用于治疗丙型肝炎的方法
领域
本发明涉及泛基因型(pan-genotypic)的HCV抑制剂和使用其来治疗HCV感染的方法。
背景
丙型肝炎病毒(“HCV”)是属于黄病毒科中肝炎病毒属的RNA病毒。包膜的HCV病毒体含有正链RNA基因组，其在单一不间断的可读框中编码所有已知的病毒特异性蛋白。可读框包含约9500个核苷酸，且编码约3000个氨基酸的单一的大的多蛋白。所述多蛋白包含核心蛋白，包膜蛋白E1和E2，膜结合蛋白p7，和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
HCV感染与进行性肝脏病理包括肝硬化和肝细胞癌相关。慢性丙型肝炎可以用聚乙二醇干扰素-α与利巴韦林组合治疗。功效和耐受性的很大限制仍然存在，因为许多使用者饱受副作用之苦，且病毒从体内的消除经常是不足的。因此，需要新药物来治疗HCV感染。
概述
令人惊讶地发现，(2S,2'S)-1,1'-((2S,2'S)-2,2'-(4,4'-((2S,5S)-1-(4-叔丁基苯基)吡咯烷-2,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基)双(氧代亚甲基)双(吡咯烷-2,1-二基))双(3-甲基-1-氧代丁烷-2,1-二基)二氨基甲酸二甲酯(下文为“化合物1”)及其药学上可接受的盐是泛基因型HCV抑制剂。这些化合物有效抑制宽范围的HCV基因型和变体，诸如HCV基因型1、2、3、4、5和6。
因此，本发明的第一方面的特征在于用于治疗HCV的方法。所述方法包括将有效量的化合物1或其药学上可接受的盐施用于HCV患者，而不管所述患者具有的具体HCV基因型。因此，患者优选在治疗前未进行基因分型，且治疗可以在不预先筛选患者的具体HCV基因型的情况下起始。
在本发明的该方面的一个实施方案中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在本发明的该方面的另一个实施方案中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在本发明的该方面的另一个实施方案中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在本发明的该方面的又另一个实施方案中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在本发明的该方面的仍又另一个实施方案中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与另一种抗HCV剂组合或共同施用。所述另一种抗HCV剂的非限制性实例包括HCV聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、其他HCV NS5A抑制剂、CD81抑制剂、亲环蛋白抑制剂或内部核糖体进入位点(IRES)抑制剂。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的又另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗优选持续少于24周，且不包括向所述患者施用干扰素。此类治疗可以，例如，包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。例如，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂。对于另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV聚合酶抑制剂。对于又另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗优选持续不超过12周(例如，治疗持续8、9、10、11或12周；优选地，治疗持续12周)，且不包括向所述患者施用干扰素。此类治疗可以，例如，包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。例如，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂。对于另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV聚合酶抑制剂。对于又另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗可以包括或可以不包括向所述患者施用利巴韦林；例如，治疗可以包括向所述患者施用利巴韦林。
在第二方面，本发明的特征在于治疗HCV的方法。所述方法包括将有效量的化合物1或其药学上可接受的盐施用于HCV患者，其中所述患者感染HCV基因型2、3、4、5或6。
在本发明的该方面的一个实施方案中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在本发明的该方面的另一个实施方案中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在本发明的该方面的另一个实施方案中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在本发明的该方面的又另一个实施方案中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在本发明的该方面的仍又另一个实施方案中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与另一种抗HCV剂组合或共同施用。所述另一种抗HCV剂的非限制性实例包括HCV聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、其他HCV NS5A抑制剂、CD81抑制剂、亲环蛋白抑制剂或内部核糖体进入位点(IRES)抑制剂。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的又另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面的另一个实施方案中，化合物1或其盐与HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂组合或共同施用。在一个实例中，患者感染基因型2，诸如基因型2a或2b。在另一个实例中，患者感染基因型3，诸如基因型3a。在另一个实例中，患者感染基因型4，诸如基因型4a。在又另一个实例中，患者感染基因型5，诸如基因型5a。在仍又另一个实例中，患者感染基因型6，诸如基因型6a。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗优选持续少于24周，且不包括向所述患者施用干扰素。此类治疗可以，例如，包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。例如，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂。对于另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV聚合酶抑制剂。对于又另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗优选持续不超过12周(例如，治疗持续8、9、10、11或12周；优选地，治疗持续12周)，且不包括向所述患者施用干扰素。此类治疗可以，例如，包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。例如，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂。对于另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV聚合酶抑制剂。对于又另一个实例，治疗可以包括向所述患者施用化合物1或其药学上可接受的盐，连同HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。
