌。0045图23为实施例10的结果尖孢镰刀菌。具体实施方式0046以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。取钾长石，研磨后过100目筛，收集粒径为100目以下的粉末并。

20、水洗，阴凉干燥，得到钾长石粉。0047实施例1、解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的获得和鉴定0048一、解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的获得00492012年9月，从北京市海淀区采集黄瓜根际土壤，采用平板稀释法得到若干菌株，将其中一株命名为IVFCAAS0003。0050二、菌株IVFCAAS0003的鉴定00511、菌株IVFCAAS0003的形态学鉴定0052在LB固体培养基上30培养48H后的单菌落形态照片见图1，形成灰色不透明的近圆形菌落，菌落直径35MM，半球形隆起，菌落表面不光滑有褶皱，具同心轮纹，不透明，边缘整齐，无光泽，菌落质地粘稠，挑起时呈不易拉断的丝状，有弹性。液。

21、体静置培养时，有菌膜生成。穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性。革兰氏染色后镜检的照片见图2，菌体紫色，为革兰氏阳性菌，菌体短杆状，多单生，大小为0511525UM，形成椭圆形芽孢。00532、菌株IVFCAAS0003的生理生化鉴定0054参照伯杰细菌鉴定手册第八版和常见细菌系统鉴定手册，对糖醇利用、硝酸盐还原、大分子利用、各种酶类的利用以及生长温度、耐盐性等30项生理生化指标进行测定。结果见表1。0055表1菌株IVFCAAS0003的主要生理学特性“”为阳性，“”为阴性0056项目结果项目结果项目结果项目结果说明书CN104152382A5/15页7接触酶纤维二糖。

22、VP测定需要NACL和KCL氧化酶蜜糖葡萄糖产气生长PH5营养肉汤厌氧生长半乳糖水解酪朊生长PH9营养肉汤D葡萄糖山梨糖明胶液化在2NACL上生长蔗糖山梨醇水解淀粉在5NACL上生长D甘露醇海藻糖利用柠檬酸盐在7NACL上生长麦芽糖七叶苷利用丙酸盐在10NACL上生长D核糖鼠李糖酪氨酸水解生长温度5乳糖松三糖苯丙氨酸脱氨酶生长温度10甘露糖D甘露醇卵黄卵磷脂酶生长温度30L阿拉伯糖菊糖硝酸盐还原到亚硝酸生长温度50果糖水杨素精氨酸双水解酶生长温度6000573、菌株IVFCAAS0003的分子鉴定0058菌株IVFCAAS0003的16SRRNA的编码序列如序列表的序列1所示。0059三、菌株。

23、的保藏0060基于步骤二中的形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定的结果，菌株IVFCAAS0003属于解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENS。解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSIVFCAAS0003已于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO8230。解淀粉芽孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSIVFCAAS0003简称解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003。0061实施例2、解淀粉芽孢杆菌IV。

24、FCAAS0003的促生特性0062无氮改良ACCC55培养基蔗糖10G、K2HPO43H2O05G、NACL02G、CACO31G、MGSO47H2O02G、酵母膏05G、蒸馏水1000ML、琼脂1520，PH7072。0063蒙金娜有机磷固体培养基蛋白胨100G、牛肉膏30G、NAC150G、AGAR15G、水1000ML，PH70，分装灭菌，临用时每50ML加入3ML蛋黄溶液蛋黄溶液即新鲜蛋黄与09生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂。0064孟金娜有机磷液体培养基蛋白胨100G、牛肉膏30G、NAC150G、水1000ML，PH70分装灭菌，临用时每50ML加入3M。

25、L蛋黄溶液蛋黄溶液即新鲜蛋黄与09生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂。0065解钾固体培养基蔗糖5G、MGSO47H2O05G、FECL30005G、NA2HPO42G、钾长石粉提供难利用的钾5G、CACO301G、FECL30005G、蒸馏1000ML、琼脂20G，PH7174。0066解钾液体培养基蔗糖5G、MGS047H2O05G、FECL30005G、NA2HPO42G、钾长石粉说明书CN104152382A6/15页8提供难利用的钾5G、CACO301G、FECL30005G、蒸馏1000ML，PH7174。0067无钾液体培养基蔗糖5G、MGSO47H2O05。

