一种家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法 本发明涉及一种家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法，更具体地说，涉及一种利用转基因植物作为生物反应器来制造口蹄疫病毒基因工程苗的方法及其产品。
在现有技术中，用植物作表达载体来表达外源蛋白已有不少报道，病毒蛋白、细菌毒素和抗体分子己在转基因植物中成功表达，且绝大部分表达蛋白具有完全的抗原功能或标识功能。重要的是，它们同免疫基因一样可激发特异性的免疫应答，在开发疫苗过程中，用植物表达免疫基因，必将是常规疫苗的经济替代品。口蹄疫病毒(FMDV)极大影响肉和奶的产量和质量，导致巨大的经济损失。用灭活苗广泛免疫易感动物已非常成功，是防制此病的有效工具，但疫苗厂家具有散毒的危险，而且免疫效果较好的弱毒苗具有“返祖”现象，给口蹄疫的根除带来极大的困难。因此，要彻底地控制和消灭此病，必须开发一种安全、高效的替代品。研究表明：FMDV的结构蛋白VP1携有典型的抗原决定簇，可诱发中和抗体的产生。用VPI蛋白或其部分氨基酸合成肽免疫动物，均可保护试验或本体动物抵抗强毒攻击。
本发明的目的在于提供一种用VP1的完整基因或部分片段在不同的表达载体中制造一种能有效预防家畜口蹄疫病毒的、安全高效地疫苗，同时提供其相应的制造方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：用口蹄疫病毒接种小白鼠，从发病死亡的小白鼠组织中提取口蹄疫病毒RNA，扩增出VP1的完整基因： ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTG
该序列是在包括植物的根、茎、叶、果实和种子在内的植物反应器中形成的立体结构之总和，其分子量为30-150KDa。
本发明是一种家畜口蹄疫病毒重组基因工程苗，包括编码口蹄疫病毒毒株VP1蛋白的完整基因，将转基因植物种子作种用，播种待植物成熟后用作家畜饲料即可获得口蹄疫病毒的免疫功能。
本发明的家畜口蹄疫病毒基因工程苗的制造方法，包括基因重组、重组蛋白的制备，其具体的制造过程为：(1)将VP1全基因插入质粒载体：采用分子生物学的方法提抽病毒的核酸RNA，用含启动子和终止子，其上游引物为5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反转录引物为5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’的特定引物扩增出VP1的完整基因，片段两端为BamHⅠ酶切位点，用BamHⅠ酶切表达载体pROK1和目的片段，T4连接酶连接重组，构建重组质粒pROK1.VP1，然后(2)将上述重组质粒转入植物中进行表达，获得转基因植物的种子：将重组质粒pROK1.VP1转化根癌农杆菌C58C1菌株细胞系，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子，再(3)取种子种入土壤，获得可作为疫苗的植物根、茎、叶、果实或种子。
在实施本发明的过程中，工程苗的制造包括用特异的引物获得目的基因、基因重组、重组质粒转化植物和利用重组蛋白免疫家畜。构建的载体为二元质粒pROK1，病毒的RNA从接种FMDV的小鼠组织中抽提，用反转录一聚合酶链式反应扩增VP1基因，在引物中导入了BamHⅠ酶切位点和起始子及终止子(上游引物：5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反转录引物：5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，整个VP1的完整基因克隆至pROK1的BalnHⅠ位点(pROK1.VP1)，将重组的质粒转入植物中进行表达，待转基因植物种子成熟后作种用，再将此种子播种，成熟后作家畜饲料即可。将重组的质粒转入植物中表达，用作转基因的植物可以是玉米、会薹属植物(如拟南介)、大豆、高梁、油菜或水稻等。转基因植物经过培育后，其根、茎、叶、果实或种子中含外源VP1蛋白，并可经ELISA法和Western blot法检测确证。
实施过程中，将植物种子种于小杯中，在4℃暗室中放置48小时使其同步发芽。后转至生长室20℃曝光16小时，用双蒸水，偶而用矿物质水浇灌。重组质粒pROK1.VP1转化根癌农杆菌细胞系(Agrobacterium tumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培养液中(含卡那霉素50mg/ml)培养离心收集细胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培养液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-苄氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重悬。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物浸入含根癌农杆菌细胞(Agrobacterium)的重悬液中，真空5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放于生长室中直至成熟。在培养皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(吗啉乙烷磺酸：morpholine ethane sulfonicacid)和50mg/ml卡那霉素的琼脂凝胶(8g/lPH5.7)中筛选转基因种子。两周后，将转基因植物移至土壤中培养成熟即可。转基因植物的根、茎、叶、果实和种子中含有外源基因VP1，经PCR检测(上游引物：5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反转录引物：5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，所含外源蛋白VP1可经ELISA和Western blot检测确证具有免疫原性。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点：按本发明方法制造的疫苗，由于其融合蛋白含有免疫原性蛋白，可有效抵抗口蹄疫病毒的感染，因而具有极高的免疫能力，对家畜的保护力强。在0、21、35天免疫小鼠，用104ID50O型口蹄疫病毒攻毒，免疫小鼠的保护率为100％，而对照鼠则全部死亡。
以下通过具体的实施例对本发明进行更加详细的描述：
实施例
用小鼠繁殖口蹄疫病毒，采用分子生物学方法抽提病毒的核酸RNA，用含启动子和终止子的特定引物(上游引物：5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反转录引物：5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)，扩增出VP1的完整基因，片段两端为BamHⅠ酶切位点，用BamHⅠ酶切表达载体pROK1和目的片段，T4连接酶连接重组，构成重组质粒pROK1.VP1，将重组质粒转化根癌农杆菌细胞系(C58C1株)，于LB培养液(含卡那霉素50mg/m)培养，离心收集细胞，于200mlMS培养液(2.35g/l浓度)(含5％蔗糖和10g/l6-BA)中重悬。
将植物的种子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小时使其同步发芽，其后转移至生长室20℃曝光16小时，用双蒸水，偶尔用矿物质水浇灌。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中，真空度5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放入生长室中直至成熟。在培养皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml浓度卡那霉素的琼脂胶凝(8g/lPH5.7)中筛选转基因种子，两周后，将转基因植物移至土壤中培养成熟即可。
转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含外源蛋白VP1，经PCR检测存在，用特异性引物(上游引物：5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反转录引物：5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’)对抽提物进行扩增，可特异性地扩增出145bp的目的片段。
转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含外源蛋白VP1，经ELISA和Western blot检测其存在，阳性对照为pROK转化的植物抽提物中混有人工合成VP1的P135-160多肽(10ug/ml)，阴性对照为pROK转化的植物抽提物。结果显示转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中含有外源蛋白VP1，能够与抗P135-160多肽血清发生明显的反应。在Western blot检测中，用抗VP1的血清可检测到特异性的条带，分子量为30-150KDa得出与ELISA相同的检测结果。
用ELISA和Western blot检测转基因植物免疫小鼠后血清中抗FMDV抗体的存在，ELISA检测结果显示：小鼠血清中含有抗FNDV抗体，具有特异性的抗P135-160多肽和FMDV的特性；Western blot检测结果显示：用PROK.VP1转染的转基因植物的抽提物免疫小鼠获得的混合血清，同抗P135-160多肽血清一样具有特异性的反应带。在0、21、35天用转基因植物的抽提物免疫小鼠，第45天用含104ID50O型口蹄疫病毒攻毒，免疫小鼠的保护率为100％，而对照鼠则全部死亡。