在本发明的该方面以及本文下面描述的各个和每个实施方案和实例中，治疗可以包括或可以不包括向所述患者施用利巴韦林；例如，治疗包括向所述患者施用利巴韦林。
本发明的特征还在于化合物1或其药学上可接受的盐，其用于治疗HCV患者，而不管所述患者具有的具体HCV基因型。此类用途说明于上述的本发明第一方面，包括本文下面描述的各个和每个实施方案和实例。
本发明的进一步特征在于化合物1或其药学上可接受的盐，其用于治疗感染HCV基因型2、3、4、5或6的HCV患者。此类用途说明于上述的本发明第二方面，包括本文下面描述的各个和每个实施方案和实例。
本发明的其他特征、目标和优点在以下详述中是显而易见的。然而，应当理解，所述详述，尽管表明了本发明的优选实施方案，但只是通过举例说明而非限制性的方式给出。在本发明范围内的各种变化和改变对于本领域技术人员从所述详述来看将变得显而易见。
详述
化合物1，也称为(2S,2'S)-1,1'-((2S,2'S)-2,2'-(4,4'-((2S,5S)-1-(4-叔丁基苯基)吡咯烷-2,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(氮烷二基)双(氧代亚甲基)双(吡咯烷-2,1-二基))双(3-甲基-1-氧代丁烷-2,1-二基)二氨基甲酸二甲酯，描述于美国专利申请公开号2010/0317568，其完整内容通过引用并入本文。
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化合物1。
发现化合物1具有针对许多临床相关的HCV基因型(诸如HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、和5a)的小于20 pM的EC50值，和针对HCV基因型6a的小于0.5 nM的EC50值。
本发明的特征在于化合物1或其药学上可接受的盐治疗如本文上述的HCV的用途。在本文所述的任何方法或用途中，可以将化合物1或其药学上可接受的盐配制在合适的液体或固体剂型中。优选地，将化合物1或其盐配制在固体组合物中，所述固体组合物包含无定形形式的化合物1(或其药学上可接受的盐)、药学上可接受的亲水性聚合物和任选的药学上可接受的表面活性剂。
形成化合物1(或其药学上可接受的盐)的无定形形式的一种非限制性方式是通过与聚合载体形成固体分散体。如本文所使用，术语“固体分散体”定义了包含至少两种组分的固态的系统(与液态或气态相反)，其中一种组分分散在整个其他一种或多种组分中。例如，活性成分或活性成分的组合可以分散在由药学上可接受的亲水性聚合物和药学上可接受的表面活性剂构成的基质中。术语“固体分散体”涵盖具有一相分散在另一相中的小颗粒的系统。这些颗粒的大小经常小于400 μm，诸如大小小于100、10或1 μm。当组分的固体分散体使得该系统整个是化学上和物理上一致的或同质的(uniform or homogenous)或由一个相组成(如热力学所定义)，则此类固体分散体被称为“固溶体(solid solution)”。玻璃状溶液是其中溶质溶解于玻璃状溶剂中的固溶体。
本文描述的任何方法可以采用固体组合物，其包含(1) 无定形形式的化合物1(或其药学上可接受的盐)，(2) 药学上可接受的亲水性聚合物，和(3) 药学上可接受的表面活性剂。化合物1(或其盐)和聚合物优选配制在固体分散体中。表面活性剂还可以配制在相同的固体分散体中；或者表面活性剂可以分别与固体分散体组合或混合。
亲水性聚合物可以，例如但不限于，具有至少50℃、更优选至少60℃、且高度优选至少80℃、包括但不限于80℃至180℃、或100℃至150℃的Tg。优选地，亲水性聚合物是水溶性的。合适的亲水聚合物的非限制性实例包括，但不限于，N-乙烯基内酰胺的均聚物或共聚物，诸如N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物或共聚物(例如，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或N-乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯或丙酸乙烯酯的共聚物)；纤维素酯或纤维素醚，诸如烷基纤维素(例如，甲基纤维素或乙基纤维素)，羟烷基纤维素(例如，羟丙基纤维素)，羟烷基烷基纤维素(例如，羟丙基甲基纤维素)和纤维素邻苯二甲酸酯或琥珀酸酯(例如，纤维素乙酸邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯，或羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯)；高分子聚环氧烷(polyalkylene oxides)，诸如聚环氧乙烷，聚环氧丙烷，和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯，诸如甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物，甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共??聚物，甲基丙烯酸丁酯/甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙基酯共聚物，聚(丙烯酸羟烷基酯)，和聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)；聚丙烯酰胺；乙酸乙烯酯聚合物，诸如乙酸乙烯酯和巴豆酸的共聚物，和部分水解的聚乙酸乙烯酯(也称为部分皂化的“聚乙烯醇”)；聚乙烯醇；寡糖或多糖，诸如角叉菜胶、半乳甘露聚糖和黄原胶；聚羟烷基丙烯酸酯；聚羟烷基-甲基丙烯酸酯；甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸的共聚物；聚乙二醇(PEG)；或其任何混合物。
优选的亲水性聚合物的非限制性实例包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP) K17、PVP K25、PVP K30、PVP K90、羟丙基甲基纤维素(HPMC) E3、HPMC E5、HPMC E6、HPMC E15、HPMC K3、HPMC A4、HPMC A15、HPMC醋酸琥珀酸酯(AS) LF、HPMC AS MF、HPMC AS HF、HPMC AS LG、HPMC AS MG、HPMC AS HG、HPMC邻苯二甲酸酯(P) 50、HPMC P 55、Ethocel 4、Ethocel 7、Ethocel 10、Ethocel 14、Ethocel 20、共聚维酮(乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物60/40)、聚乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸共聚物(Eudragit) L100-55、Eudragit L100、Eudragit S100、聚乙二醇(PEG) 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、和泊洛沙姆407。
