3’-单磷酸化寡核苷酸技术领域
本发明涉及修饰的寡核苷酸，尤指3’-OH单磷酸化修饰的寡核苷酸，以增加
稳定性，降低毒付作用，该单磷酸化修饰的寡核苷酸可用作治疗的药物。
技术背景
寡核苷酸包括反义寡核苷酸、抗基因寡核苷酸(亦称三螺旋形成寡核苷酸)
等可用于抑制基因的表达，是近年来发展起来的一种新的治疗方法(Wagner，
RW，Nature，1994，372，333-335；Crook，ST，Annu.Rev.Pharmacol.
Toxical.，1992，32，329-376；Helene，C，Eur.J.Cancer，1994，30A，
1721-1726；Crooke，ST，Antisense Nucleic acids Drug Dev.，1996，6，
141-147)。其作用机制包括阻遏病毒基因的复制、转录和翻译，也可阻遏人体
内有害基因的转录和翻译，以及通过体内的RNase H酶的作用使靶RNA降解，是
一类专一性高、毒副作用小的治疗药物。目前已进入临床试验的反义寡核苷酸
有抗HIV的GEM91(II期)，抗炎症的ISIS2302(II期)，抗癌症的ISIS3521
(I期)及ISIS5132(I期)，抗艾滋病患者的CMV视网膜炎的ISIS2922(III
期)，治疗慢性髓性白血病的LR-3001(I期)等(Genetic Engineering
News，1996，16，29-34)。
由于寡核苷酸片段进入人体后，易受到人体内酶系统的作用而被降解，即
进入人体的寡核苷酸未达到靶器官、靶细胞就被降解因而不能达到预期的治疗
效果(Hoke，G.D.，et al.Nucleic Acids Res.，1991，19，5734-5748)。因
此，提高寡核苷酸的稳定性，尤其是提高其抗酶解能力显得非常关键，这样，
不仅可以提高疗效、减少药品用量，亦可进一步降低治疗成本和减少副作用。
为了提高寡核苷酸的稳定性，延长其在人体内的半衰期，人们采用不同
的方法对寡核苷酸进行了一系列的化学修饰和结构改造，已有许多文献报道，
例如：采用硫磷酸二酯键代替磷酸二酯键的方法(WO 9115500，1991)；将两
个寡核苷酸片段以3′与3′相连，或5′与5′相连(EP 464638，1992)等。目前，
反义寡核苷酸大多采用化学修饰方法来增加其稳定性，在诸多化学修饰中，硫
磷酸修饰被认为是最理想的一种。但是，它必竟是非天然的，进入细胞后异
质性大。而且其合成价格也比非修饰的寡核苷酸高，其化学稳定性也不如天然
的磷酸二酯键。硫磷酸修饰寡核苷酸还具有非专一性作用，它能与细胞内的一
些重要的蛋白质相结合，影响细胞的信号传递及其他生物功能；它具有很强的
免疫原性，可以刺激机体的免疫系统；另一方面，采用硫磷酸二酯键替代物，
在体内的代谢降解产物亦可能对人体产生毒副作用(Stein CA，Trends in
Biotechnology，1996，14，147-149)。为了寻找更好的修饰方法，本发明进
行了进一步的研究。
发明目的
本发明的目的是提供一种3′-单磷酸化寡核苷酸，以增加寡核苷酸稳定性，
降低毒副作用。
发明内容
本发明提供一种3′-单磷酸化寡核苷酸，其结构式可用
5′d(NNN......NNN)p3′或oligo(dN)-3′P表示，式中N＝A、G、C、T；p3′或
3′P＝3′为单磷酸基团。它是采用3′-磷酸固相柱(3′-phosphate CPG Glen
Research公司产品，全称2-[2-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)乙磺酰]乙
基-丁二酰长链烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4’-Dimethoxy trityloxy)
ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG))，在ABI
391EP DNA合成仪上合成，经浓氨水脱去保护基得3′-单磷酸化寡核苷酸。