26、G、FECL30005G、NA2HPO42G、CACO301G、FECL30005G、蒸馏1000ML，PH7174。0068一、固氮能力即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力的测定0069圆褐固氮菌AZOTOBACTERCHROOCOCCUMCGMCC1233。00701、定性测定0071将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003划线接种在无氮改良ACCC55培养基平板上，28培养2D后拍照。照片见图3，解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003生长状态良好，表明其具有固氮能力。00722、固氮酶活性的测定乙炔还原法0073实验组在15150MM螺口试管中加入5ML无氮改良ACCC55培养基制成斜面，。

27、接种解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003，28培养72H后换橡胶塞，抽出气体25ML，注入乙炔气体25ML，然后28反应2H；然后抽出100L气体并用气相色谱仪测定乙烯含量；然后收取斜面上的菌，提取总蛋白并采用BRADFORD法检测总蛋白含量；0074阴性对照组不接种解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003，其它同实验组。0075阳性对照组用圆褐固氮菌代替解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003，其它同实验组。0076固氮酶活性NMOL/MGHC2H4NMOL/菌体蛋白量MG反应时间H，其中C2H4NMOL1000C2H4体积L273P/224273T760，P为气压MM汞柱，T为反应温度。0077每。

28、组设置6个重复处理，结果取平均值。0078解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的固氮酶活性为102421884NMOL/MGH，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118842097NMOL/MGH。0079二、溶磷能力即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力的测定00801、定性测定0081将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003点接种于蒙金娜有机磷固体培养基上，28培养5D，拍照并计算D/D值溶磷圈直径D与菌落直径D的比值。0082设置6个重复处理，结果取平均值。0083照片见图4。解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2630。

29、04CM，菌落直径为095021CM，D/D值为283059。00842、定量测定00851用无菌水将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003制备成菌浓度为109CFU/ML的菌悬液。00862将步骤1得到的菌悬液121高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。00873实验组将1ML步骤1得到的菌悬液接种至50ML孟金娜有机磷液体培养基，28、180RPM振荡培养5D，然后将整个培养体系转移至无菌的50ML离心管，加入05G无磷活性碳，然后采用KQ500DB型数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎处理时间为20MIN，释放出细胞内的有效磷，然后4、10000RPM离心15MIN，取上清液。用1ML步骤2得到说。

30、明书CN104152382A7/15页9的灭活菌液代替步骤1得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。00884取步骤3得到的上清液，采用钼酸铵比色法检测可溶性磷含量。0089PKV/V1；P有效磷增量；K从标准曲线查得显色液的磷含量MG/L；V显色时溶液定容的体积ML；V1显色时吸取上清液的体积ML。0090溶磷量实验组的P值对照组的P值。0091每组设置6个重复处理，结果取平均值。0092溶磷量为10437191MG/L。0093三、解钾能力即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力的测定00941、定性测定0095将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003划线接种于解钾固体培养基上，。

31、28培养5D，拍照。照片见图5。解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在解钾固体培养基平板上生长良好。00962、定量测定00971用无菌水将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003制备成菌浓度为109CFU/ML的菌悬液。00982将步骤1得到的菌悬液121高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。00993实验组将5ML步骤2得到的菌悬液接种至100ML解钾液体培养基，28、180RPM培养7D，然后4、10000RPM离心10MIN，取上清液。用1ML步骤2得到的灭活菌液代替步骤1得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。01004取步骤3得到的上清液，利用火焰分光光度计法测钾含量。0101解钾量实验组的。

32、钾含量对照组的钾含量。0102每组设置6个重复处理，结果取平均值。0103解钾量为114004MG/L。0104实施例3、菌株对蔬菜苗期病害的拮抗能力0105立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124。0106尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438。0107辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300。01081、将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种于LB液体培养基，28、180RPM振荡培养24H，6000RPM离心10MIN，收集菌体沉淀，用无菌水悬浮，得到108CFU/ML的菌悬液。01092、实验组取PDA培养基平板。

33、，在中央放置直径为5MM的立枯丝核菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液每个点距离立枯丝核菌菌饼边缘的垂直距离均为25CM，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液，28对峙培养72H。用无菌水代替步骤1制备的菌悬液进行上述操作，作为对照组。01103、实验组取PDA培养基平板，在中央放置直径为5MM的尖孢镰刀菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液每个点距离尖孢镰刀菌菌饼边缘的垂直距离均为25CM，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液，28对峙培养120H。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。01114、实验组取PDA培养基平板，在中央放置直径为5MM的辣椒疫霉菌饼，然后在4个点滴加步。