在这些中，N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物或共聚物，诸如N-乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物是优选的。优选聚合物的非限制性实例是60重量％ N-乙烯基吡咯烷酮和40重量％乙酸乙烯酯的共聚物。其他优选的聚合物包括，但不限于，羟丙基甲基纤维素(HPMC，USP中也称为羟丙甲纤维素)，诸如羟丙基甲基纤维素级别E5 (HPMC-E5)；和羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMC-AS)。
采用的药学上可接受的表面活性剂可以是非离子表面活性剂。优选地，所述表面活性剂具有2-20的HLB值。本发明中采用的固体组合物还可以包括药学上可接受的表面活性剂的混合物，其中至少一种表面活性剂具有至少10的HLB值，且至少另一种表面活性剂具有低于10的HLB值。
合适的药学上可接受的表面活性剂的非限制性实例包括聚氧乙烯蓖麻油衍生物，例如聚氧乙烯三蓖麻醇酸甘油酯(polyoxyethyleneglycerol triricinoleate)或聚氧乙烯35蓖麻油(polyoxyl 35 castor oil)(Cremophor? EL; BASF Corp.)或聚氧乙烯氧基硬脂酸甘油酯(polyoxyethyleneglycerol oxystearate)，诸如聚乙二醇40氢化蓖麻油(Cremophor? RH 40，也称为聚氧乙烯(polyoxyl) 40氢化蓖麻油或聚乙二醇羟基硬脂酸甘油酯)或聚乙二醇60氢化蓖麻油(Cremophor? RH 60)；或聚氧乙烯脱水山梨糖醇的单脂肪酸酯，诸如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇的单脂肪酸酯，例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween? 80)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween? 60)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween? 40)，或聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween? 20)。合适的表面活性剂的其他非限制性实例包括聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯(3)月桂基醚，聚氧乙烯(5)鲸蜡基醚，聚氧乙烯(2)硬脂基醚，聚氧乙烯(5)硬脂基醚；聚氧乙烯烷基芳基醚，例如聚氧乙烯(2)壬基苯基醚，聚氧乙烯(3)壬基苯基醚，聚氧乙烯(4)壬基苯基醚，聚氧乙烯(3)辛基苯基醚；聚乙二醇脂肪酸酯，例如PEG-200单月桂酸酯，PEG-200二月桂酸酯，PEG-300二月桂酸酯，PEG-400二月桂酸酯，PEG-300二硬脂酸酯，PEG-300二油酸酯；亚烷基二醇脂肪酸单酯，例如丙二醇单月桂酸酯(Lauroglycol?)；蔗糖脂肪酸酯，例如蔗糖单硬脂酸酯，蔗糖二硬脂酸酯，蔗糖单月桂酸酯，蔗糖二月桂酸酯；脱水山梨糖醇脂肪酸单酯，诸如脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span? 20)，脱水山梨糖醇单油酸酯，脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Span? 40)，或脱水山梨糖醇硬脂酸酯。其他合适的表面活性剂包括，但不限于，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，也称为聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物或聚氧乙烯聚丙二醇，诸如Poloxamer? 124、Poloxamer? 188、Poloxamer? 237、Poloxamer? 388或Poloxamer? 407 (BASF Wyandotte Corp.)。如上所述，表面活性剂的混合物可以用于本发明中采用的固体组合物中。
优选的表面活性剂的非限制性实例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、Cremophor RH 40、Cremophor EL、Gelucire 44/14、Gelucire 50/13、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、丙二醇月桂酸酯、月桂基硫酸钠和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
本发明中采用的固体分散体优选是固溶体，并且更优选是玻璃状溶液。
在一个实施方案中，本发明中采用的固体组合物包含无定形固体分散体或固溶体，其包括化合物1(或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的亲水性聚合物。固体组合物还包括药学上可接受的表面活性剂，其优选配制在无定形固体分散体或固溶体中。亲水性聚合物可选自，例如，N-乙烯基内酰胺的均聚物、N-乙烯基内酰胺的共聚物、纤维素酯、纤维素醚、聚环氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、乙酸乙烯酯聚合物、寡糖和多糖。作为非限制性实例，亲水性聚合物选自N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物、N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物、N-乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物、N-乙烯基吡咯烷酮和丙酸乙烯酯的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乙基纤维素、羟烷基纤维素、羟丙基纤维素、羟烷基烷基纤维素、羟丙基甲基纤维素、纤维素邻苯二甲酸酯、纤维素琥珀酸酯、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物、甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸丁酯/2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(羟烷基丙烯酸酯)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、乙酸乙烯酯和巴豆酸的共聚物，部分水解的聚乙烯乙酸酯、角叉菜胶、半乳甘露聚糖和黄原胶。