为了显示本发明3′-单磷酸化寡核苷酸对酶降解的稳定性，用蛇毒磷酸二酯
酶代表体内的3′→5′核酸外切酶，用DNase I代表体内的内切核酸酶在体外比
较了不修饰的寡核苷酸、3′-单磷酸化寡核苷酸、硫磷酸修饰的寡核苷酸及3′
部分硫磷酸修饰的寡核苷酸对3′→5′核酸外切酶和内切核酸酶的稳定性，进一
步还比较了它们在血清中及细胞内的稳定性。实验证明经3′-磷酸化修饰的寡
核苷酸片段具有抗蛇毒磷酸二酯酶的性质，在血清中和细胞内的稳定性明显高
于3′不修饰的或3′部分硫磷酸修饰的寡核苷酸，略高于硫磷酸修饰的寡核苷
酸。而且，3′-磷酸化修饰不影响寡核苷酸进入细胞的速度，这一点优于硫磷
酸修饰的寡核苷酸。上述结果说明血清和细胞中主要存在的是3′→5′外切核酸
酶，而该酶作用时需提供具有3′-OH的底物，当寡核苷酸3′OH基团被磷酸化后，
就不能作为3′→5′外切核酸酶的底物，因而能抗3′→5′外切核酸酶作用，延长
了在人体血清中的滞留时间，能够更有效地被运输到靶细胞中。在细胞中由于
3′-单磷酸化寡核苷酸稳定性高，因此能更有效地与目的基因的互补序列相结
合。
3′-单磷酸化寡核苷酸只有被磷酸单酯酶切去3′磷酸后才能被3′→5′外切
核酸酶降解。3′-单磷酸化寡核苷酸在血清中和细胞内稳定性高，表明在血清
中和细胞内磷酸单酯酶活性不高。
此外，由于DNA复制时需要3′为OH的引物，3′-单磷酸化寡核苷酸引物一旦
与DNA结合还能阻遏病毒DNA的复制或RNA反转录。目前在使用的反义寡核苷酸
中大多是硫磷酸修饰的、3′为OH的寡核苷酸，它没有阻遏病毒DNA复制或RNA反
转录的作用。3′-单磷酸化寡核苷酸对正常的碱基配对没有影响，因此能够保
证这种经修饰的寡核苷酸正确地、专一地与靶DNA或RNA配对。概括而言，依据
病毒或肿瘤基因等有害基因DNA或RNA特定顺序而设计的、3′-单磷酸化寡核苷
酸片段能够专一地与靶DNA或RNA结合，阻遏病毒DNA的复制、转录和翻译，也
可阻遏人体内有害基因的转录和翻译，也可利用体内RNaseH使被3′-单磷酸化
寡核苷酸结合的靶RNA降解。因此，由于上述作用机制和优越的性能，3′-单磷
酸化寡核苷酸有更多的生物功能。另外针对乙型肝炎病毒设计的一种反义寡核
苷酸的研究证明，3′-单磷酸化修饰比不修饰的寡核苷酸对于乙型肝炎病毒基
因表达的抑制作用强一倍以上。
本发明的优点：本发明中提供的3′-单磷酸化寡核苷酸具有比硫磷酸修饰
的寡核苷酸还要高的稳定性和容易被细胞摄取的优点。而且，由于磷酸基团为
天然核酸中固有成份，因此采用磷酸基团作为修饰基团并没有引入非天然的修
饰成份，其代谢降解产物无任何毒副作用，因此，与其它化学修饰方法相比使
用时更为安全，其综合性能优于目前应用最广的硫磷酸取代的寡核苷酸。3′-
单磷酸化寡核苷酸能专一地与靶DNA或RNA结合，阻遏病毒DNA的复制、转录和
翻译。因此，3′-单磷酸化寡核苷酸有望成为一种临床上有效的药物。
附图说明
图1四种寡核苷酸片段对蛇毒磷酸二酯酶降解的抗性
图2四种寡核苷酸片段对DNase I降解的抗性
图3四种寡核苷酸片段在40％人血清中的稳定性
图4四种寡核苷酸片段在HeLa细胞内的稳定性
图5四种寡核苷酸片段在HeLa细胞浆中的浓度
图6四种寡核苷酸片段在HeLa细胞核内的浓度
最佳实施例
实施例1 3′-单磷酸化寡核苷酸片段和其它实验用寡核苷酸片段的合成
利用ABI公司的391EP DNA合成仪合成下列四种寡核苷酸片段，其DNA顺序
结构及3′端修饰情况如下：
①3′OH：5′d(ATAGGGGCAT)3′
②3′P：5′d(ATAGGGGCAT)p 3′
③SP：5′d(A.T.A.G.G.G.G.C.A.G.A)3′
④3SP：5′d(TTGAGGATGGAGCCCTGGA.C.C.A)3′
·代表硫磷酸二酯键位置
第①条寡核苷酸的3′为OH基团；
第②条寡核苷酸的3′为单磷酸基团；
第③条寡核苷酸为全部核苷酸之间通过硫磷酸二酯键相连，3′为OH基团；
第④条寡核苷酸的3′端有三个硫磷酸二酯键，其余为磷酸二酯键，3′为OH基团。
第②条3′-单磷酸化寡核苷酸使用0.2μmole 3′磷酸固相柱(3′-