34、骤1得到的菌悬液每个点距离辣椒疫霉菌饼边缘的垂直距离均为25CM，每个说明书CN104152382A8/15页10点滴加2微升步骤1制备的菌悬液，28对峙培养120H。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。0112步骤2、步骤3和步骤4完成后，拍照并计算抑菌带直径6个重复处理的平均值。0113抑菌带直径抑菌圈直径解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的菌落直径。0114照片见图6。解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003可有效抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉，抑菌带直径分别为08501061CM、1566701155CM、0801154CM。0115实施例4、解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0。

35、003抗菌物质的发酵0116尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438。0117一、培养基的优化0118分别采用如下十种培养基作为待测培养基0119NB培养基牛肉膏50G、蛋白胨100G、NACL50G、蒸馏水1000ML，PH7072。0120LB培养基酵母膏50G、胰蛋白胨100G、NACL50G、蒸馏水1000ML，PH7072。0121BPY培养基牛肉膏50G、蛋白胨100G、酵母膏50G、NACL50G、葡萄糖100G、蒸馏水1000ML，PH7072。0122NYD培养基牛肉膏80G、酵母膏30G、葡萄糖10G、蒸馏水1000ML，PH7072。0123PDB培。

36、养基马铃薯2000G、葡萄糖200G、蒸馏水1000ML，PH7072。0124YSB培养基蔗糖200G、酵母膏200G、牛肉膏15G、MGSO47H2O006G、FESO47H2O0009G、蒸馏水1000ML，PH7072。0125LANDY培养基葡萄糖200G、L谷氨酸钠50G、MGSO405G、KCL05G、KH2PO410G、FESO4015MG、MNSO450MG、CUSO4016MG、蒸馏水1000ML，PH7072。0126LANDY优化培养基1简称L1培养基葡萄糖420G、L谷氨酸钠140G、MGSO405G、KCL05G、KH2PO41G、FESO4015MG、MNSO45。

37、0MG、CUSO4016MG、蒸馏水1000ML，PH7072。0127LANDY优化培养基2简称L2培养基葡萄糖100G、L谷氨酸钠50G、MGSO405G、KCL078G、KH2PO410G、FESO4005MG、MNSO450MG、CUSO4016MG、蒸馏水1000ML，PH7072。0128LANDY优化培养基简称L3培养基葡萄糖813G、L谷氨酸钠42G、NH4NO3614G、MGSO405G、KCL05G、KH2PO410G、FESO4015MG、MNSO4487MG、CACL2398G、CUSO4016MG、蒸馏水1000ML，PH7072。0129将解淀粉芽孢杆菌IVFCAA。

38、S0003接种到待测培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在待测培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，28、180RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。01301、用无菌生理盐水将尖孢镰刀菌的孢子制备成浓度为107个/ML的孢子悬液。01312、待测溶液的抑菌效果检测杯碟法01321制备双层平板培养0133底层在培养皿中加入10ML融化的PDA培养基，静置冷却凝固。0134上层在10ML55左右的PDA培养基中加入01ML步骤1制备的孢子悬液，然后倒入装有底层的培养皿，静置冷却凝固。说明书C。

39、N104152382A109/15页1101352在步骤1制备的双层平板上放置牛津杯各个牛津杯的间距为25CM,每个牛津杯内加入100L待测溶液，4静置12H，然后28培养72H，然后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每种待测溶液设置三个重复处理。0136结果见图7，采用YSB培养基进行培养，解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003的发酵上清液的抑菌效果最好，抑菌圈直径为2165MM。0137二、发酵条件的优化01381、初始菌浓度的优化0139将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为05107、1107、21。

40、07、3107、4107、5107或10107CFU/ML，30、160RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。0140按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8A。01412、发酵起始PH值的优化0142将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH50、60、70、80或90的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，30、160RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤。

41、膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。0143按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8B。01443、培养温度的优化0145将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，某一温度20、25、30、35或40、160RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。0146按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8C。01474、转速的优化0148将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种。

42、到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，30、某一转速100RPM、120RPM、140RPM、160RPM、180RPM、200RPM或220RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。0149按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8D。01505、培养时间的优化0151将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML。