优选地，亲水性聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP) K17、PVP K25、PVP K30、PVP K90、羟丙基甲基纤维素(HPMC) E3、HPMC E5、HPMC E6、HPMC E15、HPMC K3、HPMC A4、HPMC A15、HPMC醋酸琥珀酸酯(AS) LF、HPMC AS MF、HPMC AS HF、HPMC AS LG、HPMC AS MG、HPMC AS HG、HPMC邻苯二甲酸酯(P) 50、HPMC P 55、Ethocel 4、Ethocel 7、Ethocel 10、Ethocel 14、Ethocel 20、共聚维酮(乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物60/40)、聚乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸共聚物(Eudragit) L100-55、Eudragit L100、Eudragit S100、聚乙二醇(PEG) 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407。更优选地，亲水性聚合物选自乙烯基吡咯烷酮的均聚物(例如，具有12至100的Fikentscher K值的PVP，或具有17至30的Fikentscher K值的PVP)，或30至70重量％的N-乙烯基吡咯烷酮(VP)和70至30重量％的乙酸乙烯酯(VA)的共聚物(例如，60重量％VP和40重量％VA的共聚物)。表面活性剂可以选自，例如，聚氧乙烯三蓖麻醇酸甘油酯或聚氧乙烯35蓖麻油(Cremophor? EL; BASF Corp.)或聚氧乙烯氧基硬脂酸甘油酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇的单脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯烷基芳基醚，聚乙二醇脂肪酸酯，亚烷基二醇脂肪酸单酯，蔗糖脂肪酸酯，和脱水山梨糖醇脂肪酸单酯。作为非限制性实例，表面活性剂选自聚乙二醇40氢化蓖麻油(Cremophor? RH 40，也称为聚氧乙烯40氢化蓖麻油或聚乙二醇羟基硬脂酸甘油酯)，聚乙二醇60氢化蓖麻油(Cremophor? RH 60)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇的单脂肪酸酯(例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween? 80)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween? 60)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween? 40)或聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween? 20))，聚氧乙烯(3)月桂基醚，聚氧乙烯(5)鲸蜡基醚，聚氧乙烯(2)硬脂基醚，聚氧乙烯(5)硬脂基醚，聚氧乙烯(2)壬基苯基醚，聚氧乙烯(3)壬基苯基醚，聚氧乙烯(4)壬基苯基醚，聚氧乙烯(3)辛基苯基醚，PEG-200单月桂酸酯，PEG-200二月桂酸酯，PEG-300二月桂酸酯，PEG-400二月桂酸酯，PEG-300二硬脂酸酯，PEG-300二油酸酯，丙二醇单月桂酸酯，蔗糖单硬脂酸酯，蔗糖二硬脂酸酯，蔗糖单月桂酸酯，蔗糖二月桂酸酯，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，脱水山梨糖醇单油酸酯，脱水山梨糖醇单棕榈酸酯，和脱水山梨糖醇硬脂酸酯。优选地，表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、Cremophor RH 40、Cremophor EL、Gelucire 44/14、Gelucire 50/13、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、丙二醇月桂酸酯、月桂基硫酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。更优选地，表面活性剂选自脱水山梨糖醇单月桂酸酯或D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
本发明中采用的固体分散体优选包含单相(以热力学定义)或由单相(以热力学定义)组成，其中将化合物1或化合物1和另一种抗HCV剂的组合分子分散在含有药学上可接受的亲水性聚合物的基质中。在此类情况下，使用差示扫描量热法(DSC)的固体分散体的热分析通常仅显示单一Tg，并且固体分散体不含有任何可检测的结晶化合物1，如通过X射线粉末衍射光谱法所测量。
本发明中采用的固体组合物可通过多种技术制备，所述技术诸如，但不限于，熔融挤出、喷雾干燥、共沉淀、冷冻干燥或其他溶剂蒸发技术，其中熔融挤出和喷雾干燥是优选的。熔融挤出方法通常包括制备包括活性成分、亲水性聚合物和优选表面活性剂的熔融物和然后冷却熔融物直到其凝固的步骤。“熔融”意指转变成液态或橡胶状态，其中一种组分可能嵌入（优选均匀嵌入）其他一种或多种组分。在许多情况下，聚合物组分将熔融，且包括活性成分和表面活性剂的其他组分将溶解在熔融物中，由此形成溶液。熔融通常涉及加热高于聚合物的软化点。熔融物的制备可以各种方式发生。组分的混合可以在形成熔融物之前、期间或之后发生。例如，组分可以首先混合，然后熔融，或者同时混合和熔融。熔融物也可均化，以有效地分散活性成分。此外，可以首先方便地将聚合物熔融，然后混入且均化活性成分。在一个实例中，将除了表面活性剂的所有材料掺合且供给到挤出机中，同时将表面活性剂在外部熔融且在挤出期间泵入。
为了开始熔融挤出过程，活性成分(例如，化合物1，或化合物1和至少另一种抗HCV剂的组合)可以其固体形式(诸如其各自的结晶形式)采用。活性成分也可以用作合适液体溶剂(诸如醇、脂肪族烃、酯，或在一些情况下，液态二氧化碳)中的溶液或分散体。溶剂可以在制备熔融物之后去除，例如蒸发。
各种添加剂也可以包括在熔融物中，例如，流动调节剂(例如，胶体二氧化硅)、粘合剂、润滑剂、填充剂、崩解剂、增塑剂、着色剂或稳定剂(例如，抗氧化剂、光稳定剂、自由基清除剂和针对微生物攻击的稳定剂)。
熔融和/或混合可以在常规用于该目的的装置中发生。特别合适的是挤出机或捏合机。合适的挤出机包括单螺杆挤出机、啮合螺杆挤出机或多螺杆挤出机，优选双螺杆挤出机，其可以是共旋转的或反向旋转的，并且任选配备捏合盘。应当理解的是，工作温度将由挤出机的种类或所使用的挤出机内的配置的类型确定。挤出机中熔融、混合和溶解组分所需的能量的部分可以由加热元件提供。然而，挤出机中的材料的摩擦和剪切也可以为混合物提供显著量的能量且辅助组分的均匀熔融物的形成。
熔融物的范围可以为从稀薄至糊状至粘性。挤出物的成形可以方便地通过具有两个反向旋转辊(在其表面上具有相互匹配的压片(depressions))的轧光机(calendar)实施。挤出物可以冷却且允许固化。在固化之前(热切)或之后(冷切)，挤出物也可以切成片。
固化的挤出产物可以进一步研磨、磨碎或以其他方式减小成颗粒。固化的挤出物，以及产生的各颗粒，包含基质中活性成分的固体分散体，优选固溶体，所述基质由亲水性聚合物和任选的药学上可接受的表面活性剂构成。当颗粒不含任何表面活性剂时，上述药学上可接受的表面活性剂可以添加至颗粒且与颗粒掺合。挤出产物也可以与其他活性成分和/或添加剂掺合，然后研磨或磨碎成颗粒。颗粒可以进一步加工成合适的固体口服剂型。