phosphate CPG Glen Research公司产品，全称2-[2-(4，4’-二甲基三
苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰长链烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4’-
Dimethoxy trityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain
alkylamino-CPG))，在ABI 391EP DNA合成仪上用0.2μmole合成顺序合成。
第①条3′为OH的寡核苷酸用0.2μmole dT固相柱(Glen Research产品)，
用相同的合成顺序合成。第③条、第④条用dA固相柱(Glen Research产
品)，用相同的合成顺序合成，只有在硫磷酸修饰的位置用硫化试剂替代氧化
试剂(参见Iyer，RT，et al.J.Org.Chem.1990，55，4693-4699)，其余均
相同。合成结束后，取出挂有寡核苷酸的载体，用浓氨水55℃处理15小时脱
去保护基，吸出溶液，真空浓缩至干，重新溶解于200μl 50％甲酰胺中，经
7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，紫外灯下割带，重蒸水浸泡，透
析去盐，浓缩后-20℃保存。测A260，计算产物量。
实施例2 对蛇毒磷酸二酯酶降解的稳定性
实施例1中所得到的四种寡核苷酸片段(3′OH，3′P，SP，3SP)分别用T4
多聚核苷酸激酶(T4 PNK)在其5′端标记上32P，取50pmol寡核苷酸片段，加50
μCi[γ-32p]-ATP，2单位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍缓冲液，加双蒸
水至10μl，37℃保温1小时，同实施例1一样，用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法
纯化标记的寡核苷酸，分别加入未标记的寡核苷酸至终浓度为5μmol/L，加蛇
毒磷酸二酯酶至100μU/ml，缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L
MgCl2，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，pH 8.0，37℃保温，在0、0.5、1、1.5、
2、4、8、12、24小时各取5μl，加等体积上样缓冲液(98％甲酰胺，10
mmol/L EDTA，0.025％二甲苯蓝FF，0.025％溴酚蓝)混匀，用7mol/L尿素-
20％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果显示，3′-单磷酸化寡核苷酸、全硫磷酸修
饰的寡核苷酸以及3′端三个硫磷酸二酯键的寡核苷酸对于蛇毒磷酸二酯酶的抗
性作用相近，它们对蛇毒磷酸二酯酶的抗性都比3′-OH的寡核苷酸要高许多，
表现出显著差异。见图1。
实施例3 对DNase I(内切核酸酶)降解的稳定性
同实施例2一样制得32P标记的四种寡核苷酸，在其中分别加入未标记的寡
核苷酸至终浓度为5μmol/L，加DNase I至100U/ml，缓冲液为10mmol/L
Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，0.1％BSA，pH 8.0，37℃保温，在0、0.5、1、
1.5、2、4、8、12、24小时各取5μl，加等体积上样缓冲液混匀，用7mol/L
尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果显示，3′-单磷酸化寡核苷酸对于
DNase I降解的稳定性略低于全硫磷酸修饰的寡核苷酸，但明显高于3′-OH寡核
苷酸和3′端三个硫磷酸二酯键的寡核苷酸，而其中3′端三个硫磷酸二酯键的寡
