基于核酸的化合物及其使用方法 本申请要求2001年5月16日提交的美国临时申请60/291,471的利益。
1.发明领域
本发明涉及基于核酸的化合物。本发明的化合物用于各种治疗应用，包括治疗乙型肝炎病毒。
2.背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝DNA病毒科的致密有包膜的DNA病毒。该病毒是全世界慢性肝病和肝细胞癌的主要原因(Hoofnagle(1990)《新英格兰药物杂志》(N.Eng.J.Med.)，323：337-339)。HBV与急性和慢性肝炎和肝细胞癌有关且可能是获得性免疫缺陷综合征发生中的辅因子(Dinestag等在《Harrison内科理论》(Harrison’sPrinciples of Internal Medicine)第13版中所述(Isselbacher等编辑)McGrw-Hill，NY，NY(1993)pp.1458-1483)。目前至少有4亿人感染HBV。
然而，目前临床使用的活性剂不能提供有效的疗法或治愈HBV感染。已经将使用干扰素的抗病毒疗法用于慢性肝炎，但仅获得了部分成功且由这类疗法可以产生并发症。使用糖皮质激素的短期疗法与干扰素疗法结合可能有利，但长期治疗受到毒理学问题的限制(Dinestag等，文献同上)。
由此需要拥有治疗病毒感染的新活性剂。特别需要拥有治疗乙型肝炎病毒感染的新活性剂。
发明概述
目前我们已经发现了特别用于治疗病毒感染的化合物和组合物。本发明优选的化合物可以表现出对乙型肝炎病毒的显著活性。
本发明的化合物是基于核酸的小分子，它们含有至少两个核苷单位且一般含有不超过约2个、3个、4个、5个或6个核苷酸单位、优选不超过约2个、3个或4个核苷酸单位、更优选总计为2个或3个核苷单位。本发明的化合物包括至少一个含有一种或多种对来自″天然″核酸的修饰地核苷酸单位。本发明优选的化合物包括那些带有硫代磷酸酯(phosphorothioate)和/或氨基磷酸酯(phosphoramidate)核苷酸间连键的化合物。
本发明尤其优选的化合物包括下列化合物1、2和3及这类化合物的药物上可接受的盐：
本发明还包括治疗方法，该方法包括使用一种或多种本发明化合物的步骤。本发明的方法包括治疗HBV感染，包括治疗和预防(预防疗法)与HBV-相关的疾患或疾病。
本发明的优选方法包括对病毒感染细胞、特别是人体细胞、尤其是感染了HBV的细胞给予治疗有效量的本发明化合物。本发明的方法还包括对哺乳动物、特别是诸如人这样的灵长类给予有效量的一种或多种本发明化合物。
本发明进一步提供了包括一种或多种本发明化合物和药物上可接受载体的药物组合物。
下文公开了本发明的其它方面。
发明详述
如上所述，我们已经发现了可以表现出显著抗-HBV活性的新合成的寡核苷酸(至少两个核苷酸单位)。
本发明的化合物包括来自天然″核酸″、即天然核苷酸间连键、G、C、T和U碱基等的一种或多种修饰。修饰例如包括对核苷酸间连键、碱基或糖部分等的修饰。
本发明的化合物适宜含有两个或多个通过核苷酸间连键连接的脱氧核苷酸和/或核苷酸单体。本发明的化合物可以完全由脱氧核苷酸、完全由核苷酸或由脱氧核苷酸和核苷酸的组合构成，包括杂合化合物和反向的杂合化合物。杂合化合物含有核苷酸(例如1、2或3个单位)侧翼区之间插入的脱氧核苷酸核心区(例如1、2或3个单位)。反向的杂化物含有脱氧核苷酸(例如1、2或3个单位)侧翼区之间插入的核苷酸核心区(例如1、2或3个单位)。
可以通过一个单核苷酸戊糖环的5’与相邻单核苷酸的3’之间标准的磷酸二酯核苷酸间连键连接本发明的核苷酸单位。还可以使用不同位点上的连接、包括5’与5’、3’与3’、2’与5’和2’与2’或其任意组合来建立这类键。除磷酸二酯键外，还可以通过烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷酰酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯或羧甲基酯的键或其任意组合连接所述的单核苷酸。如上所述，本发明优选的化合物包括至少一个硫代磷酸酯和/或氨基磷酸酯键。
可以将本发明的化合物构建成所有单核苷酸单位(例如总计2、3、4、5或6个单位)均通过相同类型的核苷酸间连键或通过不同核苷酸间连键的组合连接，包括嵌合或反向嵌合的寡核苷酸。本发明的嵌合化合物含有甲基磷酸酯或氨基磷酸酯侧翼区之间插入的硫代磷酸酯核心区。本发明的反向嵌合化合物含有硫代磷酸酯侧翼区之间插入的非离子核心区(例如烷基磷酸酯和/或氨基磷酸酯和/或磷酸三酯核苷酸间连键)。