经由喷雾干燥的溶剂蒸发的方法提供允许在较低温度加工性的优势(如果需要)，并且允许对方法进行其他修改，以进一步改善粉末特性。喷雾干燥的粉末然后可以进一步配制(如果需要)，且最终药物产品就胶囊、片剂或任何其他固体剂型是否是期望的而言是灵活的。
示例性的喷雾干燥方法和喷雾干燥设备描述于K. Masters, Spray Drying Handbook (Halstead Press, New York, 第4版, 1985)。适合于本发明的喷雾干燥装置的非限制性实例包括由Niro Inc.或GEA Process Engineering Inc.、Buchi Labortechnik AG和Spray Drying Systems, Inc制造的喷雾干燥器。喷雾干燥方法通常涉及将液体混合物破裂成小液滴和在容器(喷雾干燥装置)中从液滴迅速去除溶剂，其中存在用于从液滴蒸发溶剂的强大驱动力。雾化技术包括，例如，双流体或压力喷嘴或旋转雾化器。用于溶剂蒸发的强驱动力可以，例如，通过在喷雾干燥装置中将溶剂的分压在干燥液滴的温度下保持在远低于溶剂的蒸气压下而提供。这可以通过以下实现：(1) 将喷雾干燥装置中的压力保持在部分真空；(2) 将液滴与温暖的干燥气体(例如，加热的氮气)混合；或(3)两者。
可以选择干燥气体的温度和流速以及喷雾干燥器设计，使得液滴到它们到达装置壁时足够干燥。这有助于确保干燥的液滴基本上是固体，并且可以形成微细粉末，并且不粘附至装置壁。喷雾干燥的产物可以通过手动、气动、机械或通过其他合适的方式去除材料来收集。达到干燥的优选水平的实际时间长度取决于液滴的大小、制剂和喷雾干燥器操作。固化之后，固体粉末可以停留在喷雾干燥室额外时间(例如，5-60秒)，以进一步从固体粉末蒸发溶剂。在固体分散体离开干燥器时其中的最终溶剂含量优选在足够低的水平，以便改善最终产物的稳定性。例如，喷雾干燥的粉末的残留溶剂含量可以是小于2重量％。高度优选地，残留溶剂含量在国际协调会议(ICH)指南(International Conference on Harmonization (ICH) Guidelines)中记载的限值内。此外，使喷雾干燥的组合物经受进一步干燥以便将残留溶剂降低至甚至更低水平可以是有用的。进一步降低溶剂水平的方法包括，但不限于，流化床干燥、红外线干燥、滚筒式干燥、真空干燥以及这些和其他方法的组合。
如上述固体挤出物，喷雾干燥的产物含有基质中活性成分的固体分散体，优选固溶体，所述基质由亲水性聚合物和任选的药学上可接受的表面活性剂构成。当喷雾干燥的产物不含任何表面活性剂时，上述药学上可接受的表面活性剂可以在进一步处理之前添加至喷雾干燥的产物且与喷雾干燥的产物掺合。
在供入喷雾干燥器之前，活性成分(例如，化合物1或化合物1和至少另一种抗HCV剂的组合)、亲水性聚合物以及其他任选活性成分或赋形剂，诸如药学上可接受的表面活性剂，可以溶解在溶剂中。合适的溶剂包括，但不限于，烷醇(例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或其混合物)、丙酮、丙酮/水、烷醇/水混合物(如，乙醇/水混合物)或其组合。溶液也可以在供入喷雾干燥器之前预热。
通过熔融挤出、喷雾干燥或其他技术生产的固体分散体可以制备成任何合适的固体口服剂型。在一个实施方案中，通过熔融挤出、喷雾干燥或其他技术制备的固体分散体可以压缩成片剂。固体分散体可以直接压缩，或者在压缩之前研磨或磨碎成颗粒或粉末。压缩可以在压片机，诸如在两个移动冲头之间的钢模中进行。当本发明的固体组合物包含化合物1和另一种抗HCV剂，可分开制备各单独活性成分的固体分散体，然后在压缩之前掺合任选研磨或磨碎的固体分散体。化合物1和其他活性成分也可以在相同的固体分散体中制备，任选地与其他添加剂研磨和/或掺合，然后压缩成片剂。
至少一种选自流动调节剂、粘合剂、润滑剂、填充剂、崩解剂或增塑剂的添加剂可用于压缩固体分散体。这些添加剂可以在压缩之前与磨碎或研磨的固体分散体混合。各种其他添加剂也可用于制备本发明的固体组合物，例如染料诸如偶氮染料，有机或无机颜料诸如氧化铝或二氧化钛，或天然来源的染料；稳定剂诸如抗氧化剂、光稳定剂、自由基清除剂、针对微生物攻击的稳定剂。
在本文所述的任何方面、实施方案和实施例中，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以与所述另一种抗HCV剂组合施用于HCV患者。优选地，此类处理不包括整个治疗方案中使用干扰素。治疗方案可以持续，例如但不限于，24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8周。优选地，治疗方案持续，例如但不限于，12周。治疗方案也可以持续少于12周，诸如11、10、9或8周。
可以与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的合适的抗HCV剂包括，但不限于HCV聚合酶抑制剂(例如，核苷聚合酶抑制剂或非核苷聚合酶抑制剂)、HCV蛋白酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂、其他HCV NS5A抑制剂、HCV进入抑制剂、亲环蛋白抑制剂、CD81抑制剂、内部核糖体进入位点抑制剂或其任何组合。例如，所述另一种抗HCV剂可以是HCV聚合酶抑制剂。对于另一种情况，所述另一种抗HCV剂可以是HCV蛋白酶抑制剂。
所述另一种抗HCV剂还可以包括两种或更多种HCV抑制剂。例如，所述另一种抗HCV剂可以是HCV聚合酶抑制剂和HCV蛋白酶抑制剂的组合。对于另一种情况，所述另一种抗HCV剂可以是两种不同的HCV蛋白酶抑制剂的组合。对于另一种情况，所述另一种抗HCV剂可以是两种不同的HCV聚合酶抑制剂(例如，一种是核苷或核苷酸聚合酶抑制剂并且另一种是非核苷聚合酶抑制剂，或两者均是核苷或核苷酸聚合酶抑制剂，或两种均是非核苷聚合酶抑制剂)的组合。在又另一个实例中，所述另一种抗HCV剂可以是另一种HCV NS5A抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合。在又另一个实例中，所述另一种抗HCV剂可以是另一种HCV NS5A抑制剂和HCV蛋白酶抑制剂的组合。在仍另一个实例中，所述另一种抗HCV剂可以是两种其他HCV NS5A抑制剂的组合。
适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的抗HCV剂的具体实例包括但不限于，PSI-7977 (Pharmasset/Gilead), PSI-7851 (Pharmasset/Gilead)、PSI-938 (Pharmasset/Gilead)、PF-00868554、ANA-598、IDX184、IDX102、IDX375、GS-9190、VCH-759、VCH-916、MK-3281、BCX-4678、MK-3281、VBY708、ANA598、GL59728、GL60667、BMS-790052、BMS-791325、BMS-650032、BMS-824393、GS-9132、ACH-1095、AP-H005、A-831 (Arrow Therapeutics)、A-689 (Arrow Therapeutics)、INX08189 (Inhibitex)、AZD2836、特拉匹韦、博赛泼维、 ITMN-191 (Intermune/Roche)、BI-201335、VBY-376、VX-500 (Vertex)、PHX-B、ACH-1625、IDX136、IDX316、VX-813 (Vertex)、SCH 900518 (Schering-Plough)、TMC-435 (Tibotec)、ITMN-191 (Intermune、Roche)、MK-7009 (Merck)、IDX-PI (Novartis)、BI-201335 (Boehringer Ingelheim)、R7128 (Roche)、MK-3281 (Merck)、MK-0608 (Merck)、PF-868554 (Pfizer)、PF-4878691 (Pfizer)、IDX-184 (Novartis)、IDX-375、PPI-461 (Presidio)、BILB-1941 (Boehringer Ingelheim)、GS-9190 (Gilead)、BMS-790052 (BMS)、CTS-1027 (Conatus)、GS-9620 (Gilead)、PF-4878691 (Pfizer)、RO5303253 (Roche)、ALS-2200 (Alios BioPharma/Vertex)、ALS-2158 (Alios BioPharma/Vertex)、GSK62336805 (GlaxoSmithKline)、或其任何组合。