核苷酸对DNase I的作用特别敏感。见图2。
实施例4 在40％人血清体系中的稳定性
同实施例2一样制得32P标记的四种寡核苷酸，在其中分别加入未标记的寡
核苷酸至终浓度为5μmol/L，加人血清至终浓度为40％，37℃保温，在0、
0.5、1、1.5、2、4、8、12，24小时各取5μl，加等体积上样缓冲液混匀，用
7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果显示，3′-单磷酸化寡核苷
酸稳定性最好，反应24小时后还留有近一半的量，明显高于其他几种结构的寡
核苷酸，，3′-OH的寡核苷酸在此体系中稳定性最差。见图3。
实施例5 在细胞内的稳定性
在35mm培养皿中接种2×103HeLa细胞，加1.5ml细胞培养液(DMEM含
10％小牛血清)，于37℃5％CO2生长到培养孔面积的40％-60％，吸去培养
液，分别加入200μl 5′P-32标记的3′OH、3′P、SP或3SP转染混合液(含
4μl Lipofectin，3′OH、3′P、SP或3SP 0.2μmol/L)，5小时后，吸干转染
混合液，加入2ml含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃5％CO2继续培养，并
于5，12，24，36，48，72小时消化细胞，离心沉淀细胞，用酸性溶液洗去细
胞表面的寡核苷酸(参见Gao WY，et al.J.Biol.Chem.1990，265，
20172-20178；Lappalainen K.et al.Biochim.Biophys.Acta，1994，
1196，201-208)，加1ml TES液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L
EDTA，1％SDS)，于室温10分钟裂解细胞，用有机混合溶剂(苯酚∶氯仿∶异
戊醇＝50∶48∶2)抽提两次，加2倍无水乙醇沉淀DNA，加10μl蒸馏水溶解，
7mol/L尿素-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影，然后，做黑度扫描，并
以寡核苷酸转染5小时的时候，HeLa细胞中全长寡核苷酸的含量为100％，比较
在不同培养时间后细胞中所保留的全长寡核苷酸的百分比。结果显示：在HeLa
细胞中，3′P的稳定性要明显高于3SP及3′OH，SP稳定性也较高，见图4。
实施例6 在细胞内的分布
在12孔细胞培养板中接种5×104HeLa细胞，加0.5ml细胞培养液(DMEM
含10％小牛血清)，于37℃，5％CO2生长到培养孔面积的40％-60％，吸去
培养液，分别加入100μl 5′-32P标记的3′OH、3′P、SP或3SP转染混合液(含4
μl Lipofectin，3′OH、3′P、SP或3SP 0.2μmol/L)，每个样品重复三份，5
小时后加入400μl含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃5％CO2继续培养，并
于0，2，4，8，18，24，30小时吸去培养液，用0.5mlPBS洗一次，再用100μl
胰酶消化6分钟，然后加100μl含10％小牛血清的DMEM，细胞计数三次，取平
均值，5000转/分离心1分钟沉淀细胞，同实施例5用酸性溶液洗去细胞表面的
寡核苷酸然后分离细胞浆及细胞核(参见Weintraub H，et al.Cell 1983，
32，1191-1203)，胞浆及胞核分别测定同位素放射性强度。计算3′OH，3′P，SP
和3SP于不同时间在胞浆及胞核中的含量，三次的重复数据取平均值。3′OH，
3′P，SP和3SP四种寡核苷酸在细胞浆和细胞核内的浓度见图5和图6。在实验
的条件下，3′OH，和3′P进细胞比SP和3SP快，SP进细胞较慢，3SP最慢。除3SP
较长以外，3′OH与3′P长度相同，SP多一个核苷酸。从实验结果可见，3′-单
磷酸化修饰并不影响其进细胞速度。