本发明的化合物还可以由腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶单核苷酸构成。本发明的优选化合物可以由含有对所述单核苷酸碱基和/或糖部分修饰的单核苷酸单位构成。对碱基或糖的修饰包括含有1-3个独立或稠合环和1-3个N、O或S原子的烷基、碳环芳基、杂芳基或杂脂环基的共价结合的取代基或杂环结构。
烷基优选含有1-约18个碳原子、更优选1-约12个碳原子且最优选1-约6个碳原子。烷基的具体实例包括：例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。芳烷基包括上述被含有6个或6个以上碳的碳环芳基、例如苯基、萘基、菲基、蒽基等取代的烷基。
环烷基优选含有3-约8个环碳原子，例如环丙基、环戊基、环己基、环庚基、1，4-亚甲基环己烷、金刚烷基、环戊基甲基、环己基甲基、1-或2-环己基乙基和1-、2-和3-环己基丙基等。
举例性的杂芳基和杂脂环基包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉代和吡咯烷基。
对糖基的优选修饰包括对核糖部分2’位的修饰，包括、但不限于2’-O-被含有1-6个饱和或不饱和碳原子的-O-低级烷基取代，被-O-芳基取代，或被含有2-6的碳原子的烯丙基取代，其中这类-O-烷基、芳基或烯丙基可以未被取代或可以被取代(例如被卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、甲氧基(carbalkoxyl)或氨基取代)；或其中2’-O-基被氨基或卤素取代。这些取代中就核糖而言含有天然2’-羟基或就脱氧核糖而言含有2’-H-。
含有修饰核苷酸单位的本发明优选化合物包括2’-O-甲基核苷酸(2’-OMe)和5-甲基化的脱氧胞嘧啶(5-Me-dC)。本发明特别优选的化合物在寡核苷酸3’末端上含有至少1个、优选1-5个2’-O-甲基核苷酸。此外，本发明的化合物可以进一步在5’-末端上含有至少1个、优选1-5个2’-O-甲基核苷酸。
本发明化合物的单核苷酸单位的糖基可以是天然的或修饰的(例如合成的)且为开链或环形式。糖基可以由单糖、二糖、寡糖或多糖组成，其中各单糖单位含有3-约8个碳、优选3-约6个碳、含有多羟基或多羟基和氨基。非限制性实例包括甘油、核糖、果糖、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、纤维素二糖、蔗糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原和纤维素。羟基和氨基作为含有例如氢和/或卤素的游离或保护基存在。优选的保护基包括丙酮化合物、叔丁氧基羰基等。单糖糖基可以具有L或D构型且环单糖单位可以含有α或β构象中的5或6元环。二糖可以由两个相同或两个不相似的单糖单位组成。寡糖可以由2-10个单糖组成且可以是均聚物、杂聚物或环多糖。多糖可以是均聚糖(homoglycan)或杂聚糖且可以是支链或非支链的聚合链。
二糖、寡糖和多糖可以由14、16或14与16键的混合物组成。糖部分可以通过碳水化合物上的任意羟基或氨基与所述连接基团连接。
其它修饰包括本发明化合物内部或末端基上的那些修饰且包括核苷酸间磷酸键上分子的加成、诸如在两个氨基之间含有不同数量碳残基的胆甾烯基、胆固醇或二胺化合物以及裂解或交联相反链或裂解或交联结合病毒基因组的相关酶或其它蛋白质或的末端核糖、脱氧核糖和磷酸酯修饰。包括非核苷接头的其它接头包括、但不限于不同长度的聚乙二醇，例如三甘醇、一乙二醇、六甘醇(Ma等(1993)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)21：2585-2589；Benseler等(1993)《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)115：8483-8484)、己胺和芪(Letsinger等(1995)《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)117：7323-7328)或任意其它商购接头，包括脱碱基接头或商购不对称和对称接头(CloneTech，Palo Alto，California)(例如Glen Research Product Catalog，Sterling，VA)。