适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的HCV蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括ACH-1095 (Achillion)、ACH-1625 (Achillion)、ACH-2684 (Achillion)、AVL-181 (Avila)、AVL-192 (Avila)、BI-201335 (Boehringer Ingelheim)、BMS-650032 (BMS)、博赛泼维、丹诺普韦、GS-9132 (Gilead)、GS-9256 (Gilead)、GS-9451 (Gilead)、IDX-136 (Idenix)、IDX-316 (Idenix)、IDX-320 (Idenix)、MK-5172 (Merck)、narlaprevir、PHX-1766 (Phenomix)、特拉匹韦、TMC-435 (Tibotec)、vaniprevir、VBY708 (Virobay)、VX-500 (Vertex)、VX-813 (Vertex)、VX-985 (Vertex)、或其任何组合。适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的HCV聚合酶抑制剂的非限制性实例包括ANA-598 (Anadys)、BI-207127 (Boehringer Ingelheim)、BILB-1941 (Boehringer Ingelheim)、BMS-791325 (BMS)、非利布韦、GL59728 (Glaxo)、GL60667 (Glaxo)、GS-9669 (Gilead)、IDX-375 (Idenix)、MK-3281 (Merck)、tegobuvir、TMC-647055 (Tibotec)、VCH-759 (Vertex & ViraChem)、VCH-916 (ViraChem)、VX-222 (VCH-222) (Vertex & ViraChem)、VX-759 (Vertex)、GS-6620 (Gilead)、IDX-102 (Idenix)、IDX-184 (Idenix)、INX-189 (Inhibitex)、MK-0608 (Merck)、PSI-7977 (Pharmasset/Gilead)、PSI-938 (Pharmasset/Gilead)、RG7128 (Roche)、TMC64912 (Medivir)、GSK625433 (GlaxoSmithKline)、BCX-4678 (BioCryst)、ALS-2200 (Alios BioPharma/Vertex)、ALS-2158 (Alios BioPharma/Vertex)、或其任何组合。聚合酶抑制剂可以是核苷酸聚合酶抑制剂，诸如GS-6620 (Gilead)、IDX-102 (Idenix)、IDX-184 (Idenix)、INX-189 (Inhibitex)、MK-0608 (Merck)、PSI-7977 (Pharmasset/Gilead)、PSI-938 (Pharmasset/Gilead)、RG7128 (Roche)、TMC64912 (Medivir)、ALS-2200 (Alios BioPharma/Vertex)、ALS-2158 (Alios BioPharma/Vertex)、或其任何组合。聚合酶抑制剂还可以是非核苷聚合酶抑制剂，诸如ANA-598 (Anadys)、BI-207127 (Boehringer Ingelheim)、BILB-1941 (Boehringer Ingelheim)、BMS-791325 (BMS)、filibuvir、GL59728 (Glaxo)、GL60667 (Glaxo)、GS-9669 (Gilead)、IDX-375 (Idenix)、MK-3281 (Merck)、tegobuvir、TMC-647055 (Tibotec)、VCH-759 (Vertex & ViraChem)、VCH-916 (ViraChem)、VX-222 (VCH-222) (Vertex & ViraChem)、VX-759 (Vertex)、或其任何组合。适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的NS5A抑制剂的非限制性实例包括GSK62336805 (GlaxoSmithKline)、ACH-2928 (Achillion)、ACH-3102 (Achillion)、AZD2836 (Astra-Zeneca)、AZD7295 (Astra-Zeneca)、BMS-790052 (BMS)、BMS-824393 (BMS)、EDP-239 (Enanta/Novartis)、GS-5885 (Gilead)、IDX-719 (Idenix)、MK-8742 (Merck)、PPI-1301 (Presidio)、PPI-461 (Presidio)或其任何组合。适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的亲环蛋白抑制剂的非限制性实例包括alisporovir (Novartis & Debiopharm)、NM-811 (Novartis)、SCY-635 (Scynexis)或其任何组合。适合用于在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中与化合物1(或其药学上可接受的盐)组合的HCV进入抑制剂的非限制性实例包括ITX-4520 (iTherx)、ITX-5061 (iTherx)或其组合。
在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以，例如但不限于，与所述另一种抗HCV剂同时施用。化合物1(或其药学上可接受的盐)还可以，例如但不限于，与所述另一种抗HCV剂相继施用。例如，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以在所述另一种抗HCV剂施用之前或之后立即施用。施用频率可以是相同的或不同的。例如，化合物1(或其药学上可接受的盐)和所述另一种抗HCV剂可以每天施用一次。对于另一个实例，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以每天施用一次，并且所述另一种抗HCV剂可以每天施用两次。