43、，30、160RPM振荡培养某一时间0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56或60H，检测OD600NM值，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液，然后将上清液用022微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。0152按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8E。0153步骤1至5的结果表明，最优发酵条件如下解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在发酵体系的初始浓度为3107CFU/ML，采用PH70的YSB培养基、30、160RPM振荡培养48H。说明书CN104152382A1110/15页12在最优发酵条件下，待测溶液的抑菌圈直。

44、径为2678MM/100L。0154实施例5、解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003抗菌物质的提取0155选取三种蔬菜苗期病害立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉和三种引起粮食霉变的三株真菌草酸青霉、串珠镰刀菌、黑曲霉为指示菌。0156立枯丝核菌RHIZOCTONIASOLANIACCC36124。0157尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUMACCC37438。0158辣椒疫霉PHYTOPHTHORACAPSISIACCC37300。0159草酸青霉菌PENICILLIUMOXALICUMACCC32576。0160串珠镰刀菌FUSARIUMMONILIFORMEACCC36127。0161。

45、黑曲霉ASPERGILLUSNIGERACCC30005。01621、将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，30、160RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液。01632、硫酸铵沉淀法0164取100ML步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别达到20、30、40、50、60、70、80或90，4静置12小时；然后4、12000RPM离心20MIN，收集沉淀；向沉淀中加入10ML、PH70、20MMOL/L的。

46、磷酸缓冲液溶解以溶解沉淀，得到待测溶液。01653、盐酸沉淀有机溶剂抽提法0166取100ML步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入6MOL/LHCL水溶液直至PH为20，4静置12小时；然后4、12000RPM离心10MIN，弃上清，收集沉淀；取沉淀，用5倍体积的有机溶剂甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或正丁醇抽提后4、10000R/MIN离心10MIN，分别收集上清液上清液甲和沉淀；取沉淀，再次用5倍体积的有机溶剂甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或正丁醇抽提后4、10000R/MIN离心10MIN，收集上清液上清液乙；合并上清液甲和上清液乙，真空抽干有机溶剂，残留物用10ML、PH70、20。

47、MMOL/L的磷酸缓冲液溶解，即为待测溶液。01674、分别检测步骤2和步骤3得到的各个待测溶液的抑菌效果杯碟法01681用无菌生理盐水将指示菌的孢子制备成浓度为1107个/ML的孢子悬液。01692制备双层平板培养0170底层在培养皿中加入10ML融化的PDA培养基，静置冷却凝固。0171上层在10ML55左右的PDA培养基中加入01ML步骤1制备的孢子悬液，然后倒入装有底层的培养皿，静置冷却凝固。01723在步骤2制备的双层平板上放置牛津杯各个牛津杯的间距为25CM,每个牛津杯内加入100L待测溶液，4静置12H，然后28培养72H，然后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每种待测溶液设置三个重。

48、复处理。0173结果见图9至图14。盐酸沉淀有机溶剂抽提法提取抗菌物的效果优于硫酸铵沉淀法。盐酸沉淀有机溶剂抽提法中，采用丙酮的抽提效果最好。0174实施例6、抗菌物的制备和鉴定01751、将解淀粉芽孢杆菌IVFCAAS0003接种到PH70的YSB培养基中解淀粉芽孢杆说明书CN104152382A1211/15页13菌IVFCAAS0003在YSB培养基中的初始浓度为3107CFU/ML，30、160RPM振荡培养48H，然后4、10000RPM离心10MIN，收集上清液。01762、取100ML步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入6MOL/LHCL水溶液直至PH为20，4静置1。

49、2小时；然后4、12000RPM离心10MIN，收集沉淀；取沉淀，用5倍体积的丙酮抽提后4、10000R/MIN离心10MIN，分别收集上清液上清液甲和沉淀；取沉淀，再次用5倍体积的丙酮抽提后4、10000R/MIN离心10MIN，收集上清液上清液乙；合并上清液甲和上清液乙，真空抽干有机溶剂，残留物用10ML、PH70、20MMOL/L的磷酸缓冲液溶解，然后冷冻干燥，得到粉末状干物质。01773、高PH条件下的反向色谱分离01781称取1MG步骤2得到的粉末状干物质，用100L流动相A溶解，然后14000G离心20MIN，取上清。01792将步骤1得到的上清加入10KD超滤管MILLIPORE，CATALOGNUMBERUFC5010BK，13000G离心10MIN，收集管底部溶液。01803将步骤2得到的溶液上样于C18柱RPHPLCDURASHELLC1846MM250MM色谱柱，AGELA，CATALOGN。