还可以使在寡核苷酸3’末端上以核糖加帽(capped with)的本发明化合物进行NaIO4氧化/还原氨基化。氨基化可以包括、但不限于下列部分：精胺、亚精胺、三(2-氨基乙基)胺(TAEA)、DOPE、长链烷基胺类、冠醚类、辅酶A、NAD、糖类、肽类、树枝状聚合物。
本发明的化合物还可以在其3’末端和/或5’末端上被大取代基加帽或每个核苷酸在一个或两个非桥联的氧上含有取代。这类修饰可以位于某些或全部核苷酸间连键上且可以位于寡核苷酸一端或两端和/或所述分子内部(综述在Agrawal等(1992)的《生物技术趋势》(TrendsBiotechnol.)10：152-158中)。某些加帽类基团的非限制性实例包括3’-O-甲基、5’-O-甲基、2’-O-甲基及其任意组合。
本发明特别优选的化合物包括下列1-62的化合物：
可以通过本领域中认可的方法制备本发明的化合物。例如，可以使用本领域中认可的技术、诸如可以通过手工操作或通过自动合成仪进行的氨基亚磷酸酯(phosphoramidite)、H-磷酸酯或甲基氨基亚磷酸酯化学法(例如，参见Goodchild(1990)《生物轭合物化学》(Bioconjugate Chem.)2：165-187；Uhlmann等(1990)《化学综述》(Chem.Rev.)90：543-584；Caruthers等(1987)《酶学方法》(Meth.Enzymol.)154：287-313；美国专利US 5,149,798)共价结合核苷酸单位且然后处理(综述在Agrawal等的(1992)《生物技术趋势》(Trends Biotechnol.)10：152-158中)。可以使用本领域中众所周知的方法、诸如亚磷酰胺(例如，参见Agrawal等(1988)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))85：7079-7083)或H-磷酸酯(例如，参见Froehler(1986)《四面体通讯》(TetrahedronLett.)27：5575-5578)化学法制备含有硫代磷酸酯键的本发明化合物。还可以使用Bergot等(《色谱杂志》(J.Chromatog.)(1992)559：35-42)所述的合成方法。可以按照公知方法制备含有其它类型的修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸(例如，参见Goodchild(1990)《生物轭合物化学》(Bioconjugate Chem.)2：165-187；Agrawal等(1988)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))85：7079-7083；Uhlmann等(1990)《化学综述》(Chem.Rev.)90：534-583；和Agrawal等(1992)《生物技术趋势》(TrendsBiotechnol.)10：152-158)。
如上所述，本发明提供了包括至少一种本发明化合物、优选至少一种本发明化合物与药物上可接受载体的药物组合物。具体的实施方案包括治疗量的脂质载体。
如上所述，本发明化合物适用于各种治疗应用，特别是适合于治疗哺乳动物细胞、特别是人体细胞的病毒感染。本发明的化合物尤其用于控制或预防人体细胞内的肝炎病毒、特别是控制或预防乙型肝炎病毒感染。
本发明的化合物还用于治疗耐药性病毒株，包括耐受现行疗法的乙型肝炎病毒株。
本发明的优选治疗方法包括对细胞给予治疗量的含有一种或多种本发明化合物的药物组合物而由此抑制乃至治疗乙型肝炎病毒感染。在类似的方面中，本发明的化合物可以用于治疗乙型肝炎病毒感染，包括对受感染细胞或动物、特别是诸如人这样的灵长类给予治疗量的含有至少一种本发明化合物的药物组合物。
本发明的化合物可以用于与其它药物、诸如逆录酶抑制剂、诸如双脱氧核苷、例如3TC联用的疗法。
另外优选对受治疗者给予本发明的多种不同的化合物作为协调治疗方案的组成部分。特别优选对患者给予化合物1、2和3中的至少两种或多种、优选全部三种作为协调治疗方案的组成部分。
可以通过给予相同或不同药物制剂或依次给予不同活性剂完成这类联合疗法、即本发明的化合物与不同活性剂、诸如3Tc或与本发明另一种化合物的联合疗法。然而，一般优选基本上同时对患者给予含有所述化合物的单位药物组合物形式的多种不同活性剂。