在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以与所述另一种抗HCV剂共同配制在单一剂型中。合适剂型的非限制性实例包括液体或固体剂型。优选地，所述剂型是固体剂型。更优选地，所述剂型是固体剂型，其中化合物1(或其药学上可接受的盐)是无定形形式，或高度优选地分子分散在包含药学上可接受的水溶性聚合物和药学上可接受的表面活性剂的基质中。所述另一种抗HCV剂也可以是无定形形式，或者分子分散在包含药学上可接受的水溶性聚合物和药学上可接受的表面活性剂的相同基质或不同基质中。所述另一种抗HCV剂也可以配制为不同形式(例如，为结晶形式)。
作为非限制性替代方案，化合物1(或其药学上可接受的盐)和所述另一种抗HCV剂可以配制为不同的剂型。例如，化合物1(或其药学上可接受的盐)和所述另一种抗HCV剂可以配制为不同的各个固体剂型。
在本文所述的任何方面、实施方案或实施例中，化合物1或其药学上可接受的盐可以以合适的量施用，诸如，例如，以约0.1 mg/kg至约200 mg/kg体重、或约0.25 mg/kg至约100 mg/kg体重、或约0.3 mg/kg至约30 mg/kg体重的剂量施用。作为另一个非限制性实例，化合物1(或其药学上可接受的盐)可以以约5 mg至约300 mg、或约25 mg至约200 mg、或约25 mg至约50 mg或其之间的量的总每日剂量施用。单一剂量组合物可以含有此类量或其约数以构成每日剂量。
然而，应当理解，对于任何具体患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括采用的具体化合物的活性，年龄，体重，总体健康，性别，膳食，施用时间，施用途径，排泄速率，药物组合，和经受治疗的疾病的严重度。也将理解的是，待施用的化合物和组合物的总每日剂量将由主治医师在可靠的医学判断的范围内决定。
下表列出本文所述的任何方面、实施方案或实施例中可以使用的化合物1(或其药学上可接受的盐)和另一种抗HCV剂的组合的非限制性实例。对于每一治疗，化合物1(或其药学上可接受的盐)和所述另一种抗HCV剂可以每天施用于HCV患者。每一治疗可以是不含干扰素的。利巴韦林的施用可以包括在每一方案中。然而，本发明考虑每一治疗方案可以不含干扰素和不含利巴韦林两者。此外，如果需要，干扰素和/或利巴韦林可以包括在每一治疗方案中。每一治疗方案还可以任选地包括向患者施用一种或多种其他抗HCV剂。每一治疗方案的持续时间可持续，例如且不限于，8-48周，这取决于患者的反应。在表1中描述的任何给定方案中，所述药物可以是，例如且不限于，共同配制为单一固体剂型。例如，方案中使用的所有药物可以共同配制为无定形形式或分子分散在包含药学上可接受的水溶性聚合物和任选的药学上可接受的表面活性剂的基质中；对于另一个实例，将化合物1配制为无定形形式或分子分散在包含药学上可接受的水溶性聚合物和任选的药学上可接受的表面活性剂的基质中，且其他药物是结晶形式且与无定形化合物1组合为单一固体剂型。对于又另一种情况，将化合物1配制为与其他药物的剂型不同的剂型。
表1. 无干扰素的治疗方案的非限制性实例
(有或无利巴韦林)
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用于评估化合物1的抑制活性的复制子细胞系可以根据以下方案进行制备。两种基因型1稳定亚基因组复制子细胞系可以用于细胞培养中的化合物表征：一种衍生自基因型la-H77，和另一种衍生自基因型lb-Conl。复制子构建体可以是双顺反亚基因组复制子。基因型la复制子构建体含有衍生自HCV (la-H77)的H77毒株的NS3-NS5B编码区。所述复制子还具有萤火虫荧光素酶报道分子和新霉素磷酸转移酶(Neo)选择标记。由FMDV 2a蛋白酶分开的这两个编码区包含双顺反复制子构建体的第一顺反子，以及含有添加适应性突变E1202G、K1691R、K2040R和S2204I的NS3-NS5B编码区的第二顺反子。lb-Conl复制子构建体与la-H77复制子是相同的，除了HCV 5’ UTR、3’ UTR和NS3-NS5B编码区衍生自lb-Conl毒株，且适应性突变是K1609E、K1846T和Y3005C。此外，lb-Conl复制子构建体含有HCV IRES和荧光素酶基因之间的脊髓灰质炎病毒IRES。复制子细胞系可以维持在含有10% (v/v) 胎牛血清(FBS)、100 IU/ml青霉素、100 mg/ml链霉素(Invitrogen)和200 mg/ml G418 (Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)中。
应当理解的是，上述实施方案和以下实施例通过举例说明而非限制性的方式给出。本发明范围内的各种变化和改变对于本领域技术人员从本说明书来看将变得显而易见。
实施例1. 化合物1针对获得自基因型 2、3、4、5 或6 HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子的抗病毒活性
为了评价化合物1抑制来自非基因型1 HCV的NS5A的能力，生成多种含有来自基因型2a、2b、3a、4a、5a或6a HCV的NS5A的部分的稳定亚基因组1b-Con1复制子细胞系。该复制子构建体含有NS5A的上游的NotI限制性位点，和刚刚在NS5A氨基酸214之后的BlpI限制性位点。根据Middleton等人, J Virol Methods 145:137-145 (2007)和Tripathi等人, Antiviral Res 73:40-49 (2007)分离来自感染受试者的病毒RNA。在RNA上进行RT-PCR，以生成编码NS5A氨基酸1-214的DNA片段。PCR片段引入NotI和BlpI相容末端，并且将该片段连接至含有1b-Con1复制子的质粒中。稳定细胞系通过将这些构建体引入Huh-7细胞而生成。
化合物1对HCV复制的抑制效果通过测量荧光素酶报道基因的活性来测定。简而言之，将含有复制子的细胞以5000个细胞/孔的密度接种至96孔板中的100μl含有5％FBS的DMEM中。次日，将化合物稀释在二甲亚砜(DMSO)中，以生成一系列八个半对数稀释度的200x储液。然后将稀释系列进一步100倍稀释在含有5％FBS的培养基中。将具有抑制剂的培养基添加至已经含有100μ1 含有5％FBS的DMEM的细胞培养板过夜。在人血浆存在的情况下测量抑制活性的测定中，来自过夜细胞培养板的培养基用含有40%人血浆和5% FBS的DMEM替代。将细胞在组织培养箱中孵育三天，此时之后，将30μ1被动裂解缓冲液(Promega)添加至每个孔，然后将板在摇动的情况下孵育15分钟，以裂解细胞。将荧光素溶液(5μ1，Promega)添加至每个孔，且荧光素酶活性用Victor II光度计(Perkin-Elmer)测量。计算每个化合物浓度的HCV RNA复制的抑制百分比，且EC50值使用拟合至4-参数逻辑方程的非线性回归曲线和GraphPad Prism 4软件(Halfman, Methods Enzymol 74 Pt C:481-497 (1981))来计算。
化合物1的抗病毒效果在稳定复制子细胞中通过测量萤火虫荧光素酶的降低来测定。为了估计血浆蛋白对抗病毒活性的作用，该化合物在5％ FBS存在的情况下进行测试。表2中的结果表明，化合物1针对基因型1a和1b复制子具有优异的效力，在5% FBS存在的情况下，平均EC50值范围为5 pM至14 pM。在5％FBS存在的情况下的化合物1的抗病毒活性。化合物1还具有针对来自基因型2、3、4和5的含有NS5A的复制子的优异的效力。还提供了其针对基因型6a的活性。