可以通过各种适宜途经给予本发明的化合物，包括口服、局部(包括经皮、口含或舌下)、鼻部和非肠道(包括腹膜内、皮下、静脉内、真皮内或肌内注射)，一般优选口服或非肠道给药。还可以理解优选的给药方法和剂量可以随例如接受者情况和年龄的不同而改变。
本发明的化合物可以用于与其它有药物活性的药物、诸如另一种抗病毒药或抗癌药的联合疗法中。另外，尽管可以单独给予本发明的一种或多种化合物，但是它们也可以作为与常用赋形剂、即药物上可接受的有机或无机载体物质的混合物的药物组合物的组成部分存在，所述的药物上可接受的有机或无机载体物质适合于非肠道、口服或其它所需给药且不与活性化合物发生有害反应且对其接受者而言无害。合适的药物上可接受的载体包括、但不限于水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、petroethral脂肪酸酯类、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。可以给药物制剂灭菌且如果需要使药物制剂与例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等这样不与活性化合物发生有害反应的助剂混合。
就非肠道应用而言，特别合适的是溶液，优选油溶液或水溶液；以及混悬液、乳剂或植入物，包括栓剂。安瓿是常用的单位剂型。
就肠道应用而言，特别合适的是含有滑石和/或碳水化合物载体粘合剂等的片剂、糖锭或胶囊，所述的载体优选是乳糖和/或玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。可以使用糖浆剂、酏剂等，其中使用增甜的载体。可以配制缓释组合物，包括其中例如通过微囊包封、多层包衣等用不同可降解的包衣材料保护活性成分。
还可以将本发明的治疗化合物混入脂质体。可以按照公知的脂质体制备步骤、例如超声和挤压混入。脂质体的适宜常用制备方法还公开在下列文献中：例如A.D.Bangham等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，23：238-252(1965)；F.Olson等，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，557：9-23(1979)；F.Szoka等，《国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.)，75：4194-4198(1978)；S.Kim等，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，728：339-348(1983)；和Mayer等，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，858：161-168(1986)。
可以理解的是指定疗法中所用的活性化合物的实际优选用量根据所用具体化合物、所配制的特定组合物、应用方式、给药的具体部位等的不同而改变。本领域技术人员易于使用常规剂量测定试验确定指定给药方案的最佳给药比例。
将本文所述的全部文献引入本文作为参考。
通过下列实施例进一步解释本发明。提供这些实施例有助于理解本发明而不对本发明起限定作用。
实施例1：本发明化合物的合成
使用标准氨基亚磷酸酯化学法(Beaucage(1993)《分子生物学方法》(Meth.Mol.Biol.)20：33-61)在ABI 394 DNA/RNA合成仪(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、Pharmacia Gene AssemblerPlus(Pharmacia，Uppsala，Sweden)或Gene Assembler Special(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上应用制造商的标准方案和常用方法合成本发明的化合物。
实施例2：生物测试
用本发明的化合物处理(体外)受到感染的HBV-感染的人细胞(2.2.15细胞)。对包括化合物1、2和3在内的上述化合物观察到所述细胞产生的胞外(病毒体)HBV DNA水平显著受到抑制(大于对照组2-倍)。
参照本发明的优选实施方案具体描述了本发明。然而，应理解本领域技术人员在考虑到本说明书时可以在下面的权利要求中所述的本发明的实质和范围内进行修改和改进。