表2. HCV复制子细胞培养测定中化合物1的抗病毒活性
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a. 0％人血浆测定含有5％胎牛血清
b. 独立重复的数目。
实施例2. 化合物1针对患者分离株的实验对象组的活性
HCV穿梭载体盒用于评价衍生自被基因型1a和1b HCV感染的个体的NS5A基因的表型。该载体含有来自具有适应性突变K1609E、K1846T和Y3005C的1b毒株Con1的5’ UTR、3’ UTR和非结构基因NS3-NS5B。将NotI和ClaI限制性位点引入NS5A基因的侧翼，而不改变任何氨基酸或插入额外的氨基酸。将脊髓灰质炎病毒IRES插入HCV 5’ UTR和萤火虫荧光素酶报道基因之间，如Lohmann 等人.J Virol 77:3007-3019 (2003)所述。为了评价化合物1抑制来自非基因型1 HCV的NS5A的能力，生成多种含有来自基因型2a、2b、3a、4a、5a或6a HCV的NS5A的部分的稳定亚基因组1b-Con1复制子细胞系。该复制子构建体含有NS5A的上游的NotI限制性位点，和刚刚在NS5A氨基酸214之后的BlpI限制性位点。根据Middleton等人, J Virol Methods 145:137-145 (2007)和Tripathi等人, Antiviral Res 73:40-49 (2007)分离来自感染受试者的病毒RNA。在RNA上进行RT-PCR，以生成编码NS5A氨基酸1-214的DNA片段。PCR片段引入NotI和BlpI相容末端，并且将该片段连接至含有1b-Con1复制子的质粒中。
HCV RNA分离自HCV感染的受试者的血清，并且通过穿梭载体系统处理，如Middleton等人, J Virol Methods 145:137-145 (2007)中所述。简而言之，根据供应商的说明使用QiaAmp病毒RNA分离试剂盒(QIAgen)从140至280 μl的来自HCV感染的受试者的血清分离病毒RNA。在RNA上进行RT-PCR方案以生成具有NotI和ClaI/BlpI相容末端的编码NS5A基因的DNA片段。将该片段连接至含有穿梭载体的质粒中，然后将连接的质粒转染至感受态大肠杆菌细胞中。在液体培养中过夜生长后，分离来自整个人群的质粒DNA，纯化，然后通过用ScaI消化线性化。TranscriptAid T7高产转录试剂盒(Fermentas)用于转录HCV亚基因组RNA。
将来自临床样品的含有NS5A基因的HCV亚基因组RNA经由电穿孔转染至所述Huh 7衍生的细胞系中，除了用15 μg模板RNA电穿孔3×106个细胞，且以7.5×103个细胞/孔接种96孔板(Middleton等人, J Virol Methods 145:137-145 (2007)。转染后四小时，收集一个板的孔用于荧光素酶测量。该板提供可转移的输入RNA的量和因此转染效率的量度。向剩余板的孔中添加DMSO (0.5% DMSO最终浓度)中的测试化合物的3倍稀释系列，且将板在潮湿培养箱中在 37℃、5% CO2下孵育4天。该期间之后，除去培养基，并且将板用100 μl磷酸盐缓冲盐水/孔洗涤。对于荧光素酶测定，将30μ1被动裂解缓冲液(Promega)添加至每个孔，然后将板在摇动的情况下孵育15分钟，以裂解细胞。将荧光素溶液(50μ1，Promega)添加至每个孔，且荧光素酶活性用Victor II光度计(Perkin-Elmer)测量。化合物1的EC50值使用将抑制数据拟合至4-参数逻辑方程的非线性回归曲线和GraphPad Prism 4软件(Halfman, Methods Enzymol 74 Pt C:481-497 (1981))来计算。
鉴于HCV的遗传多样性和NS5A的N末端区域内的多态性程度，评估未先前暴露的基因型1、2、3和4临床分离株的实验对象组以研究小分子抗病毒剂。分别地，对于11基因型1a和11 1b临床分离株，计算0.66 pM和1.0 pM的平均EC50值(表3)。在Genbank中可得的2a序列中，只有11％的样品含有NS5A的位置31的亮氨酸，并且这包括2a-JFH1毒株。该实验对象组中测试的7个样品含有位置31的甲硫氨酸，并且化合物1保留其针对该实验对象组的活性，其中平均EC50为3.8 pM(表4)。在基因型2b中，在NS5A的位置31存在50％变异性，其中氨基酸变体是亮氨酸或甲硫氨酸。在实验对象组中包括的14个基因型2b样品中，6个样品含有M31，且1个样品含有L28F变体。化合物1保留其针对13/14样品的活性，其中EC50为1.1 pM，针对含有L28F变体的样品的活性中存在75倍损失(表5)。评估十三个基因型3a样品，并且针对样品中的12个的平均EC50为4.5 pM。针对基因型3a样品之一的EC50为55 pM，其最可能是由于A30K变体的存在(表6)。评估九个基因型4a样品，所述样品中的两个具有位置28的Met；然而，这没有影响化合物1的活性，并且获得0.23 pM的平均EC50(表7)。在Genebank中可得的基因型6a样品中，在位置28存在50％变异性，其中氨基酸变体是亮氨酸或苯丙氨酸。只有一个基因型6a样品具有L28变体。为了更好地代表基因型6a分离株，将L28F突变引入群体。化合物1针对基因型6a的L28相比于F28变体的EC50为42 pM和68 pM(表8)。
总之，化合物1保留了其针对基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a 和6a样品的实验对象组的活性，尽管在NS5A氨基酸位置28、30、31、58 和93存在多态性。
表3. 化合物1在来自基因型1a和1b HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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表4. 化合物1在来自基因型2a HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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表5. 化合物1在来自基因型2b HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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表 6. 化合物1在来自基因型3a HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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表 7. 化合物1在来自基因型4a HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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表 8. 化合物1在来自基因型6a HCV感染的人的含有NS5A基因的HCV复制子中的抗病毒活性
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本发明的前述描述提供了举例说明和描述，但并不意在穷举或将本发明限制到所公开的精确方案。改变和变化鉴于上述教导是可能的，或者可以从本发明的实施中获得。因此，应当指出，本发明的范围由权利要求及其等同方